高效液相色譜法同時測定明膠空心膠囊中苯甲酸和山梨酸

劉康連，梁曉玲，黎強，樊文研，龐云娟，陳宇

［玉林市食品藥品檢驗檢測中心，玉林中藥材（含香辛料）質(zhì)量檢測與評價工程技術中心，廣西玉林 537000］

明膠空心膠囊是用明膠加輔料制成的空心硬膠囊，作為膠囊劑中的一種特殊輔料，廣泛應用于中藥制劑、保健食品等膠囊劑[1-2]。膠囊劑為除了片劑以外的口服固體制劑的主要劑型之一，明膠空心膠囊作為膠囊劑型藥物的載體，隨藥物進入人體消化系統(tǒng)，最終被人體所吸收[2]，因此明膠空心膠囊的質(zhì)量安全直接影響藥品和保健食品的質(zhì)量安全[2-4]?！吨腥A人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2020 年版四部對明膠空心膠囊有明確的微生物限度要求，而明膠空心膠囊的主要原料明膠是細菌繁殖的優(yōu)良培養(yǎng)基，要使其達到藥典規(guī)定的微生物限度要求，除了嚴格控制明膠的衛(wèi)生指標與明膠空心膠囊的生產(chǎn)過程外，生產(chǎn)企業(yè)通常會加入一定量的防腐劑?！吨袊幍洹穼γ髂z空心膠囊中防腐劑的檢查主要是針對其滅菌工藝涉及到的防腐劑殘留，檢查項目只有對羥基苯甲酸酯類、氯乙醇、環(huán)氧乙烷3 種，目前還沒有明膠空心膠囊中苯甲酸、山梨酸等防腐劑的檢查方法。苯甲酸鈉和山梨酸鉀因價格低廉且具有廣譜的抑菌效果，在食品、藥品、化妝品中應用廣泛[5]。如果明膠空心膠囊生產(chǎn)者在生產(chǎn)過程中過多添加苯甲酸鈉、山梨酸鉀等防腐劑，達到一定濃度時會有過強的抑菌作用，不僅影響到明膠空心膠囊微生物限度檢查方法的建立[6]，也會影響到其藥品制劑微生物限度檢查方法的建立[7-9]。此外苯甲酸鈉、山梨酸鉀的使用安全性也不可忽略，苯甲酸鈉ADI (每日人體每千克體重允許攝入的質(zhì)量，單位為mg)為0～5 mg/kg，LD50 (半數(shù)致死量)為4 070 mg/kg[10]，其安全性也會影響到患者用藥的安全。

目前測定食品藥品中苯甲酸、山梨酸的方法有高效液相色譜法[11-13]、氣相色譜法[14-16]等。明膠空心膠囊中水溶性蛋白質(zhì)含量較高，難以通過單一加入蛋白沉淀劑來去除樣品溶液中蛋白質(zhì)的影響。黃銀波等[17-19]對食品中苯甲酸、山梨酸的測定分析結(jié)果表明，C18固相萃取小柱對苯甲酸、山梨酸有很好的吸附作用，且提取率高。筆者參考食品中苯甲酸、山梨酸的提取方法對明膠空心膠囊樣品處理方法進行優(yōu)化，樣品經(jīng)水浴溶解，加入蛋白質(zhì)沉淀劑，用C18固相萃取小柱去除蛋白質(zhì)，在此基礎上建立了明膠空心膠囊中苯甲酸鹽(以苯甲酸計)、山梨酸鹽(以山梨酸計)的高效液相色譜檢查方法。該方法能夠有效地去除蛋白質(zhì)、部分色素及其它雜質(zhì)的干擾，提取方法操作簡便，提取回收率高，滿足明膠空心膠囊中苯甲酸和山梨酸的測定要求。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：1260型，配二極管陣列(DAD)檢測器，美國安捷倫科技有限公司。

