痹祺膠囊對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎關(guān)鍵靶點(diǎn)的調(diào)節(jié)作用

韓彥琪 ，宋紫騰 ，姚鵬飛 ，張祥麒，許 浚 ，王 磊，趙專友 ，張鐵軍 *，劉昌孝 *

1.天津藥物研究院 天津市中藥質(zhì)量標(biāo)志物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300462

2.天津藥物研究院 中藥現(xiàn)代制劑與質(zhì)量控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300462

3.天津藥物研究院 藥物成藥性評(píng)價(jià)與系統(tǒng)轉(zhuǎn)化全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300462

4.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617

5.天津達(dá)仁堂京萬(wàn)紅藥業(yè)有限公司，天津 300112

6.津藥達(dá)仁堂集團(tuán)股份有限公司，天津 300193

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性、系統(tǒng)性、炎癥性自身免疫性疾病，屬于中醫(yī)“痹?。ㄗC）”范疇。主要表現(xiàn)為對(duì)稱性、慢性、進(jìn)行性多關(guān)節(jié)炎。RA 的基本病理特征是滑膜炎癥，由于關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞增生，形成血管翳，進(jìn)而侵犯關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨、韌帶和肌鍵等，造成關(guān)節(jié)軟骨、骨關(guān)節(jié)囊破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失，嚴(yán)重時(shí)甚至可致殘疾，對(duì)患者的生活造成不利影響。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，RA 患者伴有炎癥、血瘀、軟骨損傷等癥狀[1]。

痹祺膠囊由馬錢子、地龍、黨參、茯苓、白術(shù)、川芎、丹參、三七、牛膝、甘草10 味藥材組成，具有益氣養(yǎng)血、祛風(fēng)除濕、活血止痛的功效。臨床研究表明，痹祺膠囊對(duì)RA 具有顯著的治療效果[2-5]，但對(duì)其作用機(jī)制的研究還不全面。為探究痹祺膠囊的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)并明晰其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究在前期化學(xué)物質(zhì)組、血中移行成分[6]及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究的基礎(chǔ)上并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，選取了10 味藥材中各結(jié)構(gòu)類型的主要代表性成分共19 個(gè)化合物為研究對(duì)象，同時(shí)以與抑制滑膜炎癥相關(guān)的受體[環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）、一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、趨化因子受體4（C-C chemokine receptor type 4，CCR4）]，與活血相關(guān)的受體[凝血酶、磷酸二酯酶（ cGMP-inhibited 3′,5′-cyclic phosphodiesterase，PDE3A）、腎上腺素受體 α1（alpha-1A adrenergic receptor，ADRA1A）]，與抑制血管翳生成相關(guān)的受體[血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（vascular endothelial growth factor receptor 2，

VEGFR2/KDR）]，以及與抑制基質(zhì)降解相關(guān)的受體基質(zhì)金屬蛋白酶-3（matrix metalloproteinase-3，MMP-3）9 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)為研究載體，通過運(yùn)用胞內(nèi)鈣離子熒光檢測(cè)和酶抑制劑檢測(cè)技術(shù)評(píng)價(jià)痹祺膠囊中19 個(gè)主要單體成分對(duì)9 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)的抑制活性。

1 材料

1.1 藥品與試劑

QUANTI-Blue?檢測(cè)試劑（批號(hào)QBS-4222）、丙磺舒（批號(hào)2157171）購(gòu)自美國(guó)InvivoGen 公司；細(xì)胞活力熒光檢測(cè)試劑盒（批號(hào)0000424721）購(gòu)自美國(guó)Promega 公司；G418（批號(hào)2121442）購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；星形孢菌素（批號(hào)S142105）購(gòu)自Selleckchem 公司；Fluo-4 Direct 試劑盒（批號(hào)2325989）、HBSS（批號(hào)2193007）、HEPES（批號(hào)2192573）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；人凝血酶（批號(hào) F1900752 ）、BIOPHEN CS-11(38) （ 批號(hào)F2000197）購(gòu)自HYPHEN BioMed 公司；KDR（批號(hào)07CBS-0540）購(gòu)自Carna 公司；Peptide FAM-P22 GL（批號(hào)P180116-MJ112393）購(gòu)自Biochem 公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA，批號(hào)WXBD820V4）、阿加曲班（批號(hào)141396-28-3）、腎上腺素（批號(hào) WXBD1853V）、WB4101（批號(hào)117H46492）、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP，批號(hào) 987-65-5）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批號(hào)474382）、EDTA（批號(hào)60-00-4）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；FLIPR?Calcium 4 assay kit（批號(hào)3233461）、IMAP FP IPP Explorer Kit（批號(hào)MD167386）、羧基熒光素標(biāo)記的環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP，批號(hào)2873747）購(gòu)自Molecular Devices 公司；PDE3A（批號(hào)110802HEGE）購(gòu)自BPS 公司；Dipyridamole（批號(hào)15979）購(gòu)自美國(guó)MCE 公司；人TARC/CCL17（批號(hào)M2106001）購(gòu)自Genscrip 公司；C-021（批號(hào)2A/249015）購(gòu)自Tocris 公司；OptiPlate TM-384黑色微孔板（批號(hào) 8240-18341）購(gòu)自美國(guó)PerkinElmer 公司；COX-2 抑制劑檢測(cè)試劑盒（批號(hào)041421210419）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；NOS 抑制劑檢測(cè)試劑盒（批號(hào)7G26K02080）購(gòu)自BioVision 公司；MMP-3 抑制劑檢測(cè)試劑盒（批號(hào)GR3381906-1）購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；19 個(gè)單體化合物信息見表1。

