電噴霧檢測器高效液相色譜法測定復(fù)方北豆根氨酚那敏片中灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙

沈心，顧曉風(fēng)，周震宇

（蘇州市藥品檢驗(yàn)檢測研究中心，江蘇蘇州 215104）

金銀花與山銀花均收載于2020年版《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)，其功效相似，均具有清熱解毒、涼散風(fēng)熱的功能，是臨床常用中藥[1-2]。近來，含有金銀花的中成藥如連花清瘟膠囊和金花清感顆粒等在新冠肺炎治療中發(fā)揮了積極作用[3]。由于金銀花的市場價(jià)格遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于山銀花，在實(shí)際應(yīng)用中存在著金銀花與山銀花藥材混用的現(xiàn)象，部分商家為了牟取利益，可能在金銀花藥材及藥物制劑投料中摻偽山銀花[4-5]。有文獻(xiàn)報(bào)道，二者化學(xué)成分含量存在顯著差異，山銀花中的綠原酸含量遠(yuǎn)高于金銀花，綠原酸含量過高會(huì)引起過敏反應(yīng)[6-8]，因此需要建立對(duì)應(yīng)的檢測方法以區(qū)分金銀花和山銀花，保障臨床用藥安全性。

復(fù)方北豆根氨酚那敏片為治療普通感冒或流行性感冒的常見藥，制劑處方由對(duì)乙酰氨基酚、馬來酸氯苯那敏、咖啡因、北豆根提取物、金銀花提取物和野菊花提取物組成。該藥品現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為WS-10001-(HD-0352)—2002，但該標(biāo)準(zhǔn)尚未對(duì)其金銀花提取物組分進(jìn)行控制，按標(biāo)準(zhǔn)所得檢驗(yàn)結(jié)果不能反映金銀花投料的具體情況，無法對(duì)誤用或摻雜山銀花投料進(jìn)行監(jiān)督與控制，因此有必要建立專屬的山銀花檢查方法，以有效控制制劑中金銀花投料的規(guī)范性。

查閱相關(guān)研究文獻(xiàn)和2020年版《中國藥典》，通常選擇灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙作為山銀花的特征成分，以此區(qū)分山銀花和金銀花[2,9-10]。目前文獻(xiàn)報(bào)道的灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙測定方法多采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器(HPLC-ELSD)法[5,9,11]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS)法[10,12]。ELSD 檢測器對(duì)溫度變化不敏感，用于梯度洗脫，重現(xiàn)性較差，而UPLC-MS 儀器昂貴，普及性不如液相色譜儀。電噴霧檢測器對(duì)化合物的結(jié)構(gòu)無特定要求，適用于梯度洗脫，靈敏度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性均具有明顯優(yōu)勢[13-14]?；陔妵婌F檢測器靈敏度高、重復(fù)性好、動(dòng)態(tài)監(jiān)測范圍寬、操作簡單、應(yīng)用范圍廣、信號(hào)響應(yīng)一致等優(yōu)點(diǎn)，筆者建立了電噴霧檢測器高效液相色譜法測定灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙，以考察復(fù)方北豆根氨酚那敏片中是否存在使用山銀花代替或摻雜金銀花投料的現(xiàn)象。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Thermo ultimate 3000 型，配電噴霧檢測器(CAD)，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

電子天平：XS205DU 型，感量為0.1 mg，梅特勒托利多科技(中國)有限公司。

甲醇：色譜純，霍尼韋爾貿(mào)易(上海)有限公司。

三氟乙酸：分析純，上海麥克林生化科技有限公司。

復(fù)方北豆根氨酚那敏片樣品：2 批，市售，批號(hào)分別為211111002和210404067。

灰氈毛忍冬皂苷乙對(duì)照品：純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為96.1%，批號(hào)為111814-202106，中國食品藥品檢定研究院。

川續(xù)斷皂苷乙對(duì)照品：純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為96.8%，批號(hào)為111813-201804，中國食品藥品檢定研究院。

