香蕉MaFLS1基因克隆、生物信息學(xué)分析及功能解析

肖偉軍 胡玉林 汪喬英 段雅婕 胡會(huì)剛

DOI：10.13925/j.cnki.gsxb.20230228

摘? ? 要：【目的】初步探討黃酮醇合成酶FLS基因在香蕉果實(shí)中生物學(xué)功能?！痉椒ā坎捎肦T-PCR和PCR法克隆香蕉MaFLS1基因，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。運(yùn)用qRT-PCR的方法研究其表達(dá)模式，同源重組構(gòu)建MaFLS1基因的過表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化Micro-Tom番茄，測(cè)定T1代果實(shí)中總黃酮含量?！窘Y(jié)果】香蕉MaFLS1基因開放閱讀框含有1080對(duì)堿基，編碼359個(gè)氨基酸，理論等電點(diǎn)為5.41，預(yù)測(cè)分子質(zhì)量為39 436.94 Da，是一種穩(wěn)定的親水酸性蛋白，屬于α-酮戊二酸依賴性雙加酶家族。通過分析香蕉MaFLS1的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)其不含信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，F(xiàn)LS在不同物種間具有高度的氨基酸序列保守性。MaFLS1基因在香蕉果實(shí)發(fā)育成熟后期高度表達(dá)，前期基本不表達(dá)。通過測(cè)定轉(zhuǎn)基因番茄中總黃酮的含量發(fā)現(xiàn)其總黃酮含量極顯著高于野生型果實(shí)?！窘Y(jié)論】MaFLS1在果實(shí)成熟后期高度表達(dá)，且能夠顯著增加果實(shí)中總黃酮的含量。

關(guān)鍵詞：香蕉；MaFLS1；生物信息學(xué)；功能分析

中圖分類號(hào)：S668.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980（2024）02-0229-12

Cloning， bioinformatics and functional analysis of MaFLS1 in banana

XIAO Weijun1， HU Yulin1， WANG Qiaoying1， 2， DUAN Yajie1， HU Huigang1*

（1South Subtropical Crops Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agriculture Sciences/Key Laboratory of Tropical Fruit Biology， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Key Laboratory of Hainan Province for Postharvest Physiology and Technology of Tropical Horticultural Products， Zhanjiang 524091， Guangdong， China; 2College of Horticulture & Forestry Sciences of Huazhong Agricultural Uninersity， Wuhan 430070， Hubei， China）