表1 19 個(gè)單體化合物信息Table 1 Information of 19 monomer compounds

1.2 細(xì)胞

HEK-Dual? TNF-α 細(xì)胞、穩(wěn)定表達(dá)CCR4 受體的HEK293 細(xì)胞購(gòu)自上海藥明康德新藥開發(fā)有限公司；穩(wěn)定表達(dá)ADRA1A 受體的CHO-K1 細(xì)胞購(gòu)自上海睿智化學(xué)研究有限公司。

1.3 儀器

FlexStation 3 型多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices 公司）；TC20 型細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；CKX41SF 型倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；Echo550 型超聲波納升液體處理系統(tǒng)（美國(guó)Labcyte 公司）；EZ Reader II 型激酶檢測(cè)儀/微流控系統(tǒng)（美國(guó)Perkin Elmer 公司）；AllegraTM25R 型離心機(jī)（美國(guó)Beckman 公司）；3111 型CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo 公司）。

2 方法

2.1 抑制滑膜炎癥相關(guān)靶點(diǎn)抑制實(shí)驗(yàn)

2.1.1 COX-2 抑制活性實(shí)驗(yàn) 取適量待測(cè)樣品，用DMSO 將化合物配制成0.2、2 mmol/L 檢測(cè)濃度的溶液（終濃度為10、100 μmol/L）。以塞來昔布為陽(yáng)性對(duì)照，以100 μmol/L 的起始濃度（終濃度5 μmol/L），在DMSO 中5 倍連續(xù)梯度稀釋8 個(gè)點(diǎn)。按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，計(jì)算每個(gè)樣品的抑制率。

抑制率＝(RFU100%酶活性對(duì)照－RFU樣品)/(RFU100%酶活性對(duì)照－RFU空白對(duì)照)

2.1.2 NOS 抑制活性實(shí)驗(yàn) 取適量待測(cè)樣品，用緩沖液將化合物配制成40、400 μmol/L（終濃度為10、100 μmol/L ），以二苯基氯化碘鹽（diphenyleneiodonium chloride，DPI）為陽(yáng)性對(duì)照，以200 μmol/L 的起始濃度（終濃度50 μmol/L），用緩沖液5 倍連續(xù)梯度稀釋8 個(gè)點(diǎn)。按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，計(jì)算抑制率。

2.1.3 NF-κB 拮抗實(shí)驗(yàn) 將10 μL 終濃度為10、100 μmol/L 的待測(cè)樣品加入到96 孔板，參考化合物腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）最高質(zhì)量濃度為1000 ng/mL，3 倍梯度，共9 個(gè)質(zhì)量濃度，陰性對(duì)照孔（NC）和陽(yáng)性對(duì)照孔（PC）每孔加入10 μL 培養(yǎng)基（DMSO 終體積分?jǐn)?shù)為0.5%）。然后按照5×104個(gè)/孔將80 μL HEK-Dual? TNF-α細(xì)胞接種于已加好待測(cè)樣品的96 孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱共孵育2 h 后，PC 組每孔加入10 μL培養(yǎng)基，其余組每孔加入10 μL 200 ng/mL 的TNFα（終質(zhì)量濃度20 ng/mL），離心后在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱共孵育24 h。每孔取20 μL 細(xì)胞上清，加入含有180 μL QUANTI-Blue?試劑的實(shí)驗(yàn)板中，37 ℃孵育1 h 后，用多功能酶標(biāo)儀SpectraMax M2e 檢測(cè)650 nm 的吸光度（A）值。按照Celltiter-Glo 說明書方法操作，化學(xué)發(fā)光信號(hào)（RLU）用多功能酶標(biāo)儀synergy2 檢測(cè)。

化合物抑制活性＝(A化合物－ANC)/(APC－ANC)

細(xì)胞活性＝RLU化合物/RLUPC

2.1.4 CCR4 拮抗實(shí)驗(yàn) 穩(wěn)定表達(dá)CCR4 受體的HEK293 細(xì)胞（DMEM＋10%胎牛血清、300 μg/mL G418、2 μg/mL BS），以1×106個(gè)/mL 接種于多聚賴氨酸包被的384 孔板，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱孵育過夜。

