基于腸道菌群和代謝組學探討“腦腸共治”電針對孤獨癥大鼠的作用機制

〔摘要〕 目的 觀察“腦腸共治”電針對孤獨癥大鼠的社交能力及對腸道菌群、代謝產(chǎn)物的影響。方法 采用丙戊酸鈉腹腔注射法制備孤獨癥大鼠模型，選取造模成功的大鼠隨機分為4組，每組10只，分別為模型組、基礎(chǔ)電針組、針藥結(jié)合組、腦腸共治電針組。另外選取10只正常大鼠為對照組?；A(chǔ)電針組予以電針百會、神庭、心俞；針藥結(jié)合組在基礎(chǔ)電針組的基礎(chǔ)上再予以益生菌灌胃治療；腦腸共治電針組在基礎(chǔ)電針組基礎(chǔ)上再結(jié)合電針足三里、曲池。均每日1次，連續(xù)4周。采用三箱社交實驗評估行為學改變，16S rDNA測序分析腸道菌群分布情況，超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析血漿中的差異代謝組分，并結(jié)合Spearman相關(guān)性分析進行腸道菌群與代謝組學之間的關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果 與對照組相比，模型組大鼠社交能力和社交新穎性均減弱（P＜0.01）；與模型組相比，基礎(chǔ)電針組、針藥結(jié)合組、腦腸共治電針組的社交新穎性增強（P＜0.01）；與基礎(chǔ)電針組比較，針藥結(jié)合組、腦腸共治電針組社交新穎性增強（P＜0.01）。腸道菌群研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組的彎曲菌門相對豐度上調(diào)，嗜黏蛋白阿克曼菌相對豐度下調(diào)；而與模型組相比，針藥結(jié)合組、腦腸共治電針組的彎曲菌門相對豐度下調(diào)，嗜黏蛋白阿克曼菌相對豐度上調(diào)。LEfSe分析發(fā)現(xiàn)，腦腸共治電針組與模型組共篩選出嗜黏蛋白阿克曼菌等21個關(guān)鍵菌，如與模型組比較，腦腸共治電針組可上調(diào)嗜黏蛋白阿克曼菌、卷曲乳桿菌，同時下調(diào)梭狀芽胞桿菌等。代謝組學分析共篩選出12個差異代謝物，通路分析顯示，其主要與氨基酸代謝、磷酸鹽代謝、嘌呤代謝、花生四烯酸代謝等通路相關(guān)。結(jié)論 電針百會、神庭、心俞、足三里、曲池對孤獨癥大鼠社交能力有明顯的改善作用，調(diào)控腸道菌群如嗜黏蛋白阿克曼菌等菌屬豐度，同時影響代謝物水平，且部分代謝物的改變與腸道菌群存在復雜相關(guān)性，可能與氨基酸代謝、磷酸鹽代謝、嘌呤代謝、花生四烯酸代謝等通路相關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 孤獨癥譜系障礙；電針；腦腸同治；腸道菌群；代謝組學；社交能力

〔中圖分類號〕R245" " " " "〔文獻標志碼〕A" " " " " 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.05.016

Mechanism of action of electroacupuncture targeting both brain and intestine on autistic rats based on intestinal flora and metabolomics

XIE Ying1，2， LIU Huihui2， CAO Zhengliang1， XIA Yun1， ZHU qinquan1， HU Guoheng1，2*

1. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China;

2. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To observe the effects of electroacupuncture （EA） targeting both brain and intestine on the social ability， intestinal flora， and metabolites in autistic rats. Methods The autistic rat model was prepared by intraperitoneal injection of sodium valproate， the successfully modeled rats were randomized into model group， basic EA group， acupuncture-medicine group， and EA targeting both brain and intestine group， with 10 rats in each group. In addition， 10 normal rats were selected as control group. The basic EA group was given EA at \"Baihui\" （GV20）， \"Shenting\" （GV24）， and \"Xinshu\" （BL15） acupoints， the acupuncture-medicine group was treated with probiotics by gavage on the basis of the basic EA group， and the EA targeting both brain and intestine group was treated with EA at \"Zusanli\" （ST36） and \"Quchi\" （LI11） acupoints on the basis of the basic EA group， once a day， for 4 consecutive weeks. The behavioral changes were assessed by three-chamber social experiments， the intestinal flora distribution was analyzed by 16SrDNA sequencing， the differential metabolic components in plasma were analyzed by ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry， and the correlation between intestinal flora and metabolomics was analyzed by Spearman. Results Compared with the control group， the social ability and social novelty of rats in the model group were weakened （Plt;0.01）. Compared with the model group， the social novelty of the basic EA group， acupuncture-medicine group， and EA targeting both brain and intestine group was enhanced （Plt;0.01）. Compared with the basic EA group， the social novelty of acupuncture-medicine group and the EA targeting both brain and intestine group was enhanced （Plt;0.01）. The study of intestinal flora found that compared with the control group， the relative abundance of Campylobacter in the model group was up-regulated， while the relative abundance of Akkermansia muciniphila was down-regulated. Compared with the model group， the relative abundance of Campylobacter in the acupuncture-medicine group and the EA targeting both brain and intestine group was down-regulated， while the relative abundance of Akkermansia muciniphila was up-regulated. LEfSe analysis found that a total of 21 key bacteria were screened out in the EA targeting both brain and intestine group and the model group， such as compared with the model group， the EA targeting both brain and intestine group" can up regulated Akkermansia muciniphila and Lactobacillus crispatus and down -regulated Clostridium. A total of 12 differential metabolites were screened out by metabolomics analysis， and pathway analysis showed that they were mainly related to amino acid metabolism， phosphate metabolism， purine metabolism， arachidonic acid metabolism， and other pathways. Conclusion EA at \"Baihui\" （GV20）， \"Shenting\" （GV24）， \"Xinshu\" （BL15）， \"Zusanli\" （ST36）， and \"Quchi\" （LI11） acupoints can significantly improve the social ability of autistic rats， regulate the abundance of intestinal flora such as Akkermansia muciniphila， and affect the level of metabolites at the same time. Moreover， there is a complex correlation between the changes of some metabolites and intestinal flora， which may be related to amino acid metabolism， phosphate metabolism， purine metabolism， arachidonic acid metabolism， and other pathways.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 autism spectrum disorder; electroacupuncture; treatment targeting both brain and intestine; intestinal flora; metabolomics; social ability

兒童孤獨癥譜系障礙（autism spectrum disorder，ASD）屬神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病，據(jù)美國疾病控制與預(yù)防中心報道，孤獨癥的患病率呈顯著上升趨勢[1]。SUN等[2]于2019年發(fā)表的一篇多中心研究資料顯示，我國兒童孤獨癥的患病率約1%，男女發(fā)病率之比約為4∶1。臨床暫無有效治療ASD兒童核心癥狀的藥物，主要通過康復訓練改善癥狀[3]。研究表明，中醫(yī)治療可明顯改善ASD的癥狀[4]。目前，該病的發(fā)病機制并不明確，考慮與遺傳、環(huán)境、腸-腦軸等有關(guān)。近年來，腸-腦軸的研究模式已在ASD研究中逐步獲得國內(nèi)外學者的認可，腸道菌群亦成為探討ASD的研究熱點，腸道微生物組可以影響血腦屏障（blood-brain barrier， BBB）通透性，改變血清代謝譜，可能與ASD病理生理學相關(guān)[5]。本實驗擬從菌-腸-腦軸的角度出發(fā)，為電針治療ASD提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1" 實驗動物

成年健康SD雄鼠和雌鼠各10只，SPF級，體質(zhì)量為350～400 g，于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司采購。實驗動物質(zhì)量合格證號：SYXK（湘）2019-0004。大鼠飼養(yǎng)在湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心，實驗在SPF級動物實驗房進行，光照和黑暗交替12 h，20～25 ℃室溫，45%～65%相對濕度，控食并自由飲水。實驗按照湖南中醫(yī)藥大學有關(guān)實驗動物管理和使用規(guī)定嚴格執(zhí)行。本實驗經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準（倫理審查編號：ZYFY20210813-24）。

1.2" 主要試劑及儀器

丙戊酸鈉（批號：1069-66-5，美國Sigma公司）；雙歧三聯(lián)活菌膠囊（批號：國藥準字S10950032，上海上藥信誼藥廠有限公司）。華佗牌脈沖電子針療儀、華佗牌毫針0.35 mm×13 mm（型號：SDZ-Ⅲ、V278013，蘇州醫(yī)療用品公司）；自動跟蹤成像系統(tǒng)（型號：856-300W，北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責任公司）；三室社交箱60 cm×40 cm×20 cm（型號：XR-XJ117，上海欣軟信息科技有限公司）；高分辨質(zhì)譜儀、超高效液相儀器（型號：LTQ Orbitrap XL ETD、U3000，美國Thermo Fisher Scientific公司）；高通量測序儀（型號：NextSep 500，美國Illumina公司）。

