日本莢蒾葉片中乙酰膽堿酯酶抑制物的提取工藝優(yōu)化＊

楊慧霞，陳欣雨，楊晨娜，杜靈潔，胡秀榮，邊才苗

（臺(tái)州學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 臺(tái)州 318000）

阿爾茨海默?。ˋD）是一種發(fā)生于老年和老年前期以進(jìn)行性神經(jīng)退化為特征的退行性疾病，臨床上有記憶障礙、失語(yǔ)、失用、失認(rèn)、視空間技能損害、執(zhí)行功能障礙，以及人格和行為改變等全面性癡呆表現(xiàn)，最終可導(dǎo)致死亡［1-2］。隨著人口老齡化的出現(xiàn)，AD疾病已成為諸多學(xué)者關(guān)注的第四大疾病。研究表明AD是一種多病因疾病，臨床上主要依據(jù)為“膽堿能缺失學(xué)說(shuō)”［3］，認(rèn)為大腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)-乙酰膽堿的缺失是導(dǎo)致AD疾病的關(guān)鍵原因。乙酰膽堿酯酶（AChE）催化乙酰膽堿的裂解反應(yīng)，導(dǎo)致乙酰膽堿的缺失、神經(jīng)信號(hào)傳遞失敗。目前對(duì)AD的藥物治療多采用膽堿酯酶抑制劑（AChE I）抑制AChE活性，以延緩乙酰膽堿的水解速度［4］。

諸多植物的藥用成分對(duì)AD具有療效好、副作用小、作用面廣、適宜長(zhǎng)期服用等優(yōu)點(diǎn)。因而從藥用植物中尋找具有抗老年性癡呆的乙酰膽堿酯酶抑制劑，已成為當(dāng)今醫(yī)藥研究方面的熱點(diǎn)課題［5-9］。植物來(lái)源的天然產(chǎn)物中有AChE抑制活性的生物堿種類(lèi)豐富，主要包括甾體類(lèi)、三萜類(lèi)、石松堿類(lèi)、異喹啉類(lèi)和吲哚類(lèi)生物堿［8，9］。

日本莢蒾（Viburnum japonicum）為忍冬科（Caprifoliaceae）莢蒾屬植物，主要生長(zhǎng)在海島低海拔雜木林中，為常綠的灌木或小喬木。日本莢蒾在日本和中國(guó)呈間斷分布，在中國(guó)大陸分布范圍十分狹窄，僅見(jiàn)于浙江省臺(tái)州市椒江區(qū)的上大陳島，臨海市的頭門(mén)島、雀兒岙等海島，以及舟山東福山島（圖1），目前數(shù)量稀少，屬浙江省首批重點(diǎn)保護(hù)野生植物［10］。莢蒾屬植物所含的物質(zhì)成分復(fù)雜，具有抗氧化、止咳化痰、消炎抗菌、治療月經(jīng)不調(diào)、胃腎絞痛等功效［11］。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，日本莢蒾葉片和果實(shí)中含有乙酰膽堿酯酶抑制劑。為此，本文以日本莢蒾的成熟葉片為材料，測(cè)定了其提取物對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制率，并對(duì)乙酰膽堿酯酶抑制劑的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。

圖1 日本莢蒾、日本莢蒾分布區(qū)域、我國(guó)日本莢蒾分布區(qū)域

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

日本莢蒾成熟葉片，采摘于浙江省臺(tái)州學(xué)院臨海校區(qū)珍稀植物種植園，采摘時(shí)間為2017年11月下旬，清水沖洗后，經(jīng)真空冷凍干燥、研碎后，置于密閉的玻璃瓶?jī)?nèi)4℃保存，備用。

1.2 研究方法

1.2.1 不同溶劑提取液的制備

在三個(gè)錐形瓶中各加入10.0 g研碎的日本莢蒾葉片樣品，分別加入水、甲醇和80%的乙醇100 mL，混勻后60℃回流提取2 h，過(guò)濾；將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成浸膏，真空干燥后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

使用前將浸膏用50%乙醇配制成1.0 mg/mL的稀釋液，按照乙酰膽堿酯酶試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定乙酰膽堿酯酶抑制率，其中提取物的稀釋液作為抑制劑使用。

計(jì)算公式［12，13］：抑制率=（測(cè)定OD值-對(duì)照OD值）/（標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值）

1.2.2 不同乙醇濃度提取液對(duì)乙酰膽堿酯酶（AChE）抑制率的影響

取5份10.0 g研碎的日本莢蒾葉片樣品，分別與100 mL濃度為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液混合，在60℃回流提取2 h，過(guò)濾；將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成浸膏，真空干燥后4℃保存?zhèn)溆?。隨后的處理和測(cè)定同1.2.1。

1.2.3 不同溫度提取對(duì)AChE抑制率的影響

取5份10.0 g研碎的日本莢蒾葉片樣品，與100 mL 80%乙醇溶液混合，分別在40℃、50℃、60℃、70℃和80℃條件下回流提取2 h，過(guò)濾；將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成浸膏，真空干燥后4℃保存?zhèn)溆?。隨后的處理和測(cè)定同1.2.1。

