牡丹葉提取物的含量測定及其協(xié)同羧甲基殼聚糖的抗菌活性研究

摘要：目的 牡丹（ Paeonia suffruticosa Andr. ）是毛茛科芍藥屬的多年生落葉灌木，其根皮被稱為“牡丹皮”，藥用歷史悠久，其傳統(tǒng)非藥用部位“葉”在民族地區(qū)應(yīng)用廣泛，研究牡丹葉的藥用價值是提高中藥資源綜合利用的有益嘗試。牡丹葉含有的多酚、黃酮類活性成分，在抑菌、抗氧化和抑制酪氨酸酶等方面作用顯著。方法 采用甲醇提取法獲取牡丹葉提取物，建立同時測定牡丹葉提取物中5種活性成分（沒食子酸、芍藥苷、山奈素、槲皮素和異鼠李素）含量的高效液相色譜（HPLC）法。同時，采用Folin-Ciocalteu 法和硝酸鋁—亞硝酸鈉比色法測定了牡丹葉提取物中總黃酮和總多酚的含量。立足羧甲基殼聚糖（CMCS）抗菌活性和良好的載藥特性，研究其與牡丹葉提取葉的協(xié)同機(jī)制。結(jié)果 含量測定結(jié)果顯示，牡丹葉中沒食子酸、芍藥苷、山奈素、槲皮素和異鼠李素的含量分別為17.780%、0.470%、1.150%、1.920%和3.160%，其線性關(guān)系、穩(wěn)定性、重復(fù)性和精密度等均良好。體外抗菌活性結(jié)果顯示，牡丹葉提取物（PLE）與CMCS聯(lián)用的FICI系數(shù)均小于0.500，其對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的抑菌效果均表現(xiàn)為協(xié)同作用。結(jié)論 牡丹葉提取物中含有較高的多酚類和黃酮類成分，并且與CMCS具有較強(qiáng)的協(xié)同作用。為進(jìn)一步開發(fā)牡丹葉與羧甲基殼聚糖相關(guān)抗菌制劑的研制提供聯(lián)用數(shù)據(jù)支撐，為牡丹藥用資源的綜合利用奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：牡丹葉提取物；羧甲基殼聚糖；含量測定；總多酚；總黃酮；協(xié)同抗菌

中圖分類號：R978.1 " " " " 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A " " " " 文章編號：1001-8751（2024）03-0202-08

Determination of the Content of Peony Leaf Extract and its Antibacterial Activity

in Synergy with Carboxymethyl Chitosan

Jia Shi-a-mi1， " Ji-mo Re-zhe-mu1， " E-di Shi-xing1， " Huang Sheng-ting1， " Zeng Rui1，2， " Wang Xiao1，2

（1 College of Pharmacy Southwest Minzu University， " Chengdu " 610041;

2 Key Laboratory of \"Research and Application of Preparation of Ethnic Medicine on Tibetan Plateau\"，

Sichuan Provincial Department of Education， " Chengdu " 610225）

Abstract： Objective Paeony （Paeonia suffruticosa Andr.） is a perennial deciduous shrub belonging to the genus Paeonia in the goldencup family. Its root bark is called \"peony bark\" and its traditional non-medicinal part \"leaf\" is widely used in ethnic areas. Tyrosinase inhibition， antioxidant properties， and antibacterial properties are all significantly impacted by the active flavonoids and polyphenols found in peony leaves. Methods A high performance liquid chromatography （HPLC） method was established for the simultaneous determination of five active components （gallic acid， paeoniflorin， kaempferol， quercetin and isorhamnetin） in the extract of peony leaves by methanol extraction. Meanwhile， the contents of total flavonoids and total polyphenols in the extract of peony leaves were determined by the Folin-Ciocalteu method and aluminum nitrate-sodium nitrite colorimetric method. The study examined the synergistic mechanism between carboxymethyl chitosan （CMCS） and peony leaf extract， taking into account CMCS's antibacterial activity and superior drug loading capabilities. Results The results showed that the contents of gallic acid， paeoniflorin， kaempferol， quercetin and isorhamnetin were 17.780%， 0.470%， 1.150%， 1.920% and 3.160%， and the linear relationship， stability， repeatability and precision of the leaves were good. Peonies leaf extract （PLE） in combination with CMCS had a FICI coefficient of less than 0.500 and a synergistic antibacterial action against Staphylococcus aureus and Escherichia coli， according to the results of its antibacterial activity in vitro. Conclusion The extract of peony leaves contains high polyphenols and flavonoids， and has strong synergistic effect with CMCS. This study provided data support for the further development of antibacterial preparations related to carboxymethyl chitosan from peony leaves， and laid a foundation for the comprehensive utilization of peony medicinal resources.