1.3" 動物造模及分組

參考文獻[6]的建模方法，將雌雄鼠按1∶1比例在晚上7：00分別放置在同一鼠籠中過夜，于第2天早晨7：00將雄鼠取出，并觀察雌鼠是否有陰栓，若雌鼠存在陰栓脫落，則將當天計為妊娠（embryonic day，E）第1天（E1），所有孕鼠均單獨飼養(yǎng)在干凈的鼠籠內(nèi)。在大鼠懷孕11 d時給予濃度為100 mg/mL的丙戊酸鈉600 mg/kg腹腔注射。后代大鼠出生的第28天選取雄性大鼠，通過三箱社交實驗對行為學進行評估來確定造模是否成功[6]。選取造模成功的40只大鼠隨機分成4組，分別為模型組、基礎(chǔ)電針組、針藥結(jié)合組、腦腸共治電針組，每組10只。將另一組健康孕鼠腹腔注射同等劑量生理鹽水，隨機選取所產(chǎn)后代大鼠10只記錄為對照組。

1.4" 干預(yù)方法

按照《實驗針灸學》提供的定位方法并類比人體腧穴骨度。基礎(chǔ)電針組選取大鼠百會、神庭、心俞作為基礎(chǔ)穴針刺，百會穴位于頂骨正中，神庭穴位于前正中線上，在額頂骨縫交界線前方處，心俞穴位于第5胸椎下兩旁肋間。局部消毒后針刺單側(cè)穴位，百會斜刺2 mm、神庭斜刺3 mm、心俞直刺2 mm，三穴直下2 mm處作為附點，穴位連接電針儀負極，相應(yīng)附點接通正極，波形選擇疏密波（疏波20 Hz，密波100 Hz），強度以穴位皮膚輕輕抖動為度，留針時間30 min。腦腸共治電針組予生理鹽水2 mL/d灌胃，每日1次，選取基礎(chǔ)穴結(jié)合足三里、曲池，足三里位于大鼠后肢膝關(guān)節(jié)外下方腓骨小頭下約5 mm處，曲池位于橈骨近端關(guān)節(jié)外側(cè)，足三里直刺5 mm、曲池直刺3 mm，兩穴直下2 mm處作為附點，穴位連接電針儀負極，相應(yīng)附點接通正極，波形選擇疏密波（疏波20 Hz，密波100 Hz），強度以穴位皮膚輕輕抖動為度。針藥結(jié)合組電針同基礎(chǔ)電針組，結(jié)合予益生菌（每克含雙岐桿菌不低于1.0×108 CFU）灌胃[7]。對照組、模型組除不針刺，其余同基礎(chǔ)電針組。各組干預(yù)均每日1次，連續(xù)4周。

1.5" 觀察指標及方法

1.5.1" 三箱社交實驗評估ASD大鼠行為學" 分別于造模后及治療完成后進行兩次三箱社交實驗評估社交行為：第1次為造模后模型組通過與對照組的社交行為比較，驗證造模是否成功；第2次為治療后比較各組的社交行為。三箱社交實驗主要通過觀察實驗動物在3個箱子之間的活動，了解其對陌生動物的社交興趣和社交能力。三箱社交行為箱，中間被兩塊醫(yī)用有機擋板均分為3個獨立小室，一個圓形的社交籠子（直徑12 cm）被放置在房間的左下角（社交房間）。此外，社交籠周圍的面積（直徑16 cm）設(shè)置為一個社會區(qū)域。在右房間與左房間的對稱位置均放置一個空籠子。實驗分為3個階段：（1）適應(yīng)階段：提前1天將所有待測大鼠背朝實驗者放入行為箱的中央室，使其在社交箱中自由活動10 min，充分熟悉環(huán)境；（2）社交能力檢測：10 min后在右房間的社交籠中放入一只同種不同胎相似年齡段的大鼠（陌生鼠1），另一個保持空置，將測試鼠重新放至中央室使其自由活動10 min并記錄；（3）社交新穎性檢測：10 min后，75%乙醇消毒，再次將陌生鼠1放在右側(cè)社交籠中，對側(cè)社交籠放入另一只同種不同胎相似年齡段的大鼠（陌生鼠2），再次將測試鼠放入使其自由活動10 min并記錄。