Abstract： 【Objective】 Banana is an important tropical fruit crop， and it contains abundant flavonoids. Flavonoids are the most important and widely involved in plant growth and development， which play an important role in plant stress resistance. Although the flavonol synthase gene has been studied in other plants， its function has not been reported in banana fruit. In this paper， the function of MaFLS1 gene in banana pulp was preliminarily identified by carrying out transgenic heterologous functional verification on micro Tom tomato. 【Methods】 The open reading frame of the MdFLS1 gene was cloned by reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR） and polymerase chain reaction （PCR）. The sequences were obtained and analyzed by various bioinformatics methods， i.e. TMHMM online software， SignalP， SOPMA， MEGA7.0 software and so on. The expression pattern of MaFLS1 was studied by qRT-PCR during banana fruit ripening. The over-expression vector of MaFLS1 gene was constructed by homologous recombination and transformed as heterologous gene into Solanum lycopersicum L. （micro-Tom） by bladed disc conversion method with recombinant agrobacterium transformants， and the phenotypes of T1 generation transgenic positive plants and wild-type plants were observed， such as plant height， leaf color， fruit size and fruit color， and the total flavonoids were detected by Spectrophotometer. 【Results】 We used the reverse transcribed Xiangfen 1 flesh cDNA as the template， primers were designed by Primer Premier 5.0， and the PCR amplification was performed. The amplification results showed that the size of the amplified band was consistent with the reference sequence. Sequence analysis showed that the length of open reading box of the MaFLS1 contained 1080 bp bases and encoded 359 amino acids， the theoretical PI was 5.41， and the molecular mass was 39 436.94 Da. The unstable coefficient of the MaFLS1 protein was 37.35， and the total average value of hydrophilicity was -0.178， which belonged to be a stable hydrophilic acidic protein. The position of the MaFLS1 protein in banana was predicted， which was localized in the cytoplasm by using subcellular localization website （https：//wolfpsort.hgc.jp/）. The results of TMHMM online software analysis indicated that the MaFLS1 protein had no transmembrane domain， and there was also no signal peptide by using SignalP software. SOPMA online software （http：//web. expasy. org/） was applied to predict the secondary structure of the MaFLS1 protein， and the results showed that the protein was mainly composed of α-helix （34.26%）， irregular curls （42.9%）， extended chains （16.71%） and β-corner （6.13%）. The prediction of the tertiary structure of this protein was carried out by SWISS-MODEL online software （http：//swissmodel.expasy.org/）. When the sequence of a protein was highly similar to a known structural protein sequence， the structure of the protein can be modeled. The conserved domain of MaFLS1 was predicted through the Protein Conservative Domain Prediction website （SMART）， and the results showed that the MaFLS1 protein contained two functional domains， one was the highly conserved N-terminal region of a protein with 2-oxoglutarate/Fe （Ⅱ） dependent dioxide， located in the 49th to 160th amino acid positions. In plants， Fe （Ⅱ） 2OG dioxygenase domain enzymes catalyze the formation of plant hormones such as ethylene， gibberellin， pigments and flavonoids. The other was an enzyme structure with a Fe²⁺and 2-ketoglutarate （2OG） dependent dioxygenase domain， located in the 206th-306th amino acids. The enzyme usually uses dioxin to catalyze the oxidation of organic substrate， mainly by using ferrous as the active site cofactor and 2OG as the co substrate， and decarboxylates to form succinate and CO₂. DNAMAN software analysis showed that the amino acid similarity was about 51% between MaFLS1 protein and other species， and it was showed that FLS genes had a highly conserved amino acid sequence between different species by using MEGA7.0 software， and it was showed the genetic relationship between MaFLS1 protein and MaFLS3 and MaFLS2 was relatively close， it may be because banana belongs to herbaceous plants， and its hereditary distance is far away from the other species. The result of real-time PCR indicated that the expression level of the MaFLS1 gene was high in the later stage of fruit ripening， but it was almost not expressed in the early stage， and the results showed that after 65 d after cutting off buds， the relative expression increased sharply， indicating that the gene was expressed in the later stage of fruit development， which may participate in the maturity process of banana fruits. By measuring the total flavonoid content in the transgenic tomato， it was found that the total flavonoid content in wild-type fruits was 0.46 mg·g^-1，which was significantly lower than the 0.58 mg·g^-1in transgenic fruits， indicating that the MaFLS1 gene can indeed increase the total flavonoid content in fruits， and it was found that the transgenic fruits were smaller and lighter in color than the wild-type fruits， which may be possibly due to increased synthesis of flavonol branches and reduced anthocyanin content. 【Conclusion】 By comparing the expression of the MaFLS1 gene in the process of fruit maturity， the results showed that the expression of the gene increased significantly in the later stage of banana fruit maturity. Simultaneously， the gene can significantly increase the total flavonoid content in the tomato fruit by determining the content of total flavonoid.

Key words： Banana; MaFLS1; Bioinformatics analysis; Functional analysis

香蕉（Musa nana Lour.）為芭蕉科芭蕉屬植物，是一種重要的熱帶水果，年產(chǎn)量占全球鮮果產(chǎn)量的16%以上，在熱帶地區(qū)具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。中國是世界上栽培香蕉的古老國家之一，種植面積約為35萬hm²，位居世界第三，每年消費(fèi)量達(dá)1300萬t，位居中國第四大鮮果^[1-3]。香蕉作為重要的經(jīng)濟(jì)作物，在海南、廣東、云南、廣西等地的脫貧攻堅(jiān)戰(zhàn)中發(fā)揮著重要作用。香蕉不僅含有豐富的礦物質(zhì)元素、膳食纖維等，而且含有豐富的類黃酮和多酚，而類黃酮和多酚具有抗氧化、抗衰老以及抵抗病毒等生物功能，其營養(yǎng)價(jià)值較高，被廣大消費(fèi)者所喜愛^[4]。