（1）80%有效濃度（80% effective concentration，EC80）檢測(cè)：去除細(xì)胞板中培養(yǎng)液，每孔加入20 μL檢測(cè)緩沖液（20 mmol/L HEPES、1×HBSS、0.5%BSA），再加入20 μL Fluo-4 檢測(cè)試劑，37 ℃孵育50 min，室溫靜置10 min。將激動(dòng)劑人TARC/CCL17用檢測(cè)緩沖液3 倍稀釋成10 個(gè)濃度并轉(zhuǎn)移到EC80檢測(cè)化合物板中，每孔30 μL（起始濃度為1μmol/L）。啟動(dòng)儀器，從化合物板中轉(zhuǎn)移10 μL 激動(dòng)劑到細(xì)胞板中，讀數(shù)，計(jì)算EC80。

（2）化合物拮抗活性檢測(cè)：將19 個(gè)化合物用DMSO 稀釋為2 mmol/L 溶液（終濃度為10、100 mmol/L），將陽(yáng)性拮抗劑C-021 進(jìn)行3 倍稀釋成10個(gè)濃度（起始終濃度50 mmol/L），用Echo 分別轉(zhuǎn)移900 nL 到CCR4 化合物板中，每孔加入30 mL 檢測(cè)緩沖液。去除細(xì)胞板中培養(yǎng)液，每孔加入20 mL檢測(cè)緩沖液，然后再加入20 mL Fluo-4 檢測(cè)試劑。用FLIPR 轉(zhuǎn)移10 mL 化合物至細(xì)胞板中，37 ℃孵育50 min，室溫靜置10 min。配制CCR4 的EC80并加入到EC80板中，每孔30 mL。從EC80板中轉(zhuǎn)移10 mL 化合物到細(xì)胞板中，讀數(shù)，計(jì)算各化合物抑制率。

抑制率＝100－(RLU－LC)/(DMSO－LC)

RLU 為相對(duì)A值，1 至Maximum allowed 的讀值；DMSO為DMSO 組熒光信號(hào)平均值；LC 為拮抗劑最高濃度點(diǎn)熒光信號(hào)平均值

2.2 抑制血管翳形成相關(guān)靶點(diǎn)抑制實(shí)驗(yàn)

將FAM 標(biāo)記的底物多肽和ATP 加入1 倍激酶緩沖液[（50 mmol/L HEPES、pH 7.5、0.001 5%聚氧乙烯月桂醚-35（Brij-35）]，形成2.5 倍底物溶液。用DMSO 配制19 個(gè)待測(cè)化合物儲(chǔ)液，用激酶緩沖液稀釋成5 倍檢測(cè)濃度（終濃度為10、100 μmol/L）。陽(yáng)性抑制劑星形孢菌素最高檢測(cè)濃度為1 μmol/L，3 倍稀釋，10 個(gè)濃度點(diǎn)。取5 μL 的5 倍濃度陽(yáng)性對(duì)照及待測(cè)樣品到384 孔反應(yīng)板，空白對(duì)照組加5 μL DMSO。加入10 μL 2.5 倍激酶溶液，陰性對(duì)照孔加入等體積1 倍激酶緩沖液，室溫下孵育10 min。加入10 μL 2.5 倍底物溶液，28 ℃孵育60 min 后加入35 μL 終止液終止反應(yīng)。激酶檢測(cè)儀讀取轉(zhuǎn)化率數(shù)據(jù)，計(jì)算抑制率。

2.3 抑制基質(zhì)降解相關(guān)靶點(diǎn)抑制實(shí)驗(yàn)

取適量待測(cè)樣品，用DMSO 將化合物配制成一定濃度的母液，用乙醇稀釋到1、10 mmol/L 檢測(cè)濃度的溶液（終濃度為10、100 μmol/L）。以NNGH 為陽(yáng)性對(duì)照，以1300 μmol/L 的起始濃度（終濃度13 μmol/L），在DMSO 中10 倍連續(xù)梯度稀釋8 個(gè)點(diǎn)。按照試劑盒說明書操作。

2.4 活血作用相關(guān)靶點(diǎn)抑制實(shí)驗(yàn)

