大薊生品及炭品中多糖不同提取方法的比較分析

劉智勇,張增弟,馬黃璜,張 靚

(1.福建中醫(yī)藥大學附屬人民醫(yī)院中藥房,福建 福州 350004;2.福建中醫(yī)藥大學附屬人民醫(yī)院臨床藥學,福建 福州 350004)

大薊是一種傳統(tǒng)中藥,為菊科植物薊Cirsium japonicum Fisch.ex DC.的干燥地上部分,大薊炭是大薊的炮制加工品。大薊具有涼血止血、祛瘀止痛的作用,還能夠起到抗菌、抗病毒、抗發(fā)炎、抗癌等作用[1]。該藥材化學成分復雜,含有三萜、甾體、揮發(fā)油、長鏈炔醇、黃酮、黃酮苷等化合物。多糖也是其中一種成分,其提取含量的影響因素較多,例如溫度、操作、浸潤程度、提取方法等等。提取方法主要有水提醇沉法、醇提除雜法、超聲輔助法、堿提醇法等等。近年來已有不少關于大薊中黃銅成分的有關文獻報道,但是關于多糖類成分的還不夠多[2-4]。為此,本文從本地擇取市售大薊飲片生品共計100個、炭品共計100個當做實驗標本,均接受水提醇沉法、醇提除雜法、超聲輔助法、堿提醇法進行多糖提取。探索各方法之間的多糖提取含量測定值差異性,詳情如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

從本地擇取市售大薊飲片生品共計100個、炭品共計100個當做實驗標本。藥材:所有藥材均采購于福建福州,且被福建中醫(yī)藥大學附屬人民醫(yī)院池志珍副主任藥師鑒定過為大薊和大薊炭。儀器:產自天津市泰斯特儀器有限公司、型號為FW100的高速萬能粉碎機,型號為3100PC的紫外-可見分光光度計,產自國華電器有限公司、型號為HY-4的振蕩機,產自昆山超聲儀器廠、型號為KQ3200的超聲波清洗器,型號為Sartorius BS214-D的天平(1/萬),產自國華電器有限公司、型號為HH-2的數顯恒溫水浴鍋,型號為2NHW的電熱套,產自浙江上虞道墟張興紗篩廠的藥典篩。試劑:濃度為98%的濃硫酸(分析純),濃度為4%的苯酚(重蒸、分析純),純化水,產自江西省藥品檢驗所、批號為0833-9501的葡萄糖對照品,產自南昌鑫光精細化工廠的氯仿(分析純),產自天津恒興化學試劑制造有限公司的無水乙醇(分析純),產自天津市恒興化學試劑制造有限公司的正丁醇(分析純),娃哈哈純凈水。

1.2 方法

所有中藥均接受水提醇沉法、醇提除雜法、超聲輔助法、堿提醇法進行多糖提取。

1.2.1 水提醇沉法

將大薊生品、炭品使用中藥粉碎機處理為粉末狀,并通過三號篩備用。嚴格的稱取各10g、各3份的大薊生品、炭品置入燒杯中,加入200mL的純化水進行燒沸、煎煮2h、2次,將濾液合并、濃縮至60mL。再使用20mL的乙醚進行3次脫脂處理,利用sevag法(氯仿-正丁醇為5∶1、樣品-試劑為2∶1)進行脫蛋白,振蕩8min。以3500r/min的離心速度開展20min的離心處理,進行4次脫蛋白。取出其上清液,加入300mL的無水乙醇,靜置一夜時間。待其沉淀后收集起來,加入純化水進行溶解,轉移入100mL的量瓶中,最后用純化水進行相應刻度的定容、搖勻。

1.2.2 醇提除雜法

嚴格的稱取大薊生品、炭品各10g、各3份置于500mL圓底燒杯之中,加入200mL濃度為95%的乙醇進行1h的回流處理,并趁熱過濾,使用95%乙醇20mL對殘渣進行3次洗滌。然后將其與濾紙共同放于圓底燒杯中,加入150mL純化水,進行30min的水浴加熱提取,并趁熱過濾,用20mL的純化水對殘渣進行3次洗滌,將洗液合并后,濃縮至60mL。使用20mL乙醚進行3次的脫脂處理,使用sevag法進行脫蛋白,振蕩8min。以3500r/min的離心速度開展20min的離心處理,脫蛋白4次。取出其上清液,轉移入100mL的量瓶中,使用蒸純化水進行相應刻度的定容、搖勻。

