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    氣相色譜法快速分析人唾液中7種短鏈脂肪酸

    2016-12-08 00:09:44趙曉亞王躍飛楊帆江振作王琰楊龍
    分析化學 2016年7期
    關鍵詞:腸道菌群氣相色譜唾液

    趙曉亞+王躍飛+楊帆+江振作+王琰+楊龍+潘贊紅

    摘要 建立了氣相色譜法(GC)同時檢測人唾液中7種短鏈脂肪酸(Short-chain fatty acids, SCFAs)含量的方法。唾液樣品與乙醇溶液按體積比1∶1混合(含0.5%(V/V)濃HCl) 渦旋混合,離心后取上清液進行GC分析。采用DB-FFAP毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)進行分離; 氫火焰離子化檢測器(FID)進行檢測,內標法定量。實驗結果表明,唾液中共檢測到7種SCFAs(乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、己酸),7種SCFAs與內標物2-乙基丁酸的色譜峰峰面積比值與其濃度均呈現(xiàn)良好的線性關系(R2≥0.999),檢出限(LOD,S/N=3)和定量限(LOQ,S/N=10)分別為0.060~0.198 μg/mL和0.180~0.594 μg/mL,平均加樣回收率為94.8%~109.7%(RSD≤4.3%)。本方法簡單、快速、準確,可用于測定人的唾液中短鏈脂肪酸的含量。

    關鍵詞 氣相色譜; 唾液; 短鏈脂肪酸; 腸道菌群

    2015-12-05收稿; 2016-03-27接受

    本文系重大新藥創(chuàng)制科技重大專項項目(No.2015ZX09J15102-004-004)資助

    E-mail: wangyuefei_2006@hotmail.com; jeny_pan@163.com

    1 引 言

    短鏈脂肪酸(Short-chain fatty acids,SCFAs)是由益生菌,主要是腸道厭氧益生菌發(fā)酵膳食纖維和部分氨基酸和蛋白質的終產(chǎn)物[1,2],主要包括乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸和己酸等。短鏈脂肪酸不僅能為機體細胞提供能量[3],同時具有抑制致病菌[4,5]、抑制腸道上皮細胞和骨髓細胞的炎癥反應[6]等作用,并可以調節(jié)機體代謝平衡,降低炎癥性腸病、肥胖和II型糖尿病等疾病的發(fā)生率[7]。

    腸腔內產(chǎn)生的短鏈脂肪酸,一部分在腸道中被利用,另一部分進入血液循環(huán),通過細胞膜和粘膜的滲透作用進入唾液[8],或經(jīng)血液循環(huán)運輸至肺部,并隨呼吸作用到達口腔, 進入唾液[9]。唾液成分包括少量電解質、蛋白質、激素、DNA、RNA以及其它小分子物質。與血液和尿液等體液相比,唾液分析具有取樣簡單、適應性好、臨床檢驗快速、簡便等特點[10],且基于唾液和血液物質的相關性[9,11],臨床上可用于多種疾病的診斷[12]。唾液中含有與疾病相關的生物標記物[13],包括蛋白質和多肽及組織壞死、炎癥、細胞粘附、結締組織破壞和骨重塑的標記物[14]。同時研究者也開始關注唾液樣品中的揮發(fā)性成分并試圖尋找與疾病相關的化學成分。Mueller等[15]采用GC-TOF-MS法對吸煙和非吸煙人群的唾液進行對比分析,發(fā)現(xiàn)13種代謝產(chǎn)物含量有顯著差異。Sánchez等[16]采用GC-MS方法對健康人和不同類型癌癥患者的唾液進行分析,揭示了二甲基二硫醚和2-乙基己醇等可能是疾病相關的生物標記物。但是對唾液中揮發(fā)性有機酸的研究鮮有報道。Chen等[17]應用離子色譜法測定了唾液中甲酸、乙酸、丙酸和乳酸的含量,但樣品處理方法過程較繁瑣。本課題組在前期工作中,應用頂空氣相色譜-串聯(lián)質譜法鑒定唾液和血液中8種短鏈脂肪酸,包括乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、異己酸、己酸,初步推測唾液-血液中短鏈脂肪酸具有一定相關性[9]。

    本研究建立了氣相色譜-氫火焰離子化檢測器法測定人唾液中7種短鏈脂肪酸(乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸和己酸)的定量分析方法,并成功用于41例健康志愿者唾液樣品的分析。本方法簡單、快速、準確,為尋找唾液中與疾病相關的揮發(fā)性生物標記物奠定了方法學基礎。

    2 實驗部分

    2.1 儀器與試劑

    Shimadzu GC-2010氣相色譜儀(日本Shimadzu公司); DB-FFAP毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm, 美國Agilent公司); Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司); SCIENTZ 25-12超聲儀(寧波新芝生物科技股份有限公司); TGL-16C高速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠); XS205電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)。

    乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、己酸、2-乙基丁酸對照品(純度≥99%,美國Sigma-Aldrich公司); 其它試劑均為國產(chǎn)分析純; 實驗用水為超純水。