2.4.1 凝血酶抑制活性實(shí)驗(yàn) 以阿加曲班為陽(yáng)性對(duì)照，以2 mmol/L的起始濃度（終濃度200 μmol/L），在DMSO 中5 倍連續(xù)梯度稀釋8 個(gè)點(diǎn)，轉(zhuǎn)移6 μL到96 孔反應(yīng)板中；待測(cè)樣品轉(zhuǎn)移6 μL 到反應(yīng)板中，化合物終濃度為10、100 μmol/L，空白對(duì)照孔及100%酶活性對(duì)照孔每孔加入6 μL DMSO。配制含0.05 mol/L Tris buffer、0.3 mol/L NaCl、pH 7.8 的緩沖液，100%酶活性對(duì)照孔、陽(yáng)性對(duì)照組及樣品組各加入42 μL，空白對(duì)照組加入48 μL。用緩沖液將凝血酶（FIIa）稀釋為工作濃度3 NIH/mL（終濃度0.3 NIH/mL），100%酶活性對(duì)照孔、陽(yáng)性對(duì)照組及樣品組各加入6 μL，37 ℃孵育5 min。用緩沖液將底物稀釋為工作質(zhì)量濃度2.5 mg/mL（終質(zhì)量濃度0.25 mg/mL），向每組各加入6 μL，37 ℃孵育5 min，在405 nm 檢測(cè)A值，計(jì)算抑制率。

2.4.2 PDE3A 抑制活性實(shí)驗(yàn) 5 倍反應(yīng)緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl、pH 7.2、10 mmol/L MgCl2、0.05%NaN3、0.01%聚山梨酯-20、1 mmol/L DTT）；反應(yīng)終止液（5 倍IMAP progressive binding A 溶液、5 倍IMAP progressive binding B 溶液、IMAP progressive binding bead）。陽(yáng)性抑制劑曲喹辛最大給藥濃度為0.1 μmol/L，3 倍梯度稀釋，共10 個(gè)給藥濃度，待測(cè)化合物給藥濃度為10、100 μmol/L。

將化合物用DMSO 在Echo384 孔板上稀釋到所需要的濃度，用Echo550 儀器從Echo384 孔板中轉(zhuǎn)移200 nL 樣品到384 反應(yīng)板中，陰性對(duì)照（加酶組）和陽(yáng)性對(duì)照（不加酶組）均轉(zhuǎn)移200 nL 的100%DMSO。將PDE3A 加入1 倍反應(yīng)緩沖液，形成終質(zhì)量濃度為0.075 μg/mL 的2 倍酶溶液。將FAM 標(biāo)記的cGMP 加入1 倍反應(yīng)緩沖液，形成2 倍底物溶液。向384 孔反應(yīng)板孔中加入10 μL 的2 倍酶溶液，對(duì)于無酶活對(duì)照孔，用10 μL 的1 倍反應(yīng)緩沖液替代酶溶液，1000 r/min 離心1 min，室溫下孵育15 min，每孔中加入10 μL 的2 倍底物溶液，1000 r/min離心1 min，室溫反應(yīng)30 min，每孔中加入60 μL 的反應(yīng)終止液終止反應(yīng)，室溫下?lián)u床600 r/min 振蕩避光孵育 60 min。用酶標(biāo)儀讀數(shù)，參數(shù)設(shè)置Ex480/Em535(s)，Em535(p)，計(jì)算抑制率。

2.4.3 ADRA1A 受體拮抗活性實(shí)驗(yàn) 以腎上腺素和WB4101 為陽(yáng)性激動(dòng)化合物和陽(yáng)性拮抗化合物，最高檢測(cè)濃度為4 μmol/L，4 倍稀釋，10 個(gè)濃度點(diǎn)。19 個(gè)化合物用DMSO 配制，最終檢測(cè)濃度為10、100 μmol/L，DMSO 體積分?jǐn)?shù)均未超過0.2%。穩(wěn)定表達(dá)ADRA1A 受體的CHO-K1 細(xì)胞以1.5×104個(gè)/孔接種到384 微孔板，過夜培養(yǎng)后加入20 μL 染料，再加入10 μL 配制好的樣品溶液后在培養(yǎng)箱中孵育1 h，再于室溫平衡15 min。檢測(cè)時(shí)，將細(xì)胞板、陽(yáng)性激動(dòng)劑板放入FLIPR 內(nèi)指定位置，由儀器自動(dòng)加入12.5 μL 的5×EC80濃度的陽(yáng)性激動(dòng)劑，運(yùn)行抑制劑檢測(cè)程序，儀器總體檢測(cè)時(shí)間為120 s，在第21 秒時(shí)自動(dòng)將12.5 μL 陽(yáng)性激動(dòng)劑加入到細(xì)胞板內(nèi)。以1～20 s 的平均熒光強(qiáng)度值作為基線，21～120 s 的最大熒光強(qiáng)度值減去基線值即為相對(duì)熒光強(qiáng)度值（ΔRFU）。

激活率＝(ΔRFU化合物－ΔRFU背景)/(ΔRFUEC100激動(dòng)劑－ΔRFU背景)

抑制率＝1－(ΔRFU化合物－ΔRFU背景)/(ΔRFUEC80激動(dòng)劑－ΔRFU背景)