電子分析天平：XS-205Du 型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

高速冷凍離心機：ROTANTA 460R 型，德國Hettich科學儀器公司。

水浴恒溫振蕩器：SHZ-88 型，江蘇金怡儀器科技有限公司。

pH計：FE20型，瑞士梅特勒-托利多公司。

苯甲酸對照品：批號為G139784，質(zhì)量分數(shù)為99.9%，德國Dr·Ehrenstorfer GmbH公司。

山梨酸對照品：批號為C0005882，質(zhì)量分數(shù)為99.7%，北京曼哈格生物科技有限公司。

甲醇：色譜純，美國Fisher chemical公司。

甲酸：色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司。

乙酸銨：分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

亞鐵氰化鉀[K4[Fe (CN)6]·3H2O]、乙酸鋅[Zn(CH3COO)2·2H2O]：均為分析純，廣東光華科技股份有限公司。

冰乙酸：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

明膠空心膠囊樣品：由藥品生產(chǎn)企業(yè)單位提供。

實驗用水為超純水。

1.2 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB-Aq 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國安捷倫科技有限公司)；柱溫：30 ℃；檢測器：二極管陣列檢測器；檢測波長：230 nm；進樣體積：10 μL；流動相：2 mmol/L甲酸與20 mmol/L乙酸銨混合溶液-甲醇(體積比為90∶10)，流量為1.0 mL/min；洗脫方式：等度洗脫。

1.3 溶液配制

苯甲酸、山梨酸對照品儲備液：質(zhì)量濃度均為5 g/L，分別精密稱取苯甲酸、山梨酸對照品各0.1 g(精確至0.000 1 g)于兩只20 mL容量瓶中，用適量甲醇溶解并分別定容至標線，搖勻。

苯甲酸、山梨酸混合標準中間溶液：兩組分質(zhì)量濃度均為200 mg/L，分別精密移取苯甲酸、山梨酸對照品儲備液各2 mL于同一只50 mL容量瓶中，用水定容至標線，搖勻。

苯甲酸、山梨酸系列混合標準工作溶液：分別準確吸取苯甲酸、山梨酸混合標準中間溶液0、0.05、0.25、0.50、1.00、2.50 mL，用水定容至10 mL，配制成苯甲酸、山梨酸質(zhì)量濃度均分別為0、1、5、10、20、50 mg/L的系列混合標準工作溶液。

2 mmol/L甲酸-20 mmol/L乙酸銨混合溶液：稱取1.54 g 乙酸銨，加入適量水溶解，再加入75.2 μL甲酸，用水定容至1 000 mL，搖勻，經(jīng)0.45 μm 尼龍濾膜過濾。

1.4 樣品處理

稱取明膠空心膠囊樣品約0.5 g 于50 mL 聚四氟乙烯具塞離心管中，精密稱定，加入10 mL 水，于60 ℃水浴恒溫振蕩器中振蕩溶解提取30 min，冷卻至室溫后分別加入0.25 mol/L 亞鐵氰化鉀溶液和1.0 mol/L 乙酸鋅溶液各2 mL，用水稀釋定容至20 mL，渦旋混勻，以4 600 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，取5.0 mL上清液，加入冰乙酸約0.3 mL調(diào)pH至3～4。取一支C18固相萃取小柱，分別用5 mL甲醇和5 mL水活化后上樣，用5 mL 水清洗一次，再用3 mL 60%(體積分數(shù)，下同)甲醇水溶液洗脫，收集洗脫液于15 mL離心管中，用60%甲醇水溶液稀釋至5.0 mL，混勻，經(jīng)0.45 μm尼龍濾膜過濾，作為樣品溶液。

同法制備空白對照溶液(除不用明膠空心膠囊樣品外，其余操作同樣品溶液制備方法)。

1.5 測定方法

取苯甲酸、山梨酸系列混合標準工作溶液和樣品溶液，按照1.3色譜條件進樣分析，記錄色譜峰面積，按外標法計算明膠空心膠囊中苯甲酸和山梨酸的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方法及浸提溶劑選擇

明膠空心膠囊主要原料明膠屬于蛋白類物質(zhì)(骨膠或皮膚)，為水溶性蛋白。樣品預處理方法中苯甲酸、山梨酸的提取大多數(shù)為水提取。參考文獻[20-21]，采用水浸提，選用亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液為蛋白沉淀劑。

通過樣品加標的方法分別考察加入等量甲醇、等量乙醚的提取效果。結(jié)果表明，加入等量甲醇提取率雖然高，但是雜質(zhì)多，對檢測目標物干擾大，不利于準確定量，同時檢測時間較長且容易對色譜柱造成污染，降低色譜柱柱效；加入等量乙醚提取，雖然雜質(zhì)少，但是乙醚不僅揮發(fā)性大，對環(huán)境不友好，而且在提取過程中容易出現(xiàn)乳化，目標物損失較多。故樣品第一步提取選擇直接用水浸提，不需要進行反向提取。