    2.2 標準品溶液的配制

    準確稱取各短鏈脂肪酸對照品,用50%(V/V)乙醇溶解并定容,得到7種標準品的單儲備液,濃度分別為乙酸20.39 mg/mL、丙酸4.87 mg/mL、異丁酸0.532 mg/mL、丁酸0.657 mg/mL、異戊酸0.526 mg/mL、戊酸0.565 mg/mL、己酸0.562 mg/mL。此外, 以無水乙醇配制87.6 μg/mL 2-乙基丁酸(內標,IS)儲備液。

    分別取各標準品儲備液適量,加50 μL濃HCl,以50%乙醇(V/V)定容至10 mL,得到混合標準品溶液,濃度分別為: 乙酸2039 μg/mL、丙酸487.0 μg/mL、異丁酸26.60 μg/mL、丁酸65.70 μg/mL、異戊酸26.30 μg/mL、戊酸56.50 μg/mL、己酸56.20 μg/mL(含0.5%(V/V)濃HCl及4.38 μg/mL 2-乙基丁酸),并采用50%乙醇溶液(含0.5%(V/V)濃HCl及4.38 μg/mL 2-乙基丁酸)逐級稀釋,得到系列不同濃度的混合標準品溶液。

    2.3 唾液樣品的采集及供試品溶液的制備

    經(jīng)志愿者(24~40周歲)同意并簽署了知情同意書,于早餐1~2 h后(樣品采集前30 min以清水漱口)采集健康志愿者的唾液樣品,以14000 r/min離心10 min,取上清液, 80℃保存?zhèn)溆谩?

    取 80℃凍存的唾液樣品,靜置溶化后,取500 μL置于1.5 mL離心管中,加500 μL乙醇溶液(含1%(V/V)濃HCl及8.76 μg/mL 2-乙基丁酸),渦旋混勻,14000 r/min離心10 min,取上清液直接進行氣相色譜分析。

    2.4 氣相色譜條件[18]

    色譜柱: DB-FFAP彈性石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm); 色譜柱升溫程序: 初始溫度50℃保持1 min,以15℃/min升至120℃, 以5℃/min升至170℃, 以15℃/min升至240℃后保持3 min; 進樣口溫度: 250℃; 氫火焰離子化檢測器(FID)溫度: 250℃; 進樣體積: 5 μL,分流比50∶1; 載氣: 高純氮氣(純度>99.999%), 流速: 1.0 mL/min; 尾吹氣: 高純氮氣(純度>99.999%),流速: 30 mL/min; 氫氣流速: 47 mL/min; 空氣流速: 400 mL/min。

    3 結果與討論

    3.1 樣品處理條件的優(yōu)化

    短鏈脂肪酸為酸性化合物,在溶液中存在離子型和游離型兩種狀態(tài)[18],加入適量HCl酸化,使短鏈脂肪酸處于游離態(tài),有利于測定,合適的酸性條件可改善色譜分離度及峰形,因此在樣品處理過程中加入濃HCl酸化唾液樣品??疾炝送僖汗┰嚻啡芤褐袧釮Cl濃度(0.1%, 0.5%, 1.0%,V/V)、唾液樣品與稀釋液比例(1∶0.5, 1∶1, 1∶2, V/V)的影響。當唾液供試品溶液中濃HCl濃度為1.0%時,丁酸色譜峰拖尾嚴重,無法準確定量; 當濃HCl濃度為0.5%時,各短鏈脂肪酸的色譜峰形、分離度最優(yōu)。唾液樣品與稀釋液體積比為1∶0.5時,乙酸色譜峰拖尾嚴重; 唾液樣品與稀釋液體積比為1∶1時,各短鏈脂肪酸的色譜峰形、分離度最優(yōu)。綜合考慮,確定唾液樣品處理方法為唾液樣品與稀釋液(1% (V/V) 濃HCl-乙醇溶液)以體積比1∶1混合并渦旋混勻, 14000 r/min離心10 min,取上清液直接進行GC分析。

    3.2 方法學驗證

    將空白溶液(0.5%濃HCl-50%乙醇溶液)、唾液供試品溶液和混合標準品溶液按照2.4節(jié)氣相色譜條件分析,色譜圖如圖1所示??梢?,空白溶液和唾液中其它物質色譜峰均不干擾短鏈脂肪酸分析。

    將混合標準品溶液逐級稀釋成系列標準品溶液,以標準品濃度x(μg/mL)為橫坐標,以對照品與內標物的峰面積比值y為縱坐標,繪制標準曲線,7種短鏈脂肪酸在相應濃度范圍內線性良好,相關系數(shù)R2≥0.999,檢出限(S/N≥3)和定量限(S/N≥10)分別為0.060~0.198 μg/mL,0.180~0.594 μg/mL; 在方法學研究中,唾液中未檢測到戊酸和己酸,故以0.589 μg/mL戊酸和0.615 μg/mL己酸的混合標準品溶液(內標濃度為4.38 μg/mL)進行日內、日間精密度和穩(wěn)定性實驗,結果見表1。7種短鏈脂肪酸的日內精密度(相對標準偏差,RSD)和日間精密度RSD分別為0.7%~3.5%和1.9%~4.4%。唾液供試品溶液室溫條件下放置12 h內穩(wěn)定性良好,RSD為2.3%~3.6%。