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 抑制滑膜炎癥相關(guān)靶點(diǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 COX-2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 通過多濃度梯度給藥，得到陽(yáng)性抑制劑塞來昔布對(duì)COX-2 的抑制率曲線（圖1），計(jì)算得到IC50值為10.73 nmol/L。19 個(gè)化合物對(duì)COX-2 抑制活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。由結(jié)果可知，與陰性對(duì)照組比較，丹參素、迷迭香酸、丹酚酸B在10、100 μmol/L 對(duì)該酶抑制率達(dá)80%以上，均有顯著抑制活性（P＜0.001）；藁本內(nèi)酯在10、100 μmol/L 對(duì)該酶也有較顯著抑制作用（P＜0.05、0.001），且都有一定濃度相關(guān)性。人參皂苷Rb1、阿魏酸在100 μmol/L 濃度對(duì)該酶抑制率均在70%以上，丹參酮IIA、黨參炔苷在100 μmol/L 濃度對(duì)該酶抑制率均在50%以上，均有顯著抑制活性（P＜0.001）；士的寧、茯苓酸、牛膝皂苷D 在10、100 μmol/L 對(duì)該酶抑制率在30%，且都具有顯著性差異（P＜0.01、0.001）。

圖1 陽(yáng)性化合物活性曲線 (n = 2)Fig.1 Activity curves of positive compounds (n = 2)

圖2 19 個(gè)化合物對(duì)COX-2 抑制活性 (n = 2)Fig.2 Inhibitory activity of 19 compounds against COX-2 (n = 2)

3.1.2 NOS 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 通過多濃度梯度給藥，得到陽(yáng)性抑制劑DPI 對(duì)NOS 的抑制率曲線（圖1），其IC50為22.68 nmol/L。19 個(gè)化合物對(duì)NOS 抑制活性結(jié)果見圖3。由結(jié)果可知，與陰性對(duì)照組比較，迷迭香酸、丹酚酸B 在10、100 μmol/L 對(duì)NOS 均有顯著抑制活性（P＜0.001），且100 μmol/L 濃度下抑制率達(dá)100%以上，抑制活性最強(qiáng)；人參皂苷Rb1、藁本內(nèi)酯、馬錢子堿、士的寧、黨參炔苷在10、100 μmol/L 均有顯著抑制活性（P＜0.05、0.01、0.001）；丹參素、蛻皮甾酮、甘草苷、茯苓酸、三七皂苷R1、白術(shù)內(nèi)酯III 在100 μmol/L 濃度對(duì)該酶有顯著抑制作用（P＜0.01、0.001）。

圖3 19 個(gè)化合物對(duì)NOS 抑制活性 (n = 2)Fig.3 Inhibitory activity of 19 compounds against NOS (n = 2)

3.1.3 NF-κB 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 通過多濃度梯度給藥，得到陽(yáng)性激動(dòng)劑TNF-α 對(duì)NF-κB 的激動(dòng)結(jié)果及細(xì)胞存活率（圖1），計(jì)算得到EC50為1.33 ng/mL，50%的細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞毒性反應(yīng)的濃度（median cytotoxic concentration，CC50）＞1000 ng/mL。19 個(gè)化合物對(duì)NF-κB 抑制活性及對(duì)細(xì)胞存活率影響見圖4、5。由結(jié)果可知，與陰性對(duì)照組比較，藁本內(nèi)酯、茯苓酸、馬錢子堿在100 μmol/L 對(duì)TNF-α 誘導(dǎo)的NF-κB 均有顯著抑制活性，但結(jié)合細(xì)胞存活率結(jié)果，以上3個(gè)化合物在該濃度下的細(xì)胞存活率分別為67.5%、65.4%、87.0%，均顯示出顯著毒性（P＜0.05、0.001），因此推測(cè)藁本內(nèi)酯、茯苓酸、馬錢子堿對(duì)NF-κB 抑制活性為假陽(yáng)性結(jié)果；丹參素、阿魏酸低、高濃度及丹酚酸B、迷迭香酸、丹參酮IIA、甘草次酸高濃度和藁本內(nèi)酯低濃度對(duì)NF-κB 均有顯著抑制活性（P＜0.05、0.01、0.001），且無細(xì)胞毒性。

圖4 19 個(gè)化合物對(duì)NF-κB 抑制活性 (n = 2)Fig.4 Inhibitory activity of 19 compounds against NF-κB (n = 2)

圖5 19 個(gè)化合物細(xì)胞存活率結(jié)果 (n = 2)Fig.5 Cell survival rate results of 19 compounds (n = 2)

3.1.4 CCR4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 通過多濃度梯度給藥，得到陽(yáng)性拮抗劑C-021 對(duì)CCR4 的拮抗結(jié)果（圖1），計(jì)算得到IC50為1.80 μmol/mL。19個(gè)化合物對(duì)CCR4拮抗活性見圖6。由結(jié)果可知，與陰性對(duì)照組比較，藁本內(nèi)酯在低、高濃度對(duì)CCR4 均有顯著拮抗活性（P＜0.001），且呈濃度相關(guān)性；甘草次酸在高濃度對(duì)CCR4 有顯著拮抗活性（P＜0.001），其他化合物無顯著拮抗作用。