黃酮醇是類黃酮最主要的一類物質(zhì)，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中起著重要作用^[5-7]。在植物的側(cè)根形成過程中，槲皮素（一種黃酮醇）會(huì)影響根系中生長(zhǎng)素的運(yùn)輸和分布，從而影響側(cè)根的生成^[8-11]。此外，黃酮醇還能夠影響花粉的活力和萌發(fā)。Zhang等^[12]利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)（VIGS）沉默辣椒中的二氫黃酮醇還原酶（DFR）合成酶基因的表達(dá)，導(dǎo)致類黃酮含量降低，同時(shí)影響了花粉發(fā)育和花粉管伸長(zhǎng)。由于DFR和黃酮醇合成酶（FLS）共同競(jìng)爭(zhēng)底物二氫黃酮醇，當(dāng)FLS活性降低時(shí)會(huì)影響黃酮醇含量的降低，但花青素合成并不受影響，從而影響植物花色的形成^[13-16]。已有研究表明，黃酮醇在植物的生物和非生物脅迫中發(fā)揮著重要作用^{[15，17-24]}。擬南芥在強(qiáng)紫外照射下，擬南芥中的生長(zhǎng)素合成減少，但是槲皮素合成卻急劇升高，用來調(diào)控谷胱甘肽還原酶（GR）、谷胱甘肽過氧化物酶（GP）、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POX）等抗氧化酶的活性，清除自由基，從而減輕逆境對(duì)細(xì)胞DNA、RNA和蛋白質(zhì)等生物高分子的損傷^[6，25]。在高溫天氣下，植物通過槲皮素和ABA的互作來調(diào)節(jié)氣孔的關(guān)閉，減少水分的流失^[8]。此外，當(dāng)植物遭遇重金屬脅迫時(shí)，其體內(nèi)槲皮素的含量急劇增加，從而減輕重金屬對(duì)植物的傷害。

植物體內(nèi)黃酮醇的合成由多個(gè)基因協(xié)同參與，相互交叉影響^[26-27]。黃酮醇生物合成作為類黃酮代謝的一個(gè)重要分支，其合成途徑為4-香豆酰-CoA和丙二酰-CoA，在查耳酮合成酶（chalcone synthase，CHS）和查耳酮異構(gòu)酶（chalcone isomerase，CHI）的作用下生成柚皮素，然后在黃烷酮羥化酶，如黃烷酮3-羥化酶（F3H）的催化下生成二氫黃酮醇。二氫黃酮醇是DFR和FLS的共同底物，分別形成花青素和黃酮醇物質(zhì)。因此，F(xiàn)LS是黃酮醇合成的關(guān)鍵酶。FLS已經(jīng)在多種植物中被廣泛克隆和鑒定。該基因最早在紫羅蘭和矮牽?；ńM織中被發(fā)現(xiàn)，隨后在擬南芥、蘋果、杜鵑、芍藥、風(fēng)信子、楊梅等多種植物中被分離鑒定和克隆^{[13，14，28-36]}。黃酮醇的合成除了受到關(guān)鍵合成酶基因的調(diào)控外，同時(shí)還在轉(zhuǎn)錄水平上受MYB轉(zhuǎn)錄因子、bHLH轉(zhuǎn)錄因子和WD40蛋白的調(diào)控^{[5，15，17]}，這些轉(zhuǎn)錄因子能夠激活或抑制黃酮醇早期生物合成步驟中CHS、CHI、F3H、FLS等相關(guān)基因的表達(dá)，共同控制黃酮醇的生物合成?？傊?，植物體內(nèi)黃酮醇的合成受到多種基因和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，而且在不同的植物體內(nèi)具有普遍性，同時(shí)又有特殊性。