樣品經(jīng)水浸提后，對蛋白沉淀劑的加入體積進行考察。結(jié)果表明，沉淀劑的加入體積分別為1、2、3、4、5 mL 時，沉淀物的濕重呈增加趨勢，增重差約為1 g，表明當沉淀劑加入體積為5 mL時，樣品溶液中蛋白質(zhì)并未充分沉淀。當沉淀劑的加入體積為1 mL時，離心后上清液難以通過C18固相萃取小柱；而當沉淀劑的加入體積不小于2 mL時，離心后的上清液可以順利通過C18固相萃取小柱。出于節(jié)約試劑考慮，選擇蛋白沉淀劑加入體積為2 mL。

分別考察離心后的上清液不調(diào)節(jié)pH和調(diào)節(jié)pH至3～4 后過C18固相萃取小柱苯甲酸、山梨酸的回收率。結(jié)果表明，苯甲酸的回收率分別為79.4%和98.2%，山梨酸的回收率分別為83.7%和86.0%，上清液調(diào)節(jié)pH 至3～4 后再過C18固相萃取小柱的回收率明顯更高，所以離心后的上清液調(diào)節(jié)pH至3～4后再過C18固相萃取小柱。

考察不同體積分數(shù)的甲醇水溶液洗脫時苯甲酸和山梨酸的回收率，結(jié)果見表1。由表1 可知，當甲醇體積分數(shù)為50%～80%時，苯甲酸和山梨酸的回收率為90%～110%，綜合考慮苯甲酸、山梨酸高濃度時的洗脫效果，最終選擇體積分數(shù)為60%的甲醇水溶液作為洗脫液。

表1 不同體積分數(shù)的甲醇水溶液洗脫時苯甲酸、山梨酸的回收率Tab.1 Recovery rates of benzoic acid and sorbic acid during washing with methanol aqueous solutions of different volume fractions %

2.2 色譜條件選擇

2.2.1 檢測波長

采用高效液相色譜-二極管陣列檢測器對苯甲酸、山梨酸混合標準工作溶液于200～400 nm 范圍內(nèi)進行全波長光譜掃描，光譜圖如圖1和圖2所示。由圖1 和圖2 可以看出，苯甲酸的最大吸收波長為228 nm，山梨酸的最大吸收波長為254 nm，為了同時檢測苯甲酸和山梨酸，參考GB 5009.28—2016《食品安全國家標準 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定》，選擇檢測波長為230 nm。在此波長處苯甲酸、山梨酸均有較高吸收值，靈敏度較高。

圖1 苯甲酸光譜圖Fig.1 Spectrogram of benzoic acid

圖2 山梨酸光譜圖Fig.2 Spectrogram of sorbic acid

2.2.2 色譜柱選擇

分別選擇Agilent Eclipse XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent Zorbax SB-Aq 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)和Waters Atlanntis? T3 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)進行試驗。結(jié)果表明，3 種色譜柱對苯甲酸、山梨酸均有良好的分離效果，且峰形尖銳對稱，其中Agilent Zorbax SB-Aq 色譜柱保留時間最短，分析時間最短。此外Agilent Zorbax SB-Aq 色譜柱屬于水相柱，具有親水性的表面，即使使用水為流動相，也可以有效地防止固定相的塌陷，適用于難分離的酸性、堿性和極性化合物，其保留作用比C18色譜柱強，故選擇Agilent Zorbax SB-Aq 色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)作為分析柱。

2.2.3 流動相選擇

以苯甲酸、山梨酸混合標準溶液、加標樣品溶液為待測溶液，考察2 mmol/L甲酸-20 mmol/L乙酸銨混合溶液與甲醇的體積比分別為95∶5、90∶10、85∶15 共3 種不同流動相的分離效果。結(jié)果表明，在3種不同流動相下，苯甲酸、山梨酸混合標準溶液的色譜峰分離度均大于1.5；當2 mmol/L甲酸-20 mmol/L乙酸銨混合溶液與甲醇的體積比為90∶10 時，加標樣品溶液中苯甲酸、山梨酸與其相鄰雜質(zhì)峰的分離度均不小于1.5，且該流動相系統(tǒng)分析時間相對較短，所以最終選擇以2 mmol/L甲酸-20 mmol/L乙酸銨混合溶液與甲醇的體積比為90∶10作為流動相。