Key words： PLE； CMCS； content determination；total polyphenols；total flavonoids；synergistic antimicrobials

牡丹基原為毛莨科芍藥屬牡丹組（Paeonia rockii Andr.），包括牡丹、矮牡丹和紫斑牡丹，其傳統(tǒng)用藥部位為根皮，稱為“牡丹皮”，具有清熱涼血，活血化瘀的功效[1]。其葉、莖、花等通常被作為非藥用部位廢棄，造成中藥資源浪費(fèi)。四川牡丹基原為毛莨科芍藥屬四川牡丹（Paeonia szechuanica Fang），是中國的特有植物，產(chǎn)自四川西北部（馬爾康），生長在海拔2400～3100 m的山坡、河邊草地或叢林中。四川牡丹與牡丹親緣關(guān)系近，在葉裂片、被毛及花盤形態(tài)等能與后者區(qū)別，其根皮也可作“牡丹皮”用?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，牡丹非藥用部位—牡丹葉具有抗氧化、抑菌、降血脂和活化血管等功效[2]。牡丹葉中含有豐富的總黃酮、總酚酸和單寧等成分，本課題組采用高效液相色譜—質(zhì)譜—二苯基三硝基苯肼（DPPH-UHPLC-ESI-HRMSn）鑒別了牡丹花和葉中的46種化合物，其中25個成分具有潛在的抗氧化活性。牡丹葉提取物（PLE）對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌和蠟樣芽孢桿菌均有一定的抑菌效果，當(dāng)PLE濃度達(dá)到2%的時候，其抑菌率均高于90%[3-5]。在牡丹葉提取物的抗菌效果明確的基礎(chǔ)上，將其開發(fā)制備為海綿敷料、保鮮膜、水凝膠等多種形式，分別表現(xiàn)出良好的促愈合、保鮮、消炎的藥效[6-8]。本研究采用高效液相色譜法測定牡丹葉提取物中5種黃酮類和多酚類成分的含量。

隨著各種抗菌藥物的廣泛使用和不合理應(yīng)用，耐藥菌不斷出現(xiàn)，細(xì)菌耐藥機(jī)制越來越復(fù)雜，研發(fā)安全有效對的抗菌藥物極其重要[9]。牡丹葉提取物具有良好的抗菌抗氧化能力，但PLE以提取物形式應(yīng)用時，在水或生物體中迅速溶解而不易滯留在病變部位，減少起效時間，從而減弱了PLE的抗氧化和抗菌活性。羧甲基殼聚糖（CMCS）是天然多糖，加水可自組裝成水凝膠，因具有無毒、良好的生物降解性、血液相容性和抗菌性能，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[10-14]。但是由于CMCS的高溶解性，單獨的CMCS聚合物聚合度太弱，也不宜成型，從而會減弱其抗菌和抗氧化性能，所以CMCS不適合單獨使用[14-17]。將牡丹皮提取物與CMCS聯(lián)合，利用其不同抗菌機(jī)制，有利于減少耐藥性的產(chǎn)生[18-19]。

本研究采用HPLC含量測定方法，明確牡丹葉提取物中主要活性成分（沒食子酸、芍藥苷、山奈素、槲皮素和異鼠李素）的含量，并研究牡丹葉提取物與CMCS的聯(lián)用效應(yīng)，明確最佳聯(lián)用配比，為牡丹葉提取物進(jìn)一步的新型抗菌制劑開發(fā)提供實驗依據(jù)，為牡丹資源的綜合利用進(jìn)行有益嘗試。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