黃酮醇在香蕉果實(shí)中的合成代謝研究尚未見報(bào)道，而黃酮醇對(duì)香蕉的生長(zhǎng)發(fā)育以及抗逆上有著重要作用，因此對(duì)香蕉中的黃酮醇合成酶進(jìn)行克隆和功能研究對(duì)提高香蕉果實(shí)品質(zhì)和抗逆性有非常重要的理論基礎(chǔ)和應(yīng)用價(jià)值。筆者通過前期對(duì)香粉1號(hào)果實(shí)不同成熟時(shí)期進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)1個(gè)在果實(shí)成熟后期表達(dá)量顯著增加的黃酮醇合成酶MaFLS1，對(duì)其進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分析，并通過異源轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證其功能，為利用MaFLS1進(jìn)行香蕉果實(shí)品質(zhì)育種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

材料為中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所湛江院區(qū)試驗(yàn)基地種植的香粉1號(hào)果實(shí)。分別取抽薹開花斷蕾后25、45、65、85、88 d果肉，用水果刀切片后迅速放入液氮中冷卻，放至實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱中保存。

1.2 香粉1號(hào)果肉總RNA的提取與cDNA的合成

植物總RNA的提取使用北京華越洋生物有限公司的通用型植物快速RNA提取試劑盒，提取香粉1號(hào)25 d、45 d、65 d、85 d果肉中的總RNA，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的質(zhì)量，用NanoDrop2000微型紫外分光光度計(jì)（Thermo Scientific）測(cè)定RNA的濃度。用TaKaRa生物技術(shù)有限公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒[PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）]進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，存放于-20 ℃冰箱中備用。

1.3 MaFLS1基因引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增

從筆者團(tuán)隊(duì)前期的測(cè)序結(jié)果中篩選到了黃酮醇合成酶基因MaFLS1，在香蕉基因網(wǎng)站上（https：//banana-genome-hub.southgreen.fr/）查找參考序列。根據(jù)參考序列的編碼區(qū)（CDS序列）利用軟件Primer primer 5.0分別設(shè)計(jì)編碼區(qū)引物MaFLS1-F、MaFLS1-R（表1）。

以提取的香粉1號(hào)果肉組織總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。50 μL反應(yīng)體系如下：10× PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5 μL，2 mmol·L^-1dNTPs 5 μL，25 mmol·L^-1MgSO₄3 μL，引物（10 μmol·L^-1each） 2 μL，cDNA 5 μL，加ddH₂O至50 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min，98 ℃變性10 s，退火溫度為56 ℃ 30 s，68 ℃延伸1 min，反應(yīng)循環(huán)數(shù)為40個(gè)。

1.4 PCR產(chǎn)物回收、克隆及測(cè)序

將PCR后的產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后，在凝膠成像儀上確定目的條帶，并用試劑盒（MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver. 4.0，TaKaRa）回收純化目的片段，并將純化后的目的片段與pEASY-T1 Cloning Kit（TransGen）克隆載體連接，并轉(zhuǎn)化大腸DH5α，挑選單菌落進(jìn)行陽性鑒定，將陽性單菌落送至廣州艾基生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序后的序列與參考序列比對(duì)。

1.5 生物信息學(xué)分析

在NCBI網(wǎng)站上搜索其他物種FLS基因的氨基酸序列，并用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。用SMART在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)功能結(jié)構(gòu)域。在ExPASy（http：//web.expasy.org/compute_pi/）網(wǎng)站對(duì)MaFLS1基因編碼蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用在線網(wǎng)站https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/進(jìn)行基因的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。使用信號(hào)肽預(yù)測(cè)網(wǎng)站（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/）進(jìn)行信號(hào)肽的預(yù)測(cè)。在SOPMA在線網(wǎng)站（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）預(yù)測(cè)MaFLS1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)。蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)使用SWISS-MODEL在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)。

1.6 香粉1號(hào)果肉中MaFLS1基因表達(dá)分析

采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-qPCR方法分析香蕉果肉MaFLS1基因的表達(dá)情況，MaFLS1基因的熒光定量引物以及內(nèi)參基因引物見表1。PCR反應(yīng)在賽默飛公司下的ABI QuantStudio 6 Flex熒光定量?jī)x上進(jìn)行。反應(yīng)體系為：PowerUp? SYBR? Green Master Mix （2X） 10 μL，各1 μL的上下游引物，2 μL的cDNA模板，用ddH₂O補(bǔ)足到20 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，總共40個(gè)循環(huán)。用2^-??CT方法計(jì)算MaFLS1基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 目的基因與過表達(dá)載體質(zhì)粒同源重組