金銀花對(duì)照藥材：批號(hào)為121060-201608，中國食品藥品檢定研究院。

山銀花(灰氈毛忍冬)對(duì)照藥材：批號(hào)為121595-201202，中國食品藥品檢定研究院。

實(shí)驗(yàn)用水為超純水，由密理博純水儀制得。

1.2 色譜條件

色 譜 柱：Waters XBridge C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國沃特世公司)；柱溫：30 ℃；檢測器溫度：35 ℃；進(jìn)樣體積：20 μL；冪函數(shù)：1.0；采集頻率：10 Hz；過濾常數(shù)：5.0；流動(dòng)相：A 相為甲醇，B 相為0.05%三氟乙酸溶液，流量為1.0 mL/min；洗脫方式：梯度洗脫，洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫條件Tab.1 Gradient elution condition

1.3 溶液配制

1.3.1 對(duì)照品溶液

稱取灰氈毛忍冬皂苷乙對(duì)照品15.17 mg、川續(xù)斷皂苷乙對(duì)照品15.62 mg，分別置于50 mL 容量瓶中，加入70%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲醇溶液超聲溶解，冷卻至室溫，用70%甲醇溶液稀釋至標(biāo)線，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量混合，用70%甲醇溶液逐級(jí)稀釋成系列濃度的混合對(duì)照品工作溶液。

1.3.2 樣品溶液

取樣品20片，研細(xì)混勻，稱取細(xì)粉約1.0 g，精密稱定，置于50 mL 容量瓶中，加入適量70%甲醇溶液，超聲30 min溶解，放冷，用70%甲醇溶液稀釋至標(biāo)線，搖勻，用微孔濾膜(孔徑0.45 μm)濾過。

1.3.3 陰性樣品溶液

按復(fù)方北豆根氨酚那敏片處方，正常投料金銀花提取物制備得陰性樣品，按1.3.2方法配制陰性樣品溶液。

1.3.4 限度溶液

按復(fù)方北豆根氨酚那敏片處方，摻入處方金銀花投料質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的山銀花(灰氈毛忍冬)投料，制得摻入5%山銀花的復(fù)方北豆根氨酚那敏片樣品，按1.3.2方法配制限度溶液。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

取灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙系列混合對(duì)照品溶液及樣品溶液，按1.2色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品提取溶劑和提取時(shí)間

樣品處理選擇操作簡便的超聲提取法，選擇體積分?jǐn)?shù)分別為50%、70%、100%的甲醇溶液作為提取溶劑，超聲時(shí)間分別選擇20、30、40 min 進(jìn)行試驗(yàn)，考察樣品(批號(hào)為210404067)中灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙的測定值，結(jié)果分別列于表2 和表3。由表2和表3數(shù)據(jù)可知，70%甲醇溶液超聲提取30 min目標(biāo)物測定值最高，說明該條件下目標(biāo)物可充分提取，故提取溶劑選擇70%甲醇溶液，超聲提取時(shí)間為30 min。

表2 用不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇提取時(shí)樣品的測定結(jié)果Tab.2 Different volume fractions methanol extracted results

表3 不同提取時(shí)間樣品的測定結(jié)果Tab.3 Different times extracted results

2.2 目標(biāo)物限量選擇

根據(jù)《中華人民共和國藥典》2020 年版四部通則0212藥材和飲片檢定通則中規(guī)定，藥屑雜質(zhì)通常不得超過3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，同時(shí)考慮到山銀花和金銀花產(chǎn)地分布廣泛，二者相似度高，金銀花中易混入少量山銀花，認(rèn)為金銀花中摻入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的山銀花可忽略不計(jì)。以摻入5%山銀花的自制復(fù)方北豆根氨酚那敏片樣品的含量作為限量指標(biāo)[15]。不同產(chǎn)地的山銀花藥材中灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙的含量各有不同[10]，試驗(yàn)制備的限度溶液中灰氈毛忍冬皂苷乙檢出質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.33 mg/g，川續(xù)斷皂苷乙檢出質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于該方法檢出限，故選擇方法檢出限0.06 mg/g為川續(xù)斷皂苷乙擬定限量，0.33 mg/g為灰氈毛忍冬皂苷乙擬定限量。