1.2.3 超聲輔助法

嚴格的稱取大薊生品、炭品各10g、各3份,加入200mL的純化水進行30min的超聲處理后,進行4h的回流處理,并趁熱過濾,濃縮至60mL。使用20mL的乙醚進行3次脫脂后,使用sevag法進行脫蛋白,振蕩8min。以3500r/min的離心速度開展20min的離心處理,脫蛋白4次。取出其上清液,加入300mL無水乙醇,靜置一夜時間,待其沉淀后收集好,使用純化水進行溶解。之后轉移入100mL量瓶中,用純化水進行相應刻度的定容、搖勻。

1.2.4 堿提醇法

嚴格的稱取大薊生品、炭品各10g、各3份,加入0.5mol/L的NaOH,200mL,靜置一夜時間后進行過濾。在濾液中加入36%乙酸進行中和,得到膠狀沉淀。進行溶劑揮干,得到浸膏沉淀,并用純化水溶解。之后轉移至100mL量瓶中,用純化水進行相應刻度的定容、搖勻。

1.2.5 苯酚-硫酸比色法

①苯酚溶液的配備。精密稱取苯酚4.0002g,加入純化水進行溶解,并轉移至100mL的量瓶中,再利用純化水進行相應刻度的定容、搖勻、超聲,最后得到的即為濃度為4%的苯酚溶液。②苯酚-硫酸比色法。從以上各提取方法得到的100mL的待檢測溶液中分別取出0.2mL,放置于10mL的量瓶中,加入純化水進行相應刻度的定容、搖勻。然后再從中取出2.0mL,放置于25mL的具塞試管中,分別精密加入 4% 的苯酚溶液 1 mL,濃硫酸7 mL,搖勻,放置于沸水中加熱保溫 30 min,取出后放冷,以純化水為空白,于490 nm波長處測定吸光度(A)。根據線性回歸方程 A =0.487C + 0.042 6 (r=0.9945),計算出各待測溶液中的多糖含量,并換算出樣品中多糖含量。

1.2.6 對照品溶液的配備

嚴格稱取105℃干燥到恒重的葡萄糖10.00mg,放置于10mL的量瓶中,加入蒸餾水溶解后進行稀釋達到相應刻度,搖勻后即為1.00g/L的葡萄糖溶液。然后從中嚴格量取2mL溶液,加入雙蒸餾水并定容于10mL的量瓶之中,即為0.20g/L的對照品溶液。

1.2.7 精密度實驗

從上述對照組品溶液中嚴格吸取0.4mL,共6份,分別置入25mL的具塞試管中。對于體積不夠2.0mL的使用蒸餾水進行補充,然后加入4%苯酚溶液1mL、濃硫酸7mL,搖勻后放置于沸水中進行30min的加入處理,取出后放冷,取出,以純化水為空白,于490nm波長處測定A,計算出RSD0.40%,代表儀器的精密度為良好。

1.2.8 重復性實驗

嚴格稱取大薊生品供試品各10g,各5份,根據醇提除雜法制備方法對供試液進行配備,并按照標準曲線制作下的相同條件進行測定,計算出RSD0.34%,代表本實驗的重復性為良好。

1.3 觀察指標

多糖提取含量測定值:使用苯酚-硫酸比色法測定各提取方法得到的多糖含量。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 多糖提取含量測定值

探索各方法之間的多糖提取含量測定值(表1)差異性,大薊生品中,含糖量最高的為超聲輔助法(t=17.058、26.230、153.894,P=0.000、0.000、0.000),其次為醇提除雜法、水提醇沉法、堿提醇法。大薊炭品中,含糖量最高的為醇提除雜法(t=2.095、12.444、100.492,P=0.037、0.000、0.000),其次為超聲輔助法、水提醇沉法、堿提醇法。使用超聲輔助法進行多糖提取時,大薊生品、炭品得到的含糖量基本相近(t=1.147,P=0.253),使用堿提醇法進行多糖提取時,大薊炭品得到的含糖量比生品顯著更高(t=34.234,P=0.000)。