通過TaKaRa公司的In-Fusion引物在線設(shè)計(jì)網(wǎng)站（https：//takara.teselagen.com/#/Design-Page）設(shè)計(jì)引物（表1）。以已測(cè)序正確的陽性質(zhì)粒為模板，使用KOD-Plus-Neo高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增并膠回收。使用Clontech公司的In-Fusion^?HD Cloning Kit進(jìn)行無縫克隆，采用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂板過夜，挑單菌落，PCR菌液陽性鑒定后送廣州艾基生物有限公司測(cè)序。

1.8 番茄轉(zhuǎn)化，篩選和鑒定

用根癌農(nóng)桿菌GV3101介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化Micro-Tom番茄，獲得T0代苗。將T0代轉(zhuǎn)基因番茄苗移栽到營養(yǎng)土中，待葉子稍大時(shí)取葉片，用CTAB法提取葉片基因組DNA，對(duì)目的基因進(jìn)行PCR陽性鑒定。收取T0代果實(shí)中的種子即為T1代，播種T1代種子以及野生型番茄種子（WT），待葉子稍大時(shí)取葉片，用CTAB法提取葉片基因組DNA，對(duì)目的基因進(jìn)行PCR陽性鑒定。取T1代陽性植株以及WT生長(zhǎng)一致的果實(shí)液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱，用于果實(shí)總黃酮的提取。

1.9 番茄果實(shí)總黃酮的提取與測(cè)定

總黃酮含量的測(cè)定采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法，具體操作參考魏長(zhǎng)賓主編的《熱帶水果品質(zhì)分析實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》^[37]。

2 結(jié)果與分析

2.1 MaFLS1基因的克隆

以反轉(zhuǎn)錄后的香粉1號(hào)果肉cDNA為模板，設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果出現(xiàn)了條帶大小一致的片段（圖1）。連接到克隆載體上，陽性鑒定后送測(cè)序。測(cè)序后的基因編碼區(qū)（CDS）全長(zhǎng)1080 bp，編碼359個(gè)氨基酸。

2.2 MaFLS1蛋白的生物信息學(xué)分析

2.2.1 MaFLS1蛋白的理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)以及二三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 通過ExPASy在線網(wǎng)站（https：//web.expasy.org/protparam/）對(duì)MaFLS1編碼的蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示該基因編碼的蛋白含有359個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為39 436.94 Da，理論等電點(diǎn)（pI）為5.41，不穩(wěn)定系數(shù)為37.35（屬于穩(wěn)定蛋白類），親水性總平均值為-0.178，因此推測(cè)為穩(wěn)定的親水酸性蛋白。通過亞細(xì)胞定位網(wǎng)站（https：//wolfpsort.hgc.jp/）預(yù)測(cè)該基因蛋白在細(xì)胞中的位置，結(jié)果顯示其可能定位于細(xì)胞質(zhì)中。此外，通過相關(guān)網(wǎng)站預(yù)測(cè)其信號(hào)肽以及跨膜結(jié)構(gòu)情況，結(jié)果顯示其沒有信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)。該基因蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)利用SOPMA在線軟件（http：/web.expasy.org/）進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果（圖2）顯示，二級(jí)結(jié)構(gòu)占比分別是α-螺旋34.26%，無規(guī)則卷曲42.9%，延伸鏈16.71%，β-轉(zhuǎn)角為6.13%（圖2-A）。該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)由SWISS-MODEL在線軟件（http：//swissmodel.expasy.org/）完成（圖2-B）。當(dāng)一個(gè)蛋白質(zhì)的序列與一個(gè)已知結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)序列高度相似的時(shí)候，該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)就可以被建模出來。