1.2.4 不同時(shí)間提取對(duì)AChE抑制率的影響

取5份10.0 g研碎的日本莢蒾葉片樣品，與100 mL 80%乙醇溶液混合，在60℃條件下分別回流提取60、90、120、150和180 min，過(guò)濾；將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成浸膏，真空干燥后4℃保存?zhèn)溆?。隨后的處理和測(cè)定同1.2.1。

1.2.5 粗提物的萃取處理

取3份10.0 g研碎的日本莢蒾葉片樣品，按照優(yōu)化的提取程序制備粗提液，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成浸膏，將所得浸膏加入20 mL蒸餾水，再分別加入30 mL石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，每份各萃取3次，合并3次萃取液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成浸膏，真空干燥后4℃保存?zhèn)溆?。隨后的處理和測(cè)定同1.2.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑提取液的AChE抑制率

不同溶劑提取液對(duì)AChE的抑制率見(jiàn)表1，結(jié)果顯示，用乙醇作為提取溶劑時(shí)，提取液對(duì)AChE的抑制率最高，甲醇提取液的抑制率其次，水提取液的抑制率很低，三者的差異均為極顯著（p＜0.01），可選擇乙醇作為提取溶劑。

表1 不同溶劑的提取液對(duì)AChE的抑制率（1.0 mg/mL）

2.2 不同乙醇濃度提取液對(duì)AChE抑制率的影響

不同乙醇濃度的日本莢蒾葉片提取液對(duì)AChE的抑制率見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示，乙醇濃度80%時(shí)，提取液對(duì)AChE的抑制率最高；乙醇濃度60%～90%時(shí)，提取液的抑制率差異不顯著；乙醇濃度為50%時(shí)，提取液的抑制率最低，與乙醇濃度為80%時(shí)的差異顯著（p＜0.05）。

圖2 不同乙醇濃度提取液的AChE抑制率

2.3 不同提取溫度提取液對(duì)AChE抑制率的影響

不同提取溫度下，日本莢蒾葉片提取液對(duì)AChE的抑制率見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示，在提取溫度60℃時(shí)，提取液對(duì)AChE的抑制率最高；提取溫度為50～70℃時(shí)，抑制率差異不顯著；而提取溫度為40℃時(shí)和80℃時(shí)的抑制率均較低，與提取溫度為60℃時(shí)的差異顯著（p＜0.05）。

圖3 不同提取溫度提取液的AChE抑制率

2.4 不同提取時(shí)間提取液對(duì)AChE抑制率的影響

不同提取時(shí)間下，日本莢蒾葉片提取液對(duì)AChE的抑制率見(jiàn)圖4。結(jié)果顯示，在提取時(shí)間120 min時(shí)，提取液對(duì)AChE的抑制率最高；提取時(shí)間為90～180 min時(shí)，提取液的抑制率之間差異不顯著（p＞0.05）；而提取時(shí)間為60 min時(shí)抑制率最低，與提取時(shí)間為120、150和180 min時(shí)的抑制率差異均為顯著（p＜0.05）。

圖4 不同提取時(shí)間提取液的AChE抑制率

綜合2.2～2.4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，日本莢蒾葉片中AChE抑制物回流提取的最佳工藝是：提取溶劑為80%乙醇、提取溫度為60℃、提取時(shí)間為120 min。

2.5 不同有機(jī)溶劑萃取組分對(duì)AChE抑制率的影響

不同有機(jī)溶劑萃取組分對(duì)AChE的抑制率見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，石油醚萃取相的抑制率最高，乙酸乙酯萃取相的其次，兩者均高于對(duì)照（未萃取的提取液），其中石油醚萃取相與對(duì)照的差異為顯著（p＜0.05）；正丁醇萃取相的抑制率較低，與其他2種萃取相和對(duì)照的抑制率差異均為極顯著（p＜0.01）。提示從石油醚相和乙酸乙酯相中有可能存在活性更強(qiáng)的AChE抑制成分。

表2 不同有機(jī)溶劑萃取組分對(duì)AChE的抑制率（1.0 mg/mL）

3 討論與結(jié)論

隨著社會(huì)人口的老化，AD癥的發(fā)病率相對(duì)增高。目前，全世界約有1700萬(wàn)以上人患有此癥［12］。因此，有必要從植物中提取和純化出高效的AChE抑制物。本文的研究表明，日本莢蒾葉片中有豐富的AchE抑制物，用乙醇提取效果較好，最適提取條件為：乙醇濃度80%、提取溫度60℃、提取時(shí)間120 min。再者，比較不同溶劑萃取組分的抑制率，顯示石油醚相和乙酸乙酯相的抑制率較高，顯著高于未萃取的對(duì)照；而正丁醇相的抑制率相對(duì)較低。提示對(duì)AChE具抑制作用的有效成分可能是低極性的。已有文獻(xiàn)［12-14］報(bào)道，含氧低、極性小的萜類(lèi)、甾體，生物堿等對(duì)AchE有抑制活性。因此，從石油醚相和乙酸乙酯相中很可能存在活性更強(qiáng)的有效成分，有利于AD癥高效防治藥物的開(kāi)發(fā)。