    準確吸取適量標準品溶液至健康志愿者的唾液樣品中,按照2.3節(jié)方法制備供試品溶液,進行分析,7種短鏈脂肪酸的加樣回收率為94.8%~109.7%, RSD為1.7%~4.3%,結果見表2。

    3.3 健康志愿者的唾液樣品中短鏈脂肪酸分析

    在方法學驗證的基礎上,采用本方法測定了41例健康志愿者唾液樣品中7種短鏈脂肪酸的含量,結果為: 乙酸13.1~378 μg/mL; 丙酸1.62~101.6 μg/mL; 異丁酸0.647~6.03 μg/mL; 丁酸0.644~18.2 μg/mL; 異戊酸0.859~9.86 μg/mL; 部分唾液樣品中檢測到戊酸和己酸,且大部分樣品中戊酸和己酸含量在定量限以下。

    僅一例樣品中檢測到戊酸, 含量為0.359 μg/mL; 7種短鏈脂肪酸總量為15.4~507 μg/mL。由于7種短鏈脂肪酸的含量差異懸殊,因此繪制了41例健康志愿者唾液樣品中7種短鏈脂肪酸的含量分布箱圖(圖2A),更直觀地顯示出唾液樣品中7種短鏈脂肪酸含量均在一定范圍內波動,其原因可能是個體在飲食、腸道功能、腸道菌群種類及活力等方面的差異,導致產(chǎn)生的短鏈脂肪酸含量差異,最終影響了唾液中短鏈脂肪酸含量。

    以乙酸為例,41例健康志愿者唾液樣品中乙酸含量分布如圖2B所示,含量在20~150 μg/mL的樣品例數(shù)占78.0%,含量低于20 μg/mL的占4.9%,含量高于150 μg/mL的占17.1%。人體唾液蘊含大量生理信息,唾液中的成分來源途徑廣,如腮腺、牙齦齦溝液、舌下[8]和體液交換過程中的主動運輸或被動擴散[19],所以作為一個開放的環(huán)境,檢測唾液中的成分能反映身體的健康和疾病狀況[20]。唾液中的短鏈脂肪酸有利于保持口腔的偏酸性環(huán)境,有利于抑制有害菌的滋生[4],從而保持健康的口腔環(huán)境。測定唾液中的短鏈脂肪酸也有可能成為未來監(jiān)測人體健康狀況的一種簡捷的輔助性手段。

    如酸的比例分布圖表明: 唾液樣品中乙酸占短鏈脂肪酸的75.5%,丙酸占17.4%,丁酸占3.1%,三者占短鏈脂肪酸的96.0%,與文獻報道的人的糞便、血液中的結果[21]基本一致; 異丁酸、異戊酸和戊酸占短鏈脂肪酸的4.0%。原因可能是,在哺乳動物體內,腸腔內產(chǎn)生的乙酸,大部分經(jīng)血液運輸至外周,被外周組織利用; 另一部分乙酸和丙酸被運輸至肝臟,乙酸參與合成長鏈脂肪酸、谷氨酸等,丙酸進行糖異生作用[22]。丁酸則主要作為能量物質被腸道上皮細胞利用[23],而異丁酸、異戊酸和戊酸由腸道菌群發(fā)酵某些特定的多肽和氨基酸產(chǎn)生[2]。

    上述實驗結果表明, 本方法簡單、快速、準確,可用于人的唾液中短鏈脂肪酸的分析。

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    Abstract A gas chromatographic (GC) method was established for the simultaneous analysis of seven short-chain fatty acids (SCFAs) including acetic acid, propionic acid, isobutyric acid, butyric acid, isovaleric acid, valeric acid and hexanoic acid in human saliva. Salivary sample was diluted by ethanol solution by ratio of 1∶1 (V/V), with 0.5% (V/V) hydrochloric acid in sample solution, then vortexed and centrifuged. The supernatent was subjected to GC analysis. The chromatographic separation was performed on a DB-FFAP capillary column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) using flame ionization detector (FID). The quantification was achieved by internal standard method. The experimental results showed that an excellent correlation coefficient (R2≥0.999) was obtained for all the calibration curves of seven SCFAs. The limits of detection (LOD, S/N=3) and limits of quantitation (LOQ, S/N=10) were 0.060-0.198 μg/mL and 0.180-0.594 μg/mL, respectively. The average recoveries were 94.8%-109.7% with relative standard deviation (RSD)≤4.3% (n=6). The developed method is simple, rapid and accurate, and suitable for the simultaneous determination of seven SCFAs in human saliva.

    Keywords Gas chromatography; Saliva; Short-chain fatty acids; Gut microbiota

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