2.2.2 MaFLS1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè) 通過蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)網(wǎng)站（SMART）預(yù)測(cè)MaFLS1的保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示該蛋白含有兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域（圖3）。一個(gè)是具有2-氧戊二酸/Fe（Ⅱ）依賴性二氧化物的蛋白質(zhì)的高度保守的N端區(qū)域，在第49～160個(gè)氨基酸位置。另一個(gè)是具有Fe²⁺和2-酮戊二酸（2OG）依賴性雙加氧酶結(jié)構(gòu)域的酶結(jié)構(gòu)，在第206～306個(gè)氨基酸位置，該酶通常使用雙氧分子催化有機(jī)底物的氧化，主要是通過使用亞鐵作為活性位點(diǎn)輔因子和2OG作為共底物，脫羧為琥珀酸鹽和CO₂。而在植物中，F(xiàn)e（Ⅱ）2OG雙加氧酶域酶催化植物激素的形成，如乙烯、赤霉素、色素和黃酮。

2.2.3 MaFLS1氨基酸序列與其他物種同源性分析及進(jìn)化樹構(gòu)建 通過NCBI上的Gene查找相關(guān)物種的FLS基因序列及其蛋白序列，將蘋果（MdFLS：GenBank ID NP_001306179.1）、香蕉（MaFLS1：GenBank ID XP_009384795.1；MaFLS2：GenBank ID XP_009404656.1；MaFLS3：GenBank ID XP_009402233.1）、擬南芥（AtFLS1～AtFLS6）、桃（PpFLS：GenBank ID AJO70134.1）、椰子（CnFLS：GenBank ID KAG1339093.1）、苦蕎（FtFLS1：GenBank ID AEC33116.1，F(xiàn)tFLS2：GenBank ID AGE13752.1）等物種的FLS基因通過DNAMAN進(jìn)行比對(duì)分析（圖4），發(fā)現(xiàn)其與其他物種的FLS氨基酸相似率為50%左右。將不同物種的FLS基因蛋白序列使用MEGA 7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹（圖5）。結(jié)果顯示，MaFLS1基因蛋白與該物種的MaFLS3、MaFLS2的親緣關(guān)系較近，與椰子CnFLS處于同一分支，同屬于單子葉植物，而與其他物種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，但和葡萄（VvFLS）的親緣關(guān)系較近，可能兩者功能類似。

2.3 香蕉MaFLS1在香粉1號(hào)果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)分析

如圖6所示，MaFLS1在香粉1號(hào)果實(shí)發(fā)育的前期表達(dá)量很低，幾乎不表達(dá)，在抽花斷蕾后的85 d，表達(dá)量開始增加，直到88 d，此時(shí)果實(shí)已經(jīng)完全成熟可以食用，而MaFLS1的表達(dá)量急劇增加，說明該基因是在果實(shí)發(fā)育的后期表達(dá)，因此推測(cè)該基因在香蕉果實(shí)成熟后期發(fā)揮重要作用。此外，從圖6中可以看出，MaFLS1在88 d的表達(dá)量與其他4個(gè)時(shí)期差異顯著，另外4個(gè)時(shí)期之間差異不顯著。

2.4 過表達(dá)MaFLS1番茄轉(zhuǎn)基因植株果實(shí)中總黃酮含量的測(cè)定

2.4.1 MaFLS1-35sn融合表達(dá)載體的獲得 通過同源重組的方法將目的片段與過表達(dá)載體pcambia1301-35sn連接，采用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂板挑單菌落，PCR陽性鑒定，陽性單菌落測(cè)序（圖7）。選擇測(cè)序正確的單菌落質(zhì)粒通過凍融法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101。

2.4.2 轉(zhuǎn)基因番茄植株的陽性鑒定 如圖8所示，從T1代植株中鑒定得到5株陽性苗。經(jīng)表型觀察，轉(zhuǎn)基因番茄植株比野生型植株矮小，且生長(zhǎng)發(fā)育慢于野生型。

2.4.3 T1代陽性植株果實(shí)總黃酮含量的測(cè)定 在果實(shí)成熟期（果實(shí)百分之百轉(zhuǎn)為紅色）利用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法測(cè)定轉(zhuǎn)基因以及野生型果實(shí)總黃酮含量，結(jié)果顯示，陽性轉(zhuǎn)基因果實(shí)中的總黃酮含量（w，后同）（0.58 mg·g^-1）極顯著高于野生型果實(shí)（0.46 mg·g^-1）（圖9），說明MaFLS1確實(shí)能夠增加果實(shí)中總黃酮含量。