儀器：TU-1950 型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），BT25S十萬分之一電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司），ESJ200-4萬分之一電子天平（沈陽龍騰電子有限公司），RE-3000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），HX-200型高速中藥粉碎機(jī)（浙江省永康市溪岸五金藥具廠），Adventure系列去離子純水機(jī)（上海沉黃科學(xué)儀器有限公司），Ultimate 3000超高效液相色譜系統(tǒng)（戴安公司，美國），ACQUITY UPLCBEH C18 色譜柱（沃特世科技有限公司，美國）。

材料：羧甲基殼聚糖（羧化度≥80%）購自四川恒力新材料公司（成都），牡丹葉產(chǎn)自小金縣（四川，中國）。金黃色葡萄球菌（ATCC29213）和大腸埃希菌（ATCC25922）購自合肥新源生物科技有限公司。沒食子酸（CAS-149-91-7）、芍藥苷（CAS-18463-25-7）、山奈素（CAS-20784-50-3）、槲皮素（CAS-849061-97-8）和異鼠李素（ACS-480-19-3）均購自曼斯特生物科技有限公司。其他試劑為分析試劑，無水乙醇（99.5%），胰蛋白胨，酵母提取物，氯化鈉，瓊脂，實驗中使用的純水來自Millipore凈化系統(tǒng)（Bedford，MA，美國）。

1.2 牡丹葉提取物供試品的制備

牡丹葉經(jīng)冷凍干燥后，粉碎，過65目篩（中國藥典2020年版），稱取100 g粉末加入1000 mL甲醇中，置于1 L的錐形瓶內(nèi)，超聲提取1 h，提取過濾三次，將三次濾液合并后，通過真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收甲醇溶液，得到殘留粉末干燥，密封保存于4 ℃冰箱，備用。

1.3 牡丹葉提取物中有效成分的含量測定

1.3.1 色譜條件

色譜柱為 SunFireTM C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），以0.2%磷酸水為流動相A；乙腈為流動相B；洗脫梯度按照：0～10 min，2%；10～15 min，2%～15%；15～25 min，15%～16%；25～35 min，16%～17%；35～40 min，17%～18%；40～50 min，18%～20%；50～60 min ，20%～25%；60～70 min，25%～40%。體積流量1 mL/min，進(jìn)樣室溫度25 ℃，柱溫30 ℃；檢測波長為254 nm；進(jìn)樣量10 μL。

1.3.2 溶液制備

（1）混合對照品制備 取5個對照品沒食子酸、芍藥苷、山奈素、槲皮素和異鼠李素各約22.000 mg，精密稱定，置于20 mL容量瓶中用甲醇溶解并定容。制備成混合標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。然后取標(biāo)準(zhǔn)品貯備液0.100 mL、0.200 mL、0.300 mL、0.500 mL、1.000 mL、2.000 mL和4.000 mL分別置于50 mL容量瓶中用甲醇稀釋定容制備成系列濃度混合對照品溶液。并用0.22 μm濾膜濾過，取濾液即得。本研究采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算沒食子酸、芍藥苷、山奈素、槲皮素和異鼠李素的含量。

（2）供試品溶液制備 取制備好的牡丹葉提取物20.000 mg，精密稱定，加入甲醇，超聲處理制備成5 mg/mL，取5 mL（5 mg/mL）的牡丹葉提取物溶液于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，振蕩均勻，然后用封口膜將容量瓶的瓶口封住，37 ℃超聲處理30 min。使用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

1.3.3 系統(tǒng)適用性實驗

系統(tǒng)適用性實驗用混合對照品通過液相色譜儀測，每次進(jìn)樣量為10 μL，然后用色譜儀測得混合對照品的色譜圖。在“1.3.1”條件下記錄沒食子酸、芍藥苷、山奈素、槲皮素和異鼠李素的峰的保留時間和分離度。

1.3.4 線性關(guān)系考察

分別取“1.3.2中（1）”下的溶液，用“1.3.1”條件測定，記錄沒食子酸、芍藥苷、山奈素、槲皮素和異鼠李素的峰面積，然后用濃度作為橫坐標(biāo)（X），峰面積作為縱坐標(biāo)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表1。

