干擾微小染色體維持基因表達對人胰腺癌細胞增殖和遷移的干預(yù)作用及其機制

楊才平，張強，韓婷婷，洪瑜，洪鮮，孫賀，鄧志會

1 齊齊哈爾醫(yī)學院醫(yī)藥科學研究院，黑龍江齊齊哈爾 161006；

2 齊齊哈爾醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院

胰腺癌是一種侵略性極強的消化道惡性腫瘤，具有很強的增殖和遷移能力。由于胰腺癌的臨床表現(xiàn)隱匿，缺乏敏感性高、特異性強的早期診斷方法，患者不能及時有效的采取治療措施，5 年生存率低于5%［1］。深入探討胰腺癌發(fā)生發(fā)展的生物學機制，對提高胰腺癌的早期診斷率及減少術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移具有重要意義。微小染色體維持（MCM）蛋白是AAA+ATP 酶蛋白超級家族成員，在真核生物中由MCM2～7 共6 個蛋白組成MCM 復(fù)合物，發(fā)揮DNA解旋酶作用。MCM 復(fù)合物是DNA 復(fù)制起點的裝配物質(zhì)，參與激活DNA 復(fù)制，并促進DNA 合成，在精確的DNA 復(fù)制調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。MCM 蛋白之間可以相互結(jié)合，組成不同的亞型復(fù)合物，如MCM2/4/6/7、MCM4/6/7、MCM3/5 等，其中MCM4/6/7 復(fù)合物在體外具有ATP 酶和DNA 解螺旋酶活性［2］。結(jié)構(gòu)生 物 學 研究顯示，MCM 復(fù)合物按照MCM2-MCM6-MCM4-MCM7-MCM3-MCM5 的順序以1∶1∶1∶1∶1∶1 的比例形成環(huán)狀異六聚體。MCM2 和MCM5之間存在一個動態(tài)的“門”［3］，MCM2/5門關(guān)閉是激活DNA 解螺旋和延伸所必需的，同時MCM2/5門構(gòu)象變化將DNA 復(fù)制限制在S 期，確保每個DNA片段在一個細胞周期內(nèi)只能復(fù)制一次［4］。MCM 在有增殖活性的細胞內(nèi)表達，其表達異常與腫瘤發(fā)生有關(guān)，在肝癌［5］、肺癌［6］、胃癌［7］和乳腺癌［8］等多種惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)MCM 蛋白高表達。研究顯示，MCM2～7 通過調(diào)節(jié)細胞周期蛋白表達參與細胞周期進展，影響腫瘤的發(fā)生［9］。但是關(guān)于MCM 復(fù)合物在胰腺癌中的生物學功能研究較少?；贛CM2參與形成動態(tài)門以及MCM4/6/7 三聚體具有DNA 解螺旋酶活性，2020 年8 月—2022 年8 月，本研究以MCM2、MCM6 為目標蛋白，通過RNA 干擾技術(shù)分別建立MCM2 和MCM6 基因沉默的穩(wěn)定細胞系，觀察MCM 復(fù)合物對胰腺癌PANC-1細胞增殖和遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑與儀器 人胰腺癌PANC-1 和人胚胎腎HEK293T 細胞購自國家實驗細胞資源共享服務(wù)平臺。DMEM 和鏈霉素青霉素購自Gibco；胎牛血清購自Clark Bioscience 和康源生物；轉(zhuǎn)染試劑聚乙烯 亞 胺（PEI）購 自Polysciences；CCK-8 試 劑購 自Med Chem Express；Transwell 小 室 購 自Corning Incorporated；總RNA 提取、質(zhì)粒小提、質(zhì)粒大提和Bradford 蛋白定量試劑盒購自天根生化科技有限公司；蛋白酶抑制劑購自Roche；DNA 連接酶購自New England Biolabs；聚凝胺（Polybrene）購自北京富百科生物技術(shù)有限公司，抗GAPDH 鼠單克隆抗體購自Proteintech Group；抗MCM2兔多克隆抗體購自Bethyl Laboratories；抗MCM6 兔多克隆抗體購自Thermo Fisher scientific；HRP 標記的羊抗兔IgG 和羊抗小鼠IgG購自Santa Cruz。引物合成及質(zhì)粒測序由上海生工生物工程有限公司完成，其他試劑均為國產(chǎn)分析純化。實時熒光定量PCR 儀、二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱購自Thermo Fisher Scientific，PCR 儀購自Bio-Rad，酶標儀購自奧地利Tecan 有限公司，紫外可見分光光度計購自北京普析通用儀器有限責任公司，TGem微量分光光度計購自天根生化科技（北京）有限公司，蛋白垂直電泳儀購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司，倒置顯微鏡購自尼康公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 取PANC-1和HEK293T細胞，加入含10% FBS 的高糖DMEM 培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3 shRNA 慢病毒溶液的制備 利用小干擾RNA（siRNA）在線設(shè)計軟件（http：//sirna. wi. mit. edu/）設(shè)立對照shRNA 以及能識別MCM2、MCM6 序列的特異性shRNA 序列。對照shRNA 序列為5' -CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCG-3'，特異性shMCM2序列為5'-CATCAGCGACATGTGCAAAGA-3' ，特 異 性sh MCM6 序列為5'-CAGACCATATCCATCACTAAA-3'。使用PEI 轉(zhuǎn)染試劑，將帶有目的shRNA 序列的質(zhì)粒以及兩個包裝質(zhì)粒