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    HPLC法測(cè)定彝藥火把花根中雷公藤甲素的含量

    2016-12-26 14:11郭菊玲楊勇幫蔣春艷
    云南中醫(yī)中藥雜志 2016年11期
    關(guān)鍵詞:含量測(cè)定

    郭菊玲++楊勇幫++蔣春艷

    摘要:目的建立系統(tǒng)、科學(xué)的火把花根中雷公藤甲素的提取和含量測(cè)定的方法,為科學(xué)評(píng)價(jià)和有效控制火把花根的質(zhì)量提供了可靠的方法。 方法采用高效液相色譜法,色譜柱為Agilent Venusil PLOW-C18柱(4.6×150 mm,5 um);流動(dòng)相為水-甲醇;流速為1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為217 nm;柱溫為35℃。 結(jié)果火把花根中雷公藤甲素的峰得到有效的分離,HPLC檢測(cè)條件、方法的專屬性、線性、重復(fù)性、精密度、穩(wěn)定性、回收率良好,該方法可以用于雷公藤甲素的含量測(cè)定。 結(jié)論該方法對(duì)今后的火把花根的質(zhì)量控制和科學(xué)評(píng)價(jià)提供了參考依據(jù)。

    關(guān)鍵詞:火把花根;雷公藤甲素;HPLC;含量測(cè)定

    中圖分類號(hào):R284文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A文章編號(hào):1007-2349(2016)11-0071-04

    火把花根又名昆明山海棠[Tripterygium hypoglaucum(Levl.)Hutch.]是衛(wèi)矛科(Celastraceae)雷公藤屬[Tripterygium Wilfodii(Hook.)f.]落葉披散或蔓狀灌木植物,又名雷公藤、斷腸草、紫金皮、掉毛草、六方藤等。生長(zhǎng)于向陽(yáng)山坡、路邊或灌木叢中,通常作為藥用的部位為根和皮,昆明山海棠為中國(guó)特有的植物,民間藥用中草藥。主要分布于我國(guó)的西南地區(qū),云南省境內(nèi)尤為多見(jiàn),主要集中分布于昆明、楚雄、紅河、玉溪等地?;鸢鸦ǜ驼Z(yǔ)為“一姑妹班”、“多爭(zhēng)唯”意譯為“開(kāi)花像火把樣通紅的植物。在西南地區(qū)彝族藥用歷史悠久。主要用于治療慢性腎炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡等?;鸢鸦ㄒ幻驾d于《本草綱目》,李時(shí)珍集解曰:“生滇南者花紅,呼為火把花。[1]昆明山海棠有效成分研究多有報(bào)道,但是其含量測(cè)定研究少見(jiàn)?;鸢鸦ǜ幉氖蛰d于《云南省藥品標(biāo)準(zhǔn)》(1974年)、《云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》第二冊(cè)·彝族藥(2005年)?,F(xiàn)行《中國(guó)藥典》收載的昆明山海棠片以重量法進(jìn)行含量測(cè)定,且測(cè)定方法相對(duì)簡(jiǎn)單,檢驗(yàn)靈敏度、重現(xiàn)性還有待提高[2]。上述標(biāo)準(zhǔn)中均無(wú)火把花根藥材的含量測(cè)定項(xiàng)目,有必要對(duì)此項(xiàng)目進(jìn)行研究。

    火把花的化學(xué)成分較為復(fù)雜,長(zhǎng)期研究發(fā)現(xiàn)火把花中含有生物堿類雷公藤堿(wilfordie)、雷公藤次堿(wilfori)、雷公藤甲素(Triphonide)等,其中最主要的活性成分為雷公藤甲素。[3]雷公藤甲素為環(huán)氧二萜類內(nèi)脂化合物,其藥理作用為:抗排斥作用、抗腫瘤作用、抗生育作用等。[4]雷公藤甲素有較強(qiáng)的抗腫瘤活性,并具有廣譜、高效等特點(diǎn),可以用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性關(guān)節(jié)炎等多種自身免疫疾病和炎性疾病的治療。[5]目前,對(duì)于火把花根中的雷公藤甲素的含量測(cè)定方法已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道,但是由于研究的方法不夠完善和統(tǒng)一,得出的結(jié)果差異性較大。因此,本次研究在現(xiàn)有的火把花根中雷公藤甲素的含量測(cè)定的基礎(chǔ)上,運(yùn)用HPLC色譜法,對(duì)火把花根藥材進(jìn)行了一系列的試驗(yàn),建立了一個(gè)對(duì)火把花根中雷公藤甲素進(jìn)行含量測(cè)定的方法,為以后科學(xué)評(píng)價(jià)和有效控制雷公藤藥材的質(zhì)量提供了可靠的科學(xué)依據(jù)。