1.3.5 穩(wěn)定性實驗

測定牡丹葉提取物供試品溶液的穩(wěn)定性用液相色譜儀測，首先取“1.3.2中（2）”溶液，測定并記錄該溶液在室溫下放置0、4 h、8 h、12 h和24 h時的色譜峰和峰面積，計算沒食子酸、芍藥苷、山奈素、槲皮素和異鼠李素的峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）。

1.3.6 精密度測定

取牡丹葉提取物供試品溶液線性濃度下的10 μg/mL重復(fù)進(jìn)樣6次。分別計算沒食子酸、芍藥苷、山奈素、槲皮素和異鼠李素出峰的峰面積的RSD[20]。

1.3.7 重復(fù)性實驗

取同一批牡丹葉提取物研磨，按“1.3.2中（2）”項下方法平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣測定。分別計算沒食子酸、芍藥苷、山奈素、槲皮素和異鼠李素出峰的保留時間和峰面積的RSD[21]。

1.3.8 加樣回收率

精密稱取同一批牡丹葉提取物供試品9份，每份約0.100 g，按“1.3.2中（2）”方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，計算平均加樣回收率及RSD。記錄沒食子酸、芍藥苷、山奈素、槲皮素和異鼠李素的回收率[21]。

1.4 總黃酮和總多酚含量測定

1.4.1 總黃酮含量

將牡丹葉提取物和蘆丁用甲醇制備成濃度為0.200 mg/mL的溶液。取蘆丁溶液1.000 mL、2.000 mL、3.000 mL、4.000 mL、5.000 mL和6.000 mL置于25 mL容量瓶中，先加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻后放置6 min，然后加10％的硝酸鋁溶液1 mL，同樣放置6 min，再然后加10％氫氧化鈉10 mL，搖勻后用蒸餾水定容至25 mL，放置15 min。然后將其在紫外分光光度計中測定其吸光度值，吸收波長設(shè)置為510 nm，然后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線橫坐標(biāo)為蘆丁濃度（C），縱坐標(biāo)為吸光度值（Abs）。精確移取5 mL牡丹葉樣品溶液，按總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線建立的方法平行試驗三次取其平均值，并計算牡丹葉提取物中總黃酮的含量。

1.4.2 總酚含量

將牡丹葉提取物濃度制備成0.100 mg/mL的溶液，沒食子酸制備成濃度為0.500 mg/mL的溶液。取沒食子酸溶液0.200 mL、0.400 mL、0.600 mL、0.800 mL、1.000 mL和1.200 mL于25 mL容量瓶中，并用蒸餾水定容。分別取1 mL不同濃度的沒食子酸溶液，先加5 mL蒸餾水，再加入福林試劑2 mL，然后在避光條件下放5 min，然后在避光下繼續(xù)加10% Na2CO3 溶液4 mL，放置2 h。最后將上述溶液用紫外分光光度計測定其吸光度值，其波長設(shè)置為765 nm，然后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的橫坐標(biāo)為沒食子酸濃度，縱坐標(biāo)為吸光度值。準(zhǔn)確移取1 mL牡丹葉樣品溶液，按總酚酸標(biāo)準(zhǔn)曲線建立的方法平行試驗三次取其平均值，并計算牡丹葉中總酚酸的含量。

1.5 牡丹葉提取物協(xié)同羧甲基殼聚糖體外抗菌活性實驗

1.5.1 懸菌液的制備

用無菌接種環(huán)分別挑取金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的菌落，并接種在4 mL滅菌的液體培養(yǎng)基中，將菌種分散均勻，然后置于37 ℃的恒溫?fù)u床中，200 r/min振蕩6 h，備用。隨后取滅菌的EP管，逐級稀釋，然后各取2 mL稀釋的不同菌液，在紫外分光光度計下600 nm波長處測試細(xì)菌懸液的OD值，根據(jù)OD值擬合曲線，得出細(xì)菌懸液的濃度。