2.3 專屬性試驗(yàn)

分別取陰性樣品溶液、混合對(duì)照品溶液(灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙質(zhì)量濃度分別為55.94、46.15 μg/mL)和樣品溶液，按1.2 色譜條件測定，記錄液相色譜圖如圖1所示。

圖1 專屬性試驗(yàn)色譜圖Fig.1 Chromatograms of exclusive test

由圖1 可以看出，灰氈毛忍冬皂苷乙峰和川續(xù)斷皂苷乙峰以及相鄰色譜峰均實(shí)現(xiàn)基線分離，理論板數(shù)均大于5 000，陰性樣品中無相對(duì)應(yīng)的色譜峰，其它組分無干擾，方法專屬性良好。

2.4 線性方程、檢出限及定量限

取系列混合對(duì)照品工作溶液，按1.2色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜峰面積響應(yīng)值，以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值(C)為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積的對(duì)數(shù)值(A)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。另取混合對(duì)照品溶液(灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙質(zhì)量濃度分別為11.66、12.10 μg/mL)，用70%甲醇溶液逐級(jí)稀釋，同法測定，分別以3倍和10 倍信噪比對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度作為各組分的檢出限和定量限。

灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙的質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限列于表4。由表4可知，灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙的質(zhì)量濃度分別在2.33～291.57、2.42～302.40 μg/mL范圍內(nèi)其對(duì)數(shù)值與峰面積對(duì)數(shù)值線性關(guān)系良好，檢出限分別為1.17、1.21 μg/mL，定量限分別為2.33、2.42 μg/mL。

2.5 精密度試驗(yàn)

取批號(hào)為211111002的樣品，平行制備6份樣品溶液，按1.2色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果列于表5。

表5 精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Precision test results

由表5 可知，樣品中灰氈毛忍冬皂苷乙的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.68 mg/g，測定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.54%，川續(xù)斷皂苷乙的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.14 mg/g，測定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.66%，表明該方法精密度良好。

2.6 加標(biāo)回收試驗(yàn)

取約0.5 g 樣品(批號(hào)為211111002)，精密稱定，共9 份，分別置于50 mL 容量瓶中，按低、中、高3 個(gè)濃度分別加入對(duì)照品溶液(灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙質(zhì)量濃度分別為0.35、0.29 mg/mL) 2.0、4.0、6.0 mL，加入70%甲醇溶液適量，超聲30 min溶解，放冷，用70%甲醇溶液稀釋至標(biāo)線，搖勻，用微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液按1.2色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜峰面積并計(jì)算灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙的回收率，結(jié)果列于表6。由表6 可知，灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙的加標(biāo)平均回收率分別為104.8%、101.5%，表明該方法準(zhǔn)確度較高，可滿足分析要求。

表6 樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.6 Recovery test results

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液(灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙質(zhì)量濃度分別為29.16、30.24 μg/mL)，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12、24 h，按1.2 色譜條件測定，結(jié)果顯示，灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙的色譜峰面積測定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.77%、2.67%，表明該溶液室溫放置24 h基本穩(wěn)定。

3 結(jié)語

建立了電噴霧檢測器高效液相色譜法測定復(fù)方北豆根氨酚那敏片中灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙含量的分析方法，該方法操作簡單，具有較好的精密度和準(zhǔn)確度，能夠有效判斷復(fù)方北豆根氨酚那敏片中是否存在以山銀花代替或是摻雜金銀花投料的情況，彌補(bǔ)現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的監(jiān)測盲點(diǎn)，可有效控制金銀花的投料規(guī)范性，為該類制劑的用藥安全提供保障。