    1儀器與試藥

    1.1儀器安捷倫1100高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司真空在線脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、UV檢測(cè)器),賽多利斯BSA224S-CW電子天平,賽多利斯BP211D電子天平,DHG-9104型鼓風(fēng)干燥箱,KQ-500E型超聲波清洗器,YS-04A小型高效粉碎機(jī),Agilent Cary 60 UV-Vis紫外分光光度儀。

    1.2試藥雷公藤甲素對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院)批號(hào)為:111567-201404,標(biāo)示量為:99.8%;分析純:甲醇(四川西隴化工有限公司)、三氯甲烷(四川西隴化工有限公司)、乙醚(四川西隴化工有限公司)、乙酸乙酯(四川西隴化工有限公司)、中性氧化鋁(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,200-300目),批號(hào)為:20130328色譜純?yōu)榧状迹ǖ聡?guó)默克試劑公司);水為超純水。

    2方法與結(jié)果

    2.1薄層色譜鑒別取本品粉末約5 g,加80%甲醇30 mL,超聲30 min,放冷至室溫,濾過(guò),取濾液。濾液加三氯甲烷振搖提取3次,每次15 mL,合并三氯甲烷液,并將濾液低溫蒸干。殘?jiān)?ml甲醇完全溶解后用含5 g中性氧化鋁的洗脫柱(內(nèi)徑為1.2 cm,200目),洗脫液為甲醇:乙酸乙酯:乙醚=1:2;1 60 mL進(jìn)行洗脫至無(wú)色,蒸干洗脫液,殘?jiān)? mL甲醇溶解作為供試品溶液。另取雷公藤甲素對(duì)照品,加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液,作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0502)試驗(yàn),吸取上述兩種溶液各10 uL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以三氯甲烷—乙醚(2:1)為展開(kāi)劑,展開(kāi),取出,晾干,噴以2%3,5—二硝基苯甲酸乙醇溶液與2mol/l氫氧化鈉乙醇液的混合液(臨用前按1:3混合)作為顯色劑,噴霧顯色,自然光下檢視。供試品色譜中,在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn)。

    2.2檢測(cè)波長(zhǎng)的確定取雷公藤甲素對(duì)照品適量,精密稱定,加甲醇溶解制成每1 mL含0.2 mg的溶液,作為雷公藤甲素對(duì)照品溶液。取雷公藤甲素對(duì)照品溶液經(jīng)紫外分光光度儀進(jìn)行波長(zhǎng)掃描,最大吸收波長(zhǎng)為217 nm。結(jié)果如圖1,由圖1可知,雷公藤甲素的檢測(cè)波長(zhǎng)為217 nm。圖1雷公藤的全波長(zhǎng)掃描圖譜

    2.3色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性色譜柱:Agilent Venusil PLOW-C18柱(4.6×150 mm,5 um);流動(dòng)相:甲醇-水(40:60)檢測(cè)波長(zhǎng):217 nm柱溫:35℃;流速:1 mL/min;進(jìn)樣:10 uL;分析時(shí)間:40 min。

    2.4溶液的制備

    2.4.1對(duì)照品溶液的制備對(duì)照品溶液制備:取雷公藤甲素對(duì)照品適量,精密稱定,加甲醇溶解制成每1 mL含0.2 mg的溶液,即得。

    2.4.2供試品溶液的制備供試品溶液的制備:取本品粉末(過(guò)三號(hào)篩)約5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇30 mL,稱定重量,超聲處理(功率250W,頻率50kHz)30 min,放冷,再稱定重量,用甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過(guò),濾液移置分液漏斗中,加水7 mL,用氯仿振搖提取3次,每次15 mL,合并氯仿液,蒸干,殘?jiān)D(zhuǎn)移至中性氧化鋁柱用60 mL洗脫液進(jìn)行洗脫(中性氧化鋁:5 g;洗脫柱內(nèi)徑:1.2 cm;洗脫液體積:60 mL;洗脫液:甲醇-乙酸乙酯-乙醚=1∶2∶1),收集洗脫液,蒸干,殘?jiān)眉状既芙?,轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。

    2.5方法學(xué)考察

    2.5.1專屬性考察在檢測(cè)波長(zhǎng):217 nm;柱溫:35℃;進(jìn)樣量:10 uL;流動(dòng)相:甲醇-水(40:60);的HPLC色譜條件下,將雷公藤甲素對(duì)照品溶液、樣品溶液進(jìn)行HPLC分析,得到相應(yīng)的色譜圖。結(jié)果如圖2所示,對(duì)照品的保留時(shí)間與樣品的保留時(shí)間一致,說(shuō)明該檢測(cè)條件、方法專屬性良好。圖2雷公藤樣品圖譜

    2.5.2線性關(guān)系考察取雷公藤甲素對(duì)照品,分別配制成濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL的對(duì)照品溶液,進(jìn)行高效液相色譜分析,以進(jìn)樣濃度(mg/ml)為橫坐標(biāo),峰面積(mAU*s)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程:Y=20507X-6.3579,R2=0.9999,結(jié)果見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在進(jìn)樣濃度為0.01mg/ml~0.06mg/ml的范圍內(nèi),線性關(guān)系良好。