1.5.2 最低抑菌濃度測定（Minimun inhibitory concentration，MIC）

采用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)液稀釋法測定樣品，本實驗主要用大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌進(jìn)行PLE提取物協(xié)同CMCS進(jìn)行體外抗菌活性試驗，用PLE協(xié)同海藻酸鈉和PLE協(xié)同明膠作為對照。首先用無菌接種環(huán)分別挑取金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的菌落，并接種在4 mL滅菌的液體培養(yǎng)基中，將菌種分散均勻，然后置于37 ℃的200 r/min恒溫?fù)u床中搖至108 CFU/mL，然后稀釋至104 CFU/mL。96孔板第1孔為陰性對照—200 μL液體培養(yǎng)液；96孔板第2～11孔為200 μL抗菌藥物，從上到下依次倍比稀釋；96孔板第12孔為陽性對照—200 μL抗菌藥物。然后將96孔板置于37 ℃的培養(yǎng)箱中18 h，測定該樣品的最低抑菌濃度（MIC）。

1.5.3 最低殺菌濃度測定（Minimum bactericidal concentration，MBC）

分別取各樣品的MIC、2倍MIC、4倍MIC及8倍MIC溶液各10 μL，于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上劃線。放置一段時間后將平板倒置轉(zhuǎn)移到恒溫培養(yǎng)箱中，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，每個濃度重復(fù)3次，無菌落形成的最小濃度即為該種藥物的最低殺菌濃度（MBC）測定。

1.5.4 抑菌濃度指數(shù)（FICI）的測定

以PLE與CMCS的聯(lián)合藥敏試驗為例：分別配制2、1、1/2、1/4、1/8和1/16倍MIC的PLE與CMCS溶液。將96孔板以橫行方式每孔滴加不同質(zhì)量濃度的CMCS溶液各25 μL，以縱列方式在每孔中滴加不同濃度的PLE100 μL，再分別加入菌液100 μL，進(jìn)行6×6棋盤試驗，在每橫行孔中CMCS的濃度依次遞減，而PLE濃度保持不變；在每縱列孔中PLE的濃度依次遞減，而CMCS濃度保持不變。吹打混勻后，將96孔板轉(zhuǎn)移到恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)18～24 h。每種樣品行3次重復(fù)。PLE與明膠和海藻酸鈉的聯(lián)合藥敏試驗參照上述方法操作。以部分抑菌濃度指數(shù)（FICI）作為聯(lián)合藥敏試驗效果的判斷依據(jù)，計算公式如下：

2 結(jié)果與討論

2.1 UPLC測定牡丹葉提取物主要有效成分含量

2.1.1 色譜圖分析

利用沒食子酸、芍藥苷、山奈素、槲皮素和異鼠李素的標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)合文獻(xiàn)中牡丹葉提取物的主要化學(xué)成分指紋圖譜分析[1]，確定了牡丹葉提取物UPLC圖譜中的5個主要有效成分色譜峰。結(jié)果如圖1，牡丹葉提取物中沒食子酸、芍藥苷、山奈素、槲皮素和異鼠李素的含量分別為6.114±0.200%、3.983± 0.100%、2.173±0.100%、3.192±0.100%和2.017± 0.100 %。

2.1.2 系統(tǒng)適用性實驗

通過對牡丹葉提取物系統(tǒng)適用性實驗，得出沒食子酸、芍藥苷、山奈素、槲皮素和異鼠李素的出峰時間分別在7.55 min、24.32 min、64.13 min、70.01 min和70.87 min。5種組分的色譜峰與相鄰組分峰的分離度均大于 1.5，理論板數(shù)均大于6000。

2.1.3 線性關(guān)系

通過對沒食子酸、芍藥苷、山奈素、槲皮素和異鼠李素濃度梯度的測定，分別做標(biāo)準(zhǔn)曲線，如表1所示，R2均在0.999以上，其線性關(guān)系均良好。

2.1.4 穩(wěn)定性實驗

通過對供試品制備0、4 h、8 h、12 h和24 h后的樣品進(jìn)樣測定，參照沒食子酸、芍藥苷、山奈素、槲皮素和異鼠李素的峰，計算得出各標(biāo)準(zhǔn)品出峰的保留時間和相對峰面積的RSD，均小于2.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5 精密度測定