1.5.2" 代謝組學檢測" 各組大鼠分別于基線期、治療完成當天采血。血標本保持4 ℃存放，在15～30 min內(nèi)離心15 min（離心力為2000×g），置于－80 ℃冰箱中保存，用于血漿超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜非靶標代謝組學。入組后進行統(tǒng)一的樣本代謝物混合制備成質(zhì)控樣本，再進行一級、二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。通過ProteoWizard軟件將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為mzXML格式，再使用R程序包進行峰識別、峰提取、峰對齊和積分等處理，然后通過與BiotreeDB 2.1自建二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫匹配對物質(zhì)進行注釋。

1.5.3" 腸道微生物檢測" 用專用無菌糞便采集盒搜集大鼠糞便，采集約5 g糞便。樣本采集后，按照50 μL/g樣本的比例添加濃度為100 mg/mL疊氮化鈉，混勻后分裝樣本至200 mg/管，然后立即用液氮速凍處理30 s以上，保存至-80 ℃冰箱，足量干冰低溫運送。使用CTAB從不同的樣本中提取16S rDNA，采用美國Illumina公司測序儀和配套試劑進行測序。同時，所有樣本進行生物信息數(shù)據(jù)分析，并確定菌群特征。

1.6" 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理并完成統(tǒng)計學分析。計量資料均符合正態(tài)分布，用“ｘ±s”表示，運用獨立樣本t檢驗進行兩組間數(shù)據(jù)比較，運用單因素方差分析進行多組間比較，運用Tukey HSD法進行組間兩兩比較。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1" ASD模型建立指標結(jié)果

2.1.1" 各組大鼠的三箱社交實驗結(jié)果比較

（1）干預(yù)后各組大鼠社交能力比較

模型組大鼠空籠接觸時間長于對照組大鼠（P＜0.01），且模型組大鼠與陌生鼠接觸時間短于對照組大鼠（P＜0.01），故模型組社交能力出現(xiàn)障礙，模型建立成功。詳見表1、圖1。

（2）干預(yù)后各組大鼠社交新穎性比較

治療后，與對照組比較，模型組接觸陌生鼠2時間減少（P＜0.01）；與模型組比較，基礎(chǔ)電針組、針藥結(jié)合組、腦腸共治電針組與陌生鼠2接觸時間增加（P＜0.05）；針藥結(jié)合組、腦腸共治電針組接觸陌生鼠2時間多于基礎(chǔ)電針組（P＜0.05）。說明基礎(chǔ)電針組、針藥結(jié)合組、腦腸共治電針組均改善社交新穎性，其中針藥結(jié)合組、腦腸共治電針組更明顯。詳見表2、圖2。

2.2" 各組大鼠腸道菌群比較

2.2.1" 測序結(jié)果的豐富度與α多樣性分析" 本次研究基于擴增序列變體（amplicon sequence variant， ASV）聚類分析結(jié)果，共獲得9 571個ASV，Chao指數(shù)曲線趨于平坦時，說明測序數(shù)據(jù)量足夠大。本次實驗曲線趨向平坦時，說明測序數(shù)據(jù)量漸近合理，樣品均具有較好的豐富度。詳見圖3。

2.2.2" β多樣性分析" 與模型組比較，基礎(chǔ)電針組、針藥結(jié)合組、腦腸共治組與陌生鼠2接觸時間增加。NMDS圖形中點與點之間的距離表示樣品之間差異程度。通常會給出該模型的stress值，用于判斷該圖形是否能準確反映數(shù)據(jù)排序的真實分布。通常認為stresslt;0.2時NMDS有一定的解釋意義，故5組NMDS分析有顯著差異。詳見圖4。