圖6 19 個(gè)化合物對(duì)CCR4 抑制活性 (n = 2)Fig.6 Inhibitory activity of 19 compounds against CCR4 (n = 2)

3.2 抑制血管翳形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過多濃度梯度給藥，得到陽(yáng)性抑制劑星形孢菌素對(duì)VEGFR2/KDR 的抑制率曲線（圖1），其IC50為8.40 nmol/L。19 個(gè)化合物對(duì)VEGFR2/KDR抑制活性結(jié)果見圖7。由結(jié)果可知，與陰性對(duì)照組比較，茯苓酸、牛膝皂苷D 在低、高濃度對(duì)該靶點(diǎn)有較強(qiáng)抑制作用（P＜0.01、0.001），抑制率最高分別為77.77%、60.51%；丹參素在高濃度抑制率為62.26%，有較好抑制作用（P＜0.001）；丹酚酸B、人參皂苷Rg1、馬錢子堿在低、高濃度有較弱抑制作用（P＜0.05、0.01、0.001）；甘草次酸、三七皂苷R1、藁本內(nèi)酯、迷迭香酸、甘草苷、阿魏酸在高濃度下對(duì)該酶均有較弱抑制作用（P＜0.05、0.01、0.001）。

圖7 19 個(gè)化合物對(duì)VEGFR2/KDR 抑制活性 (n = 2)Fig.7 Inhibitory activity of 19 compounds against VEGFR2/KDR (n = 2)

3.3 抑制基質(zhì)降解相關(guān)靶點(diǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過多濃度梯度給藥，得到陽(yáng)性抑制劑NNGH對(duì)MMP-3 的抑制效應(yīng)曲線，見圖1，其IC50值為18.14 mmol/L。19 個(gè)化合物對(duì)MMP-3 抑制活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖8。結(jié)果表明，與陰性對(duì)照組比較，丹參素、藁本內(nèi)酯、丹酚酸B、迷迭香酸在低、高濃度對(duì)MMP-3 表現(xiàn)出顯著抑制作用（P＜0.01、0.001），其中藁本內(nèi)酯抑制率分別為70.84%、73.79%，丹參素高濃度抑制率為73.56%，均顯示較強(qiáng)抑制活性。黨參炔苷在高濃度亦有較弱抑制活性（P＜0.05），其他化合物無顯著抑制作用。

圖8 19 個(gè)化合物對(duì)MMP-3 抑制活性 (n = 2)Fig.8 Inhibitory activity of 19 compounds against MMP-3 (n = 2)

3.4 活血作用相關(guān)靶點(diǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.4.1 凝血酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果 通過多濃度梯度給藥，得到陽(yáng)性抑制劑阿加曲班對(duì)凝血酶的抑制率曲線（圖1），其IC50為602.30 nmol/L。19 個(gè)化合物對(duì)凝血酶抑制活性結(jié)果見圖9。由結(jié)果可知，與陰性對(duì)照組比較，丹酚酸B、迷迭香酸、阿魏酸、丹參酮IIA、丹參素在低、高濃度對(duì)凝血酶均有顯著的抑制活性（P＜0.01、0.001），且除丹參酮IIA外，其他4 個(gè)化合物都呈現(xiàn)濃度相關(guān)性。

圖9 19 個(gè)化合物對(duì)凝血酶抑制活性 (n = 2)Fig.9 Inhibitory activity of 19 compounds against thrombin (n = 2)

3.4.2 PDE3A 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 通過多濃度梯度給藥，得到陽(yáng)性抑制劑曲喹辛對(duì)PDE3A 的抑制率曲線（圖1），其IC50為0.09 nmol/L。19 個(gè)化合物對(duì)PDE3A抑制活性結(jié)果見圖10。由結(jié)果可知，與陰性對(duì)照組比較，丹酚酸B、迷迭香酸在低、高濃度下對(duì)該酶均有顯著抑制作用，并呈濃度相關(guān)性（P＜0.001），且在高濃度下抑制率達(dá)100%以上，抑制活性強(qiáng)；丹參素、藁本內(nèi)酯及甘草苷在高濃度時(shí)對(duì)PDE3A 抑制活性也較顯著（P＜0.001），其他化合物無顯著抑制作用。

圖10 19 個(gè)化合物對(duì)PDE3A 抑制活性 (n = 2)Fig.10 Inhibitory activity of 19 compounds against PDE3A (n = 2)