3 討 論

FLS是影響植物黃酮醇合成和積累的重要因素，而黃酮醇是植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中一類重要的次生代謝物。筆者課題組前期已經(jīng)在相關(guān)期刊上發(fā)表了香粉1號(hào)果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期代謝組數(shù)據(jù)^[38]，發(fā)現(xiàn)香粉1號(hào)在果實(shí)成熟后期黃酮醇的物質(zhì)種類極其豐富，因此很有必要對(duì)黃酮醇合成相關(guān)基因開展研究。筆者在本研究中首次克隆了香蕉MaFLS，命名為MaFLS1，并對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。通過對(duì)其蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)MaFLS1 N端為α-同戊二酸依賴性雙加酶結(jié)構(gòu)域，C端為酮戊二酸/鐵離子依賴加氧酶結(jié)構(gòu)域，這與蘋果、擬南芥、洋蔥等植物中FLS家族蛋白的分析結(jié)果一致^{[13，29-30，33，36]}，說明在不同植物中FLS家族蛋白的氨基酸序列保守性較高，可以保證FLS在不同物種中表現(xiàn)相同的生物功能。香蕉果實(shí)不同發(fā)育階段MaFLS1的熒光定量表達(dá)結(jié)果表明，隨著果實(shí)的成熟，其表達(dá)量逐漸增加，特別是在后期極顯著增加，說明其可能參與了果實(shí)的成熟，這與高鵬釗等^[4]的研究結(jié)果相似。此外，MaFLS1在斷蕾后88 d的表達(dá)量急劇上升，而前期幾乎不表達(dá)或表達(dá)量極低，推測(cè)該基因在香蕉果實(shí)成熟前期可能受到其他基因的調(diào)控作用，導(dǎo)致該基因在前期幾乎不表達(dá)。

此外，筆者在本研究中通過異源超表達(dá)MaFLS1并測(cè)定轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中總黃酮的含量，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因果實(shí)中總黃酮的含量極顯著高于野生型果實(shí)，說明MaFLS1確實(shí)參與了總黃酮的合成，超表達(dá)MaFLS1能夠促進(jìn)植物體內(nèi)總黃酮的合成與積累。但由于T1代果實(shí)數(shù)量不夠，為了優(yōu)先保證T2代苗，沒有利用HPLC法測(cè)定具體是哪種或者哪幾種類黃酮含量的增加或減少。因此，為了進(jìn)一步研究MaFLS1具體是合成哪種類黃酮，以及是否具有表達(dá)特異性，下一步需要大量種植T2代轉(zhuǎn)基因番茄，取不同組織進(jìn)行熒光定量表達(dá)分析以及類黃酮測(cè)定，最終確定MaFLS1合成產(chǎn)物是哪種黃酮醇。

4 結(jié) 論

通過RT-PCR克隆得到了一個(gè)香蕉黃酮醇合成酶基因MaFLS1，并在番茄上進(jìn)行了初步基因功能驗(yàn)證，結(jié)果顯示該基因能夠增加果實(shí)中總黃酮的含量，將為以后的香蕉品質(zhì)育種提供理論依據(jù)。

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收稿日期：2023-06-14 接受日期：2023-11-29

基金項(xiàng)目：海南省自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（323QN297）；國家香蕉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系湛江試驗(yàn)站項(xiàng)目（CARS-31-17）；農(nóng)業(yè)農(nóng)村部物種品種資源保護(hù)費(fèi)項(xiàng)目（102125171630060009001）；中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院國家熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)中心科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（CATASCXTD202308）

作者簡(jiǎn)介：肖偉軍，男，研究實(shí)習(xí)員，碩士，主要從事香蕉遺傳育種研究。E-mail：xiaoweijun1990@163.com

*通信作者 Author for correspondence. E-mail：huhuigang@sina.com