2.2.3" 各組大鼠腸道菌群在門、屬水平上的差異" 通過對各組大鼠門水平上豐度比較發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組Campylobacterota（彎曲菌門）相對豐度上調(diào)，Verrucomicrobiota（疣微菌門）、Actinobacteriota（放線菌門）相對豐度下調(diào)；與模型組比較，針藥結(jié)合組、腦腸共治電針組Proteobacteria（變形菌門）、Desulfobacterota（脫硫菌門）相對豐度上調(diào)，campylobacterota（彎曲菌門）相對豐度下調(diào)（圖5A）。在屬水平上，與對照組比較，模型組Muribaculaceae（木桿菌）相對豐度上調(diào)，Akkermansia（嗜黏蛋白阿克曼菌）相對豐度下調(diào)；與模型組比較，針藥結(jié)合組Akkermansia（嗜黏蛋白阿克曼菌）相對豐度上調(diào)，Muribaculaceae（木桿菌）相對豐度下調(diào)；與模型組比較，腦腸共治電針組Ligilactobacillus（乳桿菌）、Akkermansia（嗜黏蛋白阿克曼菌）相對豐度上調(diào)，Clostridiales（梭狀芽孢桿菌）相對豐度下調(diào)（見圖5B）。

2.2.4" LEfSe差異分析" 采用LEfSe法分析模型組與腦腸共治電針組，尋找關(guān)鍵菌。一共篩選出21種組間具有顯著差異的物種（P＜0.05且ＬＤＡ分數(shù)＞3分），結(jié)果顯示，模型組中考拉桿菌屬（g__Phascolarctobacterium）、考拉桿菌種（s__Phascolarctobacterium-faecium）、梭狀芽胞桿菌科（f__Clostridiaceae）等相對豐度較高，腦腸共治電針組中另枝菌屬（g__Alistipes）、多雷亞菌屬（g__Dorea）、紫單胞菌屬（g__Odoribacter）、紫單胞菌屬種（s__Odoribacter）、阿克曼菌科（f__Akkermansiaceae）、阿克曼菌種（s__Akkermansia）、阿克曼菌屬（g__Akkermansia）、疣微菌目（o__Verrucomicrobiales）、卷曲乳桿菌種（s__Lactobacillus-crispatus）相對豐度較高。詳見圖6。

2.3" 各組大鼠代謝組學分析

2.3.1" 樣本間的主成分分析" 基于QE的代謝組學數(shù)據(jù)具有高維（檢測出代謝物種類多）、小樣本（檢測樣本量偏少）的特性，所以采用正交偏最小二乘法-判別分析（partial least-squares discrimination analysis， OPLS-DA）的統(tǒng)計方法對結(jié)果進行分析。以下主要展示POS模式下，對照組、模型組與腦腸共治電針組3組間樣本數(shù)據(jù)得分散點圖。詳見圖7。

2.3.2" 腦腸共治電針組與模型組血清差異性代謝物

基于OPLS-DA對正、負離子模式下檢測到的所有代謝物進行差異分析，繪制正、負離子模式下的代謝物火山圖（見圖8），觀察差異代謝的分布。以同時滿足VIP＞1.5、P＜0.05作為條件篩選差異代謝物，并結(jié)合HMDB、KEGG等數(shù)據(jù)庫，最終共篩選12個差異代謝物，其中正離子模式下4個、負離子模式下8個。詳見表3。

2.3.3" 差異代謝物的相關(guān)通路分析" 基于KEGG分析差異代謝物，篩選潛在的關(guān)鍵代謝通路，結(jié)果提示其可能與調(diào)節(jié)氨基酸代謝、磷酸鹽代謝、嘌呤代謝、花生四烯酸代謝等通路有關(guān)。詳見圖9。

2.4" 腸道菌群與代謝組學關(guān)聯(lián)分析

對模型組和腦腸共治電針組腸道菌群與代謝組學進行Spearman相關(guān)性分析：卷曲乳桿菌與血漿中代謝物甘氨酸呈正相關(guān)，與β-氨基異丁酸酯呈顯著負相關(guān)；另枝菌屬與琥珀酸半醛脫氫酶呈正相關(guān)，與谷氨酰胺呈顯著負相關(guān)；梭狀芽孢桿菌與磷酸膽堿呈顯著負相關(guān)；嗜黏蛋白阿克曼菌與磷酸膽堿呈顯著正相關(guān)，與谷氨酰胺呈顯著負相關(guān)。詳見圖10。