3.4.3 ADRA1A 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 通過多濃度梯度給藥，得到陽(yáng)性拮抗劑WB4101 對(duì)ADRA1A 的拮抗曲線（圖1），其IC50為18.09 nmol/L。19 個(gè)化合物對(duì)ADRA1A 拮抗活性結(jié)果見圖11。由結(jié)果可知，與陰性對(duì)照組比較，馬錢子堿在低、高濃度對(duì)ADRA1A拮抗率分別為96.78%、74.54%，拮抗作用強(qiáng)（P＜0.001）且呈現(xiàn)濃度相關(guān)性；甘草次酸及藁本內(nèi)酯高濃度和人參皂苷Rb1低濃度對(duì)ADRA1A 拮抗率分別為97.32%、64.09%、65.56%，也有較顯著拮抗活性（P＜0.001）。其他化合物無顯著拮抗作用。

圖11 19 個(gè)化合物對(duì)ADRA1A 抑制活性 (n = 2)Fig.11 Inhibitory activity of 19 compounds against ADRA1A (n = 2)

4 討論

RA 以持續(xù)性滑膜炎和血管生成為特征，導(dǎo)致滑膜增生及骨骼和軟骨的漸進(jìn)性破壞[7]。成纖維樣滑膜細(xì)胞是除T 細(xì)胞和B 細(xì)胞外，RA 發(fā)生、發(fā)展的一個(gè)重要關(guān)鍵因素，在RA 炎癥反應(yīng)和關(guān)節(jié)損傷方面起著非常重要的作用[8-10]。B 細(xì)胞活化產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)劑淋巴毒素β（lymphotoxin β，LTβ），滑膜巨噬細(xì)胞釋放的TNF-α、白細(xì)胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、IL-6 等細(xì)胞因子以及樹突細(xì)胞分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）促使Th17細(xì)胞分化的IL-17 共同刺激成纖維樣滑膜細(xì)胞過度增殖不斷產(chǎn)生大量炎性細(xì)胞因子，如IL-6、IL-1β、TNF-α 等，同時(shí)這些炎癥因子可以誘導(dǎo)或加速成纖維樣滑膜細(xì)胞轉(zhuǎn)化和遷移；產(chǎn)生的大量血管生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）通過與其受體VEGFR2/KDR 結(jié)合，可促進(jìn)血管形成，而不可控的新生血管形成可以導(dǎo)致炎細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜組織增生，形成血管翳-軟骨結(jié)合和血管翳-骨結(jié)合，最終導(dǎo)致軟骨和骨破壞[11]；產(chǎn)生的MMP-3，可加重關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、骨侵蝕和軟骨破壞等癥狀[12]?；罨某衫w維樣滑膜細(xì)胞在炎癥因子如TNF-α、IL-6 和IL-17 的激發(fā)下，成纖維樣滑膜細(xì)胞表達(dá)NF-κB 受體活化因子配體（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）增多，同時(shí)大量的巨噬細(xì)胞集落刺激因子與前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）刺激成骨細(xì)胞中RANKL 表達(dá)升高，其與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表面的NF-κB 受體活化因子（receptor activator of NFκB，RANK）特異結(jié)合，通過激活下游NF-κB，促進(jìn)與破骨分化相關(guān)基因抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）、組織蛋白酶K（cathepsin K，CTSK）、降鈣素受體（calcitonin receptor，CTR）、MMP-1和MMP-3等表達(dá)，促使破骨細(xì)胞發(fā)生融合，細(xì)胞骨架重塑，促進(jìn)骨吸收和骨質(zhì)溶解，最終引起關(guān)節(jié)骨質(zhì)侵蝕破壞[13-16]。本研究結(jié)果表明，痹祺膠囊中丹參素、迷迭香酸、丹酚酸B、藁本內(nèi)酯、人參皂苷Rb1、阿魏酸等主要成分能顯著抑制COX-2 活性，進(jìn)而降低PGE2表達(dá)，抑制炎性及致痛反應(yīng)；茯苓酸、牛膝皂苷D、丹參素、丹酚酸B、人參皂苷 Rg1、馬錢子堿等成分能顯著抑制VEGFR2/KDR 活性，從而減少新生血管形成；丹參素、藁本內(nèi)酯、丹酚酸B、迷迭香酸能顯著抑制MMP3活性，減少基質(zhì)降解，減緩軟骨破壞（圖12）。