2.2.4 其它色譜條件

柱溫、流量、進樣體積參考GB 5009.28—2016選擇，苯甲酸、山梨酸均能夠?qū)崿F(xiàn)有效分離，且峰形良好。

2.3 專屬性試驗

分別吸取空白對照溶液、混合標準溶液及陽性樣品溶液，按1.2色譜條件進行測定，色譜圖分別如圖3～圖5 所示。圖3～圖5 結(jié)果表明，空白對照溶液無干擾，樣品溶液中苯甲酸、山梨酸的保留時間分別約為6.0 min 和9.8 min，與混合標準溶液中苯甲酸、山梨酸的保留時間一致，兩組分峰形良好，分離效果良好，表明該方法專屬性良好。

圖3 空白對照溶液色譜圖Fig.3 Chromatogram of blank control solution

圖4 混合標準溶液色譜圖Fig.4 Chromatogram of mixed standard solution

圖5 陽性樣品溶液色譜圖Fig.5 Chromatogram of positive sample solution

2.4 線性方程與檢出限、定量限

按照1.2色譜條件分別測定苯甲酸、山梨酸系列混合標準工作溶液，以溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(x)，以色譜峰面積為縱坐標(y)，繪制標準工作曲線，計算線性方程和相關系數(shù)。

稱取陰性樣品2 份，每份約0.5 g，精密稱定，分別加入苯甲酸、山梨酸混合標準中間溶液10、20 μL，按1.4 方法制備樣品溶液，在1.2 色譜條件下測定，按取樣質(zhì)量為0.5 g，稀釋體積為20 mL，以3 倍信噪比計算各組分的方法檢出限，以10倍信噪比計算各組分的定量限。

苯甲酸、山梨酸質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關系數(shù)、檢出限及定量限見表2。由表2 可知，苯甲酸、山梨酸的質(zhì)量濃度在0～50 mg/L范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關系良好，相關系數(shù)均大于0.999。

表2 質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關系數(shù)、檢出限及定量限Tab.2 Linear range of mass concentration, linear equation,correlation coefficient,detection limit and quantification limit

2.5 精密度試驗

取陽性樣品6份，各0.5 g，精密稱定，按照1.4方法制備樣品溶液，在1.2色譜條件下分別測定，結(jié)果見表3。由表3 可知，苯甲酸、山梨酸測定結(jié)果的相對標準偏差分別為1.9%、2.2%，表明該方法精密度良好。

表3 精密度試驗結(jié)果Tab.3 Precision test results

2.6 穩(wěn)定性試驗

取苯甲酸、山梨酸的質(zhì)量濃度均為10 mg/L 的混合標準溶液，分別于配制完成后第0、2、4、8、16、24 h 進行測定，結(jié)果見表4。由表4 可知，兩組分色譜峰峰面積測定結(jié)果的相對標準偏差分別為0.10%、0.22%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表4 穩(wěn)定性試驗結(jié)果Tab.4 Stability test results

2.7 加標回收試驗

精密稱取明膠空心膠囊9 份，每份0.5 g，置于50 mL聚四氟乙烯具塞離心管中，分別加入苯甲酸、山梨酸混合標準中間溶液0.5、1、4 mL，然后加入水至10 mL，按1.4方法制備加標樣品溶液，在1.2色譜條件下測定，每種質(zhì)量濃度的溶液平行測定3份，結(jié)果見表5。由表5 可知，苯甲酸加標平均回收率為101.3%～106.1%，山梨酸加標平均回收率為92.4%～96.0%，表明該方法具有較高的準確度，滿足實際樣品測定要求。加標樣品溶液色譜圖如圖6所示。

圖6 加標樣品溶液色譜圖Fig.6 Chromatogram of spiked sample solution

表5 樣品加標回收率試驗結(jié)果Tab.5 Sample addition recovery test results

3 結(jié)語

建立了高效液相色譜法同時測定明膠空心膠囊中苯甲酸鹽(以苯甲酸計)、山梨酸鹽(以山梨酸計)含量的檢測方法。該方法專屬性強，操作簡便，靈敏度和準確度高，精密度良好，可用于明膠空心膠囊中除藥典工藝防腐劑環(huán)氧乙烷、氯乙醇、對羥基苯甲酸酯類以外的防腐劑苯甲酸和山梨酸的測定。該方法補充了明膠空心膠囊在防腐劑質(zhì)量控制方面的不足，可為藥用輔料明膠空心膠囊的質(zhì)量控制提供技術參考，也可為市場監(jiān)管監(jiān)測苯甲酸鹽和山梨酸鹽在明膠空心膠囊中的使用提供檢測技術支持。