3 討論

ASD的病因尚未完全明確，部分孤獨癥患者存在染色體異常和基因變異，同時，部分患者在胃腸道癥狀方面也表現(xiàn)異常[8]。中醫(yī)學認為，本病病因多與先天胎稟不足或后天失養(yǎng)導致髓海不充有關(guān)[9]。因此，髓海不足會出現(xiàn)“五遲”“童昏”“視無情”癥狀。脾為后天之本，孤獨癥患兒先天稟賦不足，脾胃功能相對薄弱，而飲食偏嗜，可加劇脾胃虛弱，脾為氣血生化之源，小兒脾常不足，后天失養(yǎng)，不能化氣血上奉于心，致心血不足，心神失養(yǎng)，出現(xiàn)行為異常[10]。孤獨癥患者中較高比例的胃腸道異常癥狀與患者腸道微生物紊亂關(guān)系密切，因此推論，微生物、腸道與大腦構(gòu)成的菌-腸-腦軸可能在孤獨癥的發(fā)病過程中起重要作用。本文選取經(jīng)典的腹腔注射丙戊酸鈉造模，丙戊酸鈉嚙齒類動物模型除了與ASD患者在行為學和解剖學上具有一定相似性外，還表現(xiàn)出與ASD患者相似的腸道菌群失調(diào)，這使得丙戊酸鈉嚙齒類動物模型成為研究ASD的最佳模型之一[11]。

行為學檢測為評估ASD模型的主要手段之一[12]。本研究對各組大鼠進行了行為學檢測。腹腔注射VPA造模后，通過三箱社交實驗發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠社交能力明顯減弱，判定造模成功。干預(yù)后，比較各組大鼠的社交能力和新穎性，與模型組比較，基礎(chǔ)電針組、針藥結(jié)合組、腦腸共治電針組與陌生鼠接觸時間較長，且3組與陌生鼠2接觸時間大于與陌生鼠1接觸時間，大鼠社交新穎性得到改善，其中針藥結(jié)合組、腦腸共治電針組社交新穎性優(yōu)于基礎(chǔ)電針組，證明針藥結(jié)合組及腦腸共治電針組可更有效改善ASD大鼠癥狀。

為了探討腦腸共治電針治療ASD的作用機制，本研究采用16S rDNA觀察其對ASD大鼠腸道菌群的影響。結(jié)果顯示，與模型組相比，腦腸共治電針組可上調(diào)嗜黏蛋白阿克曼菌相對豐度，嗜黏蛋白阿克曼菌是一種腸道中的黏蛋白降解細菌，孤獨癥兒童嗜黏蛋白阿克曼菌相對豐度低。增加嗜黏蛋白阿克曼菌豐度可以作用于腸道上皮細胞和腸道黏膜中存在的相關(guān)受體，減輕炎癥反應(yīng)，增強上皮細胞的屏障功能[13]。此外，與模型組相比，腦腸共治電針組可顯著降低梭狀芽孢桿菌屬相對豐度，有學者發(fā)現(xiàn)，腸道梭狀芽孢桿菌與丙酸產(chǎn)生有關(guān)，服用丙酸或其前體產(chǎn)品的孤獨癥患者表現(xiàn)出更深刻的孤獨癥行為和胃腸道癥狀[14]。以上提示，電針可能通過降低梭狀芽孢桿菌的豐度來減少如丙酸等的水平。值得注意的是，LEfSe分析顯示腦腸共治電針組可顯著提高大鼠腸道卷曲乳桿菌相對豐度。有學者發(fā)現(xiàn)，卷曲乳桿菌與ASD相關(guān)指標如炎癥程度相關(guān)蛋白負相關(guān)[15]。也有研究發(fā)現(xiàn)，卷曲乳桿菌可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群來調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)分泌水平[16]。以上結(jié)果提示，腦腸共治電針組可能通過上調(diào)嗜黏蛋白阿克曼菌、卷曲乳桿菌等益生菌發(fā)揮作用，同時通過下調(diào)梭狀芽胞桿菌等有害細菌相對豐度來改善腸道菌群。