表1 多糖提取含量測定值

3 討論

大薊是一種中藥材,在我國各地均有產出。其性涼、味甘、苦,歸心、肝經,能夠起到涼血止血、散瘀消腫的作用。該藥材化學成分十分繁雜,包括有黃酮、生物堿、揮發(fā)油、糖類化合物等等。藥理作用、臨床應用均十分廣泛。臨床中多用于肺結核、闌尾炎、乳腺炎、急性黃疸性肝炎等疾病的治療中[5-6]。該植物藥用價值極高,已被廣大學者選擇進行研究,但是對于抗菌、降壓等成分的研究還不夠深,僅僅停留在提取物層次。在大薊中,多糖是一種有效成分,近年來已被逐漸發(fā)現、應用。已經發(fā)現其藥理作用為抑菌、清除自由基,能夠影響機體抵抗衰老[7-8]。因此,找到對大薊進行多糖提取的高效方法至關重要。

常見的提取方法有水提醇沉法、醇提除雜法、超聲輔助法、堿提醇法等等。水提醇沉法是一種常見的大薊多糖提取手段,使用設備簡易,使用試劑實惠無害,操作也比較簡單,提取后得到的多糖含量也較高[9-10]。但是提取物中大概率會含有較多雜質成分,影響多糖測定結果。堿提醇法在大薊生品、炭品中多糖提取量均不高,因為該方法得到的多糖多為堿溶性、少部分為中性,沒有酸溶性多糖。且在進行酸中和時,因為溶液顏色的因素,無法準確判斷出膠狀沉淀,也會影響多糖提取含量。醇提除雜法指的是使用乙醇提取,將單糖、低聚糖、苷類、生物堿等等干擾成分去除干凈,再使用蒸餾水進行多糖成分的提取,最終得到的成分較純、含糖量較高,進行多糖含量測定時效果較好[11-12]。超聲輔助法和醇提除雜法相比,污染性更小,工藝過程也更簡單,提取量基本相當。和水提醇沉法相比,提取量更高,使用起來效果比較理想。

基于此,本文從本地擇取市售大薊飲片生品共計100個、炭品共計100個當做實驗標本。所有標本均接受水提醇沉法、醇提除雜法、超聲輔助法、堿提醇法進行多糖提取。以各方法之間的多糖提取含量測定值差異性展開探析。最終結果為:探索各方法之間的多糖提取含量測定值差異性,大薊生品中,含糖量最高的為超聲輔助法(P<0.05),其次為醇提除雜法、水提醇沉法、堿提醇法。大薊炭品中,含糖量最高的為醇提除雜法(P<0.05),其次為超聲輔助法、水提醇沉法、堿提醇法。使用超聲輔助法進行多糖提取時,大薊生品、炭品得到的含糖量基本相近(P>0.05),使用堿提醇法進行多糖提取時,大薊炭品得到的含糖量比生品顯著更高(P<0.05)。提示,超聲輔助法是大薊生品進行多糖提取的最佳方法、醇提除雜法是大薊炭品進行多糖提取的最佳方法。且使用超聲輔助法進行多糖提取時,大薊生品、炭品得到的含糖量基本相近,而使用堿提醇法進行多糖提取時,大薊炭品得到的含糖量比生品顯著更高。

探析其原因可能為:對于大薊生品來說,超聲會將其植物細胞壁破壞掉,使多糖更容易被提取出來[13-14]。對于大薊炭品來說,醇提除雜法能夠去除較多雜質,讓多糖測定效果更好,得到更高的吸光度,從而得到更高的含糖量。大薊炭品在炒炭過程中,自身組織結構被破壞,導致細胞多糖中堿溶性多糖更易被提取出,因此得到更高的含糖量[15]。

綜上所述,選擇超聲輔助法對大薊生品進行多糖提取、選擇醇提除雜法對大薊炭品進行多糖提取,得到的最終樣品含糖量較高。