精密度測定結(jié)果顯示，沒食子酸、芍藥苷、山奈素、槲皮素和異鼠李素的峰面積RSD（n=6）分別為 0.300%、0.600%、0.300%、0.400%和0.500%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗

通過對牡丹葉提取物多份測定，結(jié)果沒食子酸、芍藥苷、山奈素、槲皮素和異鼠李素含量的平均值（n=6）分別為6.114%、3.983%、2.173%、3.192%和2.018%，RSD 分別為 0.200%、0.900%、0.700%、0.500%和0.400%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 加樣回收率

通過對加樣回收供試品溶液的測定得出沒食子酸、芍藥苷、山奈素、槲皮素和異鼠李素的回收率 分別為93.370%、95.580%、93.890%、96.660%和95.380%，RSD分別為1.480%、2.120%、1.780%、1.420%和1.430%，表明方法準(zhǔn)確性良好。

2.1.8 牡丹葉提取物中5種成分的含量

采用高效液相色譜法測定PLE中黃酮類和多酚類成分的含量，如圖1，選用沒食子酸、芍藥苷、山奈素、槲皮素和異鼠李素等5個標(biāo)準(zhǔn)品來測定其在PLE中的含量，得出結(jié)果其在PLE中的含量分別為6.114 ± 0.200%、3.983 ± 0.100%、2.173 ± 0.100%、3.192 ± 0.100%和2.017 ± 0.100 %。

2.2 總黃酮和總多酚含量測定

牡丹葉中含有豐富的黃酮類和多酚類成分，研究報道，植物自身含有的總黃酮和總多酚成分在抗氧化活性中起著很重要的作用[3]。牡丹中主要起抗菌和抗氧化作用的是多酚和黃酮[22]。本研究中采用了紫外分光光度計來測定PLE中總黃酮和總多酚的含量，測得結(jié)果其中總黃酮含量為177.819 mg/g，總多酚含量為649.942 mg/g。表明牡丹葉提取物中占比最大的是多酚類成分，植物中許多多酚類成分均有抑制菌種生長的作用，為研究牡丹葉提取物的抗菌活性奠定了基礎(chǔ)。

2.3 牡丹葉提取物協(xié)同羧甲基殼聚糖體外抗菌活性實驗

2.3.1 PLE與CMCS、海藻酸鈉和明膠單獨使用時MIC與MBC的測定

本研究測定了PLE、CMCS、海藻酸鈉和明膠單獨使用時的MIC與MBC，其結(jié)果顯示他們對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌均起到抑制或殺滅作用，如表2所示，PLE對金黃色葡萄球菌的MIC和MBC分別為0.313 mg/mL和1.250 mg/mL，對大腸埃希菌的MIC和MBC分別為0.625 mg/mL和1.250 mg/mL。抑制效果均較好。CMCS對金黃色葡萄球菌的MIC和MBC分別為3.125 mg/mL和25.000 mg/mL，對大腸埃希菌的MIC和MBC則為1.563 mg/mL和12.500 mg/mL，抑制效果相對較弱。海藻酸鈉對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的MIC和MBC分別為3.125 mg/mL和25.000 mg/mL、3.125 mg/mL和12.500 mg/mL，抑制效果較弱。明膠對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的MIC和MBC分別為12.500 mg/mL、50.000 mg/mL、3.125 mg/mL和25.000 mg/mL，抑制效果弱。