結(jié)合代謝組學進一步分析發(fā)現(xiàn)，腦腸共治電針對ASD大鼠體內(nèi)代謝物的影響。代謝組學結(jié)果提示，腦腸共治電針組可上調(diào)甘氨酸、鞘氨醇-1-磷酸、琥珀酸半醛脫氫酶、次黃嘌呤、磷酸膽堿、纈氨酸，下調(diào)精氨酸、β-氨基異丁酸酯、谷氨酰胺等差異代謝物含量。有研究表明，甘氨酸在突觸可塑性和學習記憶中起重要作用，甘氨酸信號傳導的改變與社會和認知障礙有關(guān)[17]。鞘氨醇-1-磷酸是磷脂代謝過程中產(chǎn)生的脂質(zhì)介質(zhì)之一。作為調(diào)節(jié)細胞生長的第二信使，S1P參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理生理過程，與ASD的行為損害有關(guān)[18]。琥珀酸半醛脫氫酶缺乏癥影響γ-氨基丁酸的分解代謝及興奮性和抑制性神經(jīng)傳遞失衡有關(guān)，琥珀酸半醛脫氫酶不足可能與孤獨癥刻板行為相關(guān)[19]。有研究表明，ASD患兒次黃嘌呤水平較低，影響黃嘌呤、鳥嘌呤代謝，從而導致神經(jīng)系統(tǒng)功能異常[20]。磷酸膽堿能通過絲裂原活化蛋白激酶信號通路，對學習和記憶障礙起保護作用[21]。纈氨酸等在ASD大鼠的腦皮質(zhì)中顯著降低[22]。二十碳五烯酸屬脂肪酸，其補充劑對孤獨癥癥狀早產(chǎn)兒的人際關(guān)系適應(yīng)行為有很大的益處[23]。精氨酸通過一氧化氮/N-甲基-D-天冬氨酸路徑，在MS誘導的小鼠孤獨癥樣行為中發(fā)揮重要作用[24]。β-氨基異丁酸酯是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，可代謝形成丙酸，與行為問題相關(guān)[25]。谷氨酰胺是一種重要的代謝燃料，經(jīng)脫氨反應(yīng)轉(zhuǎn)化為谷氨酸。研究發(fā)現(xiàn)，孤獨癥患者杏仁核海馬區(qū)域中谷氨酸/谷氨酰胺的濃度顯著升高[26]。以上報道結(jié)合本研究篩選的差異代謝產(chǎn)物結(jié)果，提示腦腸共治電針治療ASD可能通過調(diào)控多個代謝物共同發(fā)揮作用。同時，對上述差異代謝物進行KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)與調(diào)控氨基酸代謝、磷酸鹽代謝、花生四烯酸代謝、嘌呤代謝等通路有關(guān)，這為后期深入開展腦腸共治電針治療ASD作用機制提供了研究基礎(chǔ)。

本研究對腸道菌群與代謝組學進行了關(guān)聯(lián)分析，以進一步探討腸道菌群與代謝產(chǎn)物是否有依存關(guān)系，發(fā)現(xiàn)某些血漿代謝產(chǎn)物與那些組間存在顯著性差異的腸道菌群存在著很強的關(guān)聯(lián)性，這些代謝產(chǎn)物可能是腸道菌群作用于ASD的重要物質(zhì)。結(jié)果提示，給予腦腸共治電針治療后差異菌如卷曲乳桿菌與血漿中代謝物β-氨基異丁酸酯呈顯著負相關(guān)，與甘氨酸呈正相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，在一些ASD個體中觀察到，卷曲乳桿菌是來自乳酸桿菌的微生物，其在腸上皮屏障的維持中發(fā)揮重要作用[27]。另枝菌屬與琥珀酸半醛脫氫酶呈正相關(guān)，與谷氨酰胺呈顯著負相關(guān)。有研究表明，另枝菌屬的植入能改善VAP誘導的孤獨癥小鼠的行為，涉及5-羥色胺能突觸和谷氨酸能突觸通路的信號傳導，這些與行為改變有關(guān)[28]。本次研究發(fā)現(xiàn)，梭狀芽孢桿菌與磷酸膽堿呈顯著負相關(guān)，當梭狀芽孢桿菌數(shù)量增加時，梭狀芽孢桿菌會在腸道內(nèi)生成丙酸，兒童孤獨癥與此有直接關(guān)系。與此同時，關(guān)聯(lián)分析還顯示嗜黏蛋白阿克曼菌與谷氨酰胺呈顯著負相關(guān)，與磷酸膽堿呈顯著正相關(guān)。嗜黏蛋白阿克曼菌被認為與腸道免疫穩(wěn)態(tài)有關(guān)，且與孤獨癥行為表現(xiàn)直接相關(guān)[29]。最后，基于KEGG分析差異代謝物，篩選潛在的關(guān)鍵代謝通路，表明與氨基酸代謝、磷酸鹽代謝、嘌呤代謝等通路相關(guān)。通過分析，發(fā)現(xiàn)一個腸道菌群可以與多個代謝物相關(guān)，提示腸道菌群與代謝物之間存在復雜關(guān)系。