    2.5.3重復(fù)性考察按照供試品溶液的制備方法重復(fù)處理六份供試品溶液,進(jìn)樣10 uL,進(jìn)行高效液相色譜法檢測(cè),并記錄雷公藤甲素的峰面積,結(jié)果見(jiàn)表2,由檢測(cè)結(jié)果可知RSD%<3%,表明高效液相色譜法檢測(cè)條件、方法的精密度良好,可用于雷公藤甲素的含量測(cè)定。

    2.5.4精密度考察精密吸取同一對(duì)照品溶液,進(jìn)樣10 uL,平行進(jìn)樣5次,記錄雷公藤甲素色譜峰的峰面積,計(jì)算RSD%值。結(jié)果見(jiàn)表3,可知RSD%<3%,表明HPLC檢測(cè)條件、方法的精密度良好,可用于雷公藤甲素的含量測(cè)定。

    2.5.5穩(wěn)定性考察取同一供試品溶液,分別在0、2、4、6、8、10、12、18、20、24 h進(jìn)樣10 uL,并記錄雷公藤甲素的峰面積,帶入Y=20507X-6.3579,R2=0.9999計(jì)算含量,計(jì)算RSD%值為1.74%,結(jié)果顯示此方法樣品24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    2.5.6回收率試驗(yàn)分別精密稱取已知含量(0.0186 mg/g)的供試品3個(gè)重量梯度共6份,分為3組,每組兩份,配制一個(gè)濃度(0.02 mg/mL)的雷公藤甲素對(duì)照品溶液,分別向樣品溶液中加入3.4 mL、4.65 mL、5.6 mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。將上述6份樣品分別樣品分別進(jìn)樣10 μL進(jìn)行HPLC分析,測(cè)定雷公藤甲素的峰面積,計(jì)算相應(yīng)回收率及RSD%值。結(jié)果為:平均回收率為98.9%,RSD%為1.80%,表明該HPLC檢測(cè)條件、方法的可靠性強(qiáng)。結(jié)果見(jiàn)表5。

    3討論

    (1)火把花根的化學(xué)成分復(fù)雜,而且雷公藤甲素的本身含量極低,用普通的提取方法很難將雷公藤甲素從火把花根中提取出來(lái),大量文獻(xiàn)報(bào)道的測(cè)定方法很少有給出色譜圖,有色譜圖的雷公藤甲素的峰面積較小且分離度不夠,本次研究通過(guò)大量的試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)用氯仿萃取后通過(guò)中性氧化鋁柱層析,加洗脫液進(jìn)行洗脫后,雷公藤中雷公藤甲素的得到了很好的分離。調(diào)整洗脫液的用量,雷公藤甲素洗脫完全,雷公藤甲素的含量也明顯增加。此次研究反復(fù)多次對(duì)樣品前處理方法進(jìn)行來(lái)探索,為使用HPLC法測(cè)定火把花根中雷公藤甲素的含量打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。該含量測(cè)定方法對(duì)今后的火把花根的質(zhì)量控制和科學(xué)評(píng)價(jià)提供了參考依據(jù)。

    (2)含量測(cè)定方法確立的過(guò)程中,樣品前處理至關(guān)重要。前期薄層色譜篩查的時(shí)候,因?yàn)闃悠分欣坠偌姿睾亢艿?,但其又是藥理活性成分。所以選其為質(zhì)控目標(biāo)物??v觀整個(gè)樣品處理過(guò)程對(duì)藥品企業(yè)藥品生產(chǎn)工藝有實(shí)際指導(dǎo)意義。民族民間使用火把花根大多以酊劑,以用乙醇溶液浸泡的形式出現(xiàn),藥效顯著;使用湯劑的很少。本次研究中,也用過(guò)水以及不同的甲醇溶液進(jìn)行提取。最終發(fā)現(xiàn)用甲醇提取時(shí),雷公藤甲素的提取效率最大。這就提醒我們從事傳統(tǒng)民族民間藥物的現(xiàn)代工藝開(kāi)發(fā)研究一定要尊重傳統(tǒng)民間醫(yī)藥的用藥習(xí)慣,才能有的放矢。才能真正推動(dòng)民族藥的發(fā)展。

    參考文獻(xiàn):

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    [2]衛(wèi)生部.中國(guó)藥典[S].北京,化工出版社,2015.1056.

    [3]王賢英、謝香菊、李勝容.中藥材火把花中雷公藤甲素及表兒茶素的含量測(cè)定[J].重慶中草藥研究,2012,1(65):17-21.

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    [5]陳江飛,胡毅堅(jiān),苗彩云.雷公藤甲素藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志,2007,38(8):604-606.

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