2.3.2 PLE與CMCS、海藻酸鈉和明膠的聯(lián)合藥敏試驗

本研究通過對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的抗菌性能測試來測定牡丹葉提取物和羧甲基殼聚糖的相互作用，把PLE協(xié)同海藻酸鈉或協(xié)同明膠來作為對比突出PLE協(xié)同CMCS的抑菌效果。聯(lián)合多藥治療被認(rèn)為是解決多種菌的耐藥性問題的有效方法，由于反復(fù)用藥導(dǎo)致一些菌株對單一抗菌藥物不敏感，因此聯(lián)合多種藥物產(chǎn)生協(xié)同作用是治療這些耐藥菌引起的疾病的有效方法。如表3所示，PLE與CMCS對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的抑菌效果均表現(xiàn)為協(xié)同作用，其FICI值均小于0.500，表明PLE與CMCS之間的協(xié)同作用較強(qiáng)。從表4中可看出，PLE與海藻酸鈉對金黃色葡萄球菌的抑菌效果表現(xiàn)為部分協(xié)同作用，其FICI值為1.000；而PLE與海藻酸鈉對大腸埃希菌的抑菌效果表現(xiàn)為無關(guān)作用，其FICI值為1.250（在1.000到1.500之間），表明PLE與海藻酸鈉之間的協(xié)同作用弱。PLE與明膠的抑菌效果可從表5中顯示出其協(xié)同作用較弱，PLE與明膠對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的抑菌效果均表現(xiàn)為無關(guān)作用，其FICI為0.750（在0.500和1之間）。綜上所述，經(jīng)過對比PLE與CMCS之間的協(xié)同作用較強(qiáng)，抑菌效果更好。

3 結(jié)論

本研究采用高效液相色譜法測定了用甲醇提取的牡丹葉提取物中5種黃酮類和多酚類成分的含量，結(jié)果表示，PLE中沒食子酸、芍藥苷、槲皮素、山奈素和異鼠李素的含量分別為6.114 ± 0.200%、3.983 ± 0.100%、2.173 ± 0.100%、3.192 ± 0.100%和2.017 ± 0.100 %；表明PLE中有沒食子酸、芍藥苷、槲皮素、山奈素和異鼠李素，并且含量均不低。同時用紫外分光光度計測定了牡丹葉提取物中總黃酮和總多酚的含量，結(jié)果表示PLE中總多酚含量高于總黃酮，總多酚含量達(dá)到64.990%，而總黃酮含量只有17.780%。表明牡丹葉提取物中占比最大的是多酚類成分，植物中許多多酚類成分均有抑制細(xì)菌生長的作用，為牡丹葉提取物的抗菌活性奠定了基礎(chǔ)。通過研究PLE協(xié)同CMCS的體外抗菌活性，同時測定PLE協(xié)同海藻酸鈉和PLE協(xié)同明膠的抑菌活性，試驗菌株選用了大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌，結(jié)果顯示，PLE與海藻酸鈉之間為相加作用和無關(guān)作用，其對金黃色葡萄球菌的抑菌效果表現(xiàn)為相加作用，對大腸埃希菌的抑菌效果顯示為無關(guān)作用；PLE與明膠之間為相加作用，其對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的抑菌效果均表現(xiàn)為相加作用；而PLE與CMCS對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的抑菌效果均表現(xiàn)為協(xié)同作用，其FICI值均小于0.500，表明牡丹葉提取物與羧甲基殼聚糖之間的協(xié)同作用相對較強(qiáng)。綜上所述，PLE對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌均有抑菌作用，并且與CMCS聯(lián)用對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌等常見致病菌表現(xiàn)為較強(qiáng)的協(xié)同作用。表明PLE聯(lián)合CMCS有望成為抗生素的替代品。

參 考 文 獻(xiàn)

包雅婷， 王玥， 任曉東， 等. 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的紫斑牡丹花、葉抗菌活性和作用機(jī)制研究 [J].中國中藥雜志， 2018， 43（04）：779-785.

戴道馨， 馬曉瑜， 鮑熹珺. 牡丹提取物的化學(xué)組成及護(hù)膚功效研究進(jìn)展[J].上海輕工業(yè)， 2023， 4：107-110.

包雅婷. 紫斑牡丹花、葉抗氧化與抗菌活性的研究[D]. 成都：西南民族大學(xué)， 2018.

蔡亞啟， 包雅婷， 王虹巾， 等. 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的牡丹屬抗流感病毒的作用機(jī)制研究[J]. 中國中藥雜志， 2018， 43（07）： 1476-1483.

孫澤飛. 牡丹花類黃酮成分及抗氧化能力分析[D]. 咸陽：西北農(nóng)林科技大學(xué)， 2015.