本研究采用丙戊酸鈉腹腔注射法制備孤獨癥大鼠模型，造模成功后的大鼠隨機分為模型組、基礎(chǔ)電針組、針藥結(jié)合組、腦腸共治電針組?；A(chǔ)電針組中的調(diào)腦神穴位，已有研究表明，其治療ASD的療效肯定[30]。腦腸共治電針是在此基礎(chǔ)上加用足三里、曲池，此兩穴位為手足陽明經(jīng)合穴，兩者同用，可通腑調(diào)氣，取同氣相求之意。且二穴均可主治神志病[31]。而益生菌作為目前臨床基于“腦-腸軸”治療ASD的較常用西藥[32]，將其作為陽性對照，以進一步驗證腦腸共治電針的特色與優(yōu)劣。各組大鼠行為學檢測結(jié)果提示，與模型組比較，基礎(chǔ)電針組、針藥結(jié)合組、腦腸共治電針組對孤獨癥大鼠社交能力均有改善作用，但針藥結(jié)合組、腦腸共治電針組更為顯著。腸道菌群研究分析發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組的腸道菌群彎曲菌門相對豐度上調(diào)，嗜黏蛋白阿克曼菌相對豐度下調(diào)；而針藥結(jié)合組、腦腸共治電針組的彎曲菌門相對豐度下調(diào)，嗜黏蛋白阿克曼菌相對豐度上調(diào)，提示針藥結(jié)合組和腦腸共治電針組均可調(diào)節(jié)腸道菌群趨向于對照組。為了進一步探討腦腸共治電針對ASD大鼠的腸道菌群及代謝通路的具體影響，進行腦腸共治電針組與模型組的比較，利用LEfSe比較分析，發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵菌共21個。其中與模型組比較，腦腸共治電針組可上調(diào)嗜黏蛋白阿克曼菌、卷曲乳桿菌等益生菌，同時下調(diào)梭狀芽胞桿菌等有害細菌相對豐度來改善腸道菌群。結(jié)合代謝組學進一步分析，腦腸共治電針組與模型組的代謝物（VIP＞1.5、P＜0.05），最終共篩選12個差異代謝物，將其腸道菌群與代謝組學進行Spearman相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)某些血漿代謝產(chǎn)物與兩組間存在顯著性差異的腸道菌群存在著很強的關(guān)聯(lián)性，提示這些代謝產(chǎn)物可能是腸道菌群作用于ASD的重要物質(zhì)。最后基于KEGG分析差異代謝物，篩選潛在的關(guān)鍵代謝通路，表明其與氨基酸代謝、磷酸鹽代謝、嘌呤代謝、花生四烯酸代謝等通路相關(guān)。

綜上所述，ASD是兒童最常見的嚴重的神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病之一，目前臨床無針對性治療藥物[33]。因此，探索可能有益的治療方法對ASD患兒預(yù)后具有重要意義。既往研究表明，腸道微生物與ASD的關(guān)系密切[34]。百會、神庭、心俞聰腦調(diào)神，而足三里、曲池治腸調(diào)神，腦腸共治能明顯改善孤獨癥大鼠社交能力[35]。通過行為學檢測、腸道菌群及代謝組學聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，本研究中選用電針百會、神庭、心俞、足三里、曲池，調(diào)控ASD大鼠腸道菌群嗜黏蛋白阿克曼菌、卷曲乳桿菌、梭狀芽孢桿菌等菌屬豐度，同時可以影響代謝物水平，且部分代謝物的改變與腸道菌群存在復雜相關(guān)性，與氨基酸代謝、磷酸鹽代謝、嘌呤代謝、花生四烯酸代謝等途徑相關(guān)。本研究可為腦腸共治電針干預(yù)ASD的作用提供實驗依據(jù)，同時可為進一步臨床應(yīng)用提供參考，但其具體機制尚需進一步研究，在今后可進行信號通路的深入研究。

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（本文編輯" 匡靜之）

〔收稿日期〕2023-12-01

〔基金項目〕湖南省中醫(yī)藥科研計劃重點項目（A2023036）；湖南省衛(wèi)生健康委員會科研課題（202206010043）；湖南省衛(wèi)生健康委員會科研計劃項目（D202306048765）；湖南省中醫(yī)藥科研課題（B2023121）。

〔通信作者〕*胡國恒，男，博士，教授，主任醫(yī)師，博士研究生導師，E-mail：hugh9198@163.com。