NF-κB 作為核轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)細(xì)胞存活、增殖、凋亡及免疫應(yīng)答等多種生物過程，與RA 發(fā)病密切相關(guān)[17]。T 細(xì)胞、B 細(xì)胞表面上的抗體與對(duì)應(yīng)受體結(jié)合，刺激三磷酸肌醇（inositol triphosphate，IP3）和二?；视停╠iacylglycerol，DAG）的形成，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度迅速升高[18-19]，激活下游活化T 細(xì)胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）級(jí)聯(lián)信號(hào)反應(yīng)的正調(diào)控[20]及NF-κB 信號(hào)通路，最終調(diào)節(jié)Th1、Th2、Th17 細(xì)胞分化并產(chǎn)生γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、IL-2、IL-12、IL-17 等細(xì)胞因子，同時(shí)使得活化后的B 細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白，進(jìn)而在機(jī)體自身免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng)中共同發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[21-23]。另外，CC 亞族趨化因子配體22（CC chemokine ligand 22，CCL22）通過靶向作用受體CCR4 激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K），進(jìn)一步調(diào)節(jié)NF-κB 信號(hào)通路，最終作用于DNA 轉(zhuǎn)錄因子釋放趨化因子CXCL1、CXCL2、CCL7 等，在細(xì)胞遷移、凋亡及細(xì)胞存活等方面發(fā)揮作用[24]。研究表明，RA 患者關(guān)節(jié)液中NO水平升高，NO 是一種重要的致炎因子，由NOS 催化L-精氨酸生成，在滑膜炎癥部位介導(dǎo)許多不同的細(xì)胞功能，包括細(xì)胞因子產(chǎn)生、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、線粒體功能和細(xì)胞凋亡[25]（圖13）。本研究結(jié)果表明，痹祺膠囊中丹參素、阿魏酸、丹酚酸B、迷迭香酸、丹參酮IIA、甘草次酸、藁本內(nèi)酯對(duì)NF-κB 有顯著拮抗作用；藁本內(nèi)酯、甘草次酸對(duì)CCR4 有顯著拮抗作用；迷迭香酸、丹酚酸B、人參皂苷Rb1、藁本內(nèi)酯、馬錢子堿、士的寧、黨參炔苷等成分對(duì)NOS 有顯著抑制活性。

RA 屬于中醫(yī)“痹證”范疇，歸屬于血瘀證。研究表明，血瘀證是RA 的基本病機(jī)之一[26]。凝血酶通過與其受體F2R 作用，激活磷酯酶Cβ（phospholipase Cβ，PLCβ），并特異性水解磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate，PIP2）為IP3和DAG 2 個(gè)第二信使，從而激活Ca2+信號(hào)通路，隨著胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度升高，蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）被激活，通過磷酸化調(diào)節(jié)下游信號(hào)傳遞，最終引起血小板聚集[27]。另一方面，ADRA1A 被激動(dòng)后，同樣可通過PLCβ 激活Ca2+信號(hào)通路，肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chain kinase，MLCK）可由鈣調(diào)蛋白2（calmodulin 2，CALM2）激活，進(jìn)而對(duì)肌球蛋白輕鏈（myosin light chain，MLC）進(jìn)行磷酸化，使肌動(dòng)球蛋白得以激活肌球蛋白ATP 酶，最終引起血管平滑肌的收縮[28]。此外，CALM2 可通過激動(dòng)腺苷酸環(huán)化酶（adenylate cyclase，AC）產(chǎn)生cAMP，進(jìn)一步活化蛋白激酶A（protein kinase A，PKA），最終調(diào)節(jié)MLC，松弛血管平滑肌[29]（圖14）。本研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B、迷迭香酸、阿魏酸、丹參酮IIA、丹參素能顯著抑制凝血酶活性；馬錢子堿、甘草次酸、丹參素、藁本內(nèi)酯、人參皂苷Rb1能顯著拮抗ADRA1A；丹酚酸B、迷迭香酸、丹參素、藁本內(nèi)酯、甘草苷能顯著抑制cAMP 降解酶PDE3A 活性，提高cAMP 含量。由此推測(cè)，痹祺膠囊通過干預(yù)凝血酶、PDE3A 及ADRA1A，進(jìn)而抑制血小板聚集、促進(jìn)血管平滑肌舒張，發(fā)揮活血作用。

圖14 痹祺膠囊活血作用機(jī)制Fig.14 Mechanism of Biqi Capsule in promoting blood circulation

綜上，COX-2、NOS、NF-κB、CCR4、VEGFR2、MMP3、凝血酶、PDE3A、ADRA1A 可能為痹祺膠囊治療RA 的部分作用靶點(diǎn)。其主要成分通過抑制COX-2、NOS、VEGFR2/KDR、MMP3 活性，拮抗NF-κB、CCR4，抑制滑膜炎性反應(yīng)、滑膜異常增生、血管翳形成及關(guān)節(jié)軟骨破壞；通過抑制凝血酶及PDE3A 活性，拮抗ADRA1A，抑制血小板聚集、促進(jìn)血管平滑肌舒張，發(fā)揮活血作用。由于實(shí)驗(yàn)方法有限，本研究?jī)H對(duì)RA 相關(guān)的幾個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，后續(xù)還應(yīng)聚焦更多關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行更全面深入的探索。另外，本研究采用的是體外酶活性測(cè)定方法，缺少了機(jī)體對(duì)成分的吸收、代謝等的影響，并且本研究是對(duì)單個(gè)化合物獨(dú)立效果的分析，未開展組分配伍的活性研究，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)還需針對(duì)以上幾點(diǎn)開展體內(nèi)驗(yàn)證及配伍研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突