He J， Ye G， Ma H， et al. Multifunctional bletilla striata polysaccharide/copper/peony leaf sponge for the full-stage wound healing[J]. Int J Biol Macromol， 2023， 240： 124487.

Ma J， Ye G， Jia S， et al. Preparation of chitosan/peony （Paeonia suffruticosa Andr.） leaf extract composite film and its application in sustainable active food packaging[J]. Int J Biol Macromol， ， 2022， 222： 2200-2211.

Ye G， Jimo R， Lu Y， et al. Multifunctional natural microneedles based methacrylated Bletilla striata polysaccharide for repairing chronic wounds with bacterial infections[J]. Int J Biol Macromol， 2024， 254： 127914.

韓晉輝， 翟培， 呂文平， 等. 雜合抗菌肽KL-21與抗生素體外協(xié)同抗菌效果研究[J/OL].飼料工業(yè)：1-7[2024-03-06]. http： //kns. cnki. net/kcms/detail/21. 1169. S. 20240226. 1449. 023.

蔣毅， 張華， 史敏晶， 等. 色季拉山蒲公英屬總黃酮及糖分含量種間差異及隨海拔和坡向的變化[J/OL].西北植物學(xué)報， [2024-05-07]. http：//kns. cnki. net/kcms/detail/61. 1091. q. 20240428. 1224. 024. html.

Taubner T， Marounek M， Synytsya A. Preparation and characterization of hydrophobic and hydrophilic amidated derivatives of carboxymethyl chitosan and carboxymethyl β-glucan[J]. Int J Biol Macromol， 2020， 163： 1433-1443.

Shariatinia Z. Carboxymethyl chitosan： Properties and biomedical applications[J]. Int J Biol Macromol， 2018， 120： 1406-1419.

Suneetha M， Zo S， Choi S M， et al. Antibacterial， biocompatible， hemostatic， and tissue adhesive hydrogels based on fungal-derived carboxymethyl chitosan-reduced graphene oxide-polydopamine for wound healing applications[J]. Int J Biol Macromol， 2023， 241： 124641.

Kurniasih M， Purwati， Cahyati T， et al. Carboxymethyl chitosan as an antifungal agent on gauze[J]. Int J Biol Macromol， 2018， 119： 166-171.

Jing H， Huang X， Du X， et al. Facile synthesis of pH-responsive sodium alginate/carboxymethyl chitosan hydrogel beads promoted by hydrogen bond[J]. Carbohydrate Polymers， 2022， 278： 118993.

Guo Y， Zhao C， Yan C， et al. Construction of cellulose/carboxymethyl chitosan hydrogels for potential wound dressing application[J]. Cellulose， 2021， 28（15）： 10013-10023.

Wang J， Wei J. Facile synthesis of Zr （Ⅳ）-crosslinked carboxymethyl cellulose/ carboxymethyl chitosan hydrogel using PEG as pore-forming agent for enhanced phosphate removal[J]. Int J Biol Macromol， 2021， 176： 558-566.

苗潤澤， 王松禹， 高上， 等. 殼寡糖與五種抗生素對常見致病菌的體外協(xié)同抑菌效果研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)， 2023（24）： 101-105+112.

鐘春， 黃遠(yuǎn)虹， 張裕芳， 等. 白藜蘆醇協(xié)同多黏菌素B對碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細(xì)菌的體外抗菌活性研究[J].臨床醫(yī)藥實踐， 2023， 32（11）： 834-837.

文隨方， 朱峰. HPLC測定依折麥布辛伐他汀片中6-氧代辛伐他汀含量[J].國外醫(yī)藥（抗生素分冊），2021，42（01）：59-61+65.

賈安， 黃小強(qiáng)， 茹國華， 等. HPLC-MS/MS法同時測定膽木不同部位6個成分的含量[J/OL].中藥材， 2024（02）： 398-402[2024-03-21]. https： //doi. org/10. 13863/j. issn1001-4454. 2024. 02. 022.

彭騰騰， 范彬， 石曉峰， 等. 紫斑牡丹的化學(xué)成分、活性與開發(fā)利用研究進(jìn)展[J/OL].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)：1-23[2024-05-06]. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/51.1335.q.20230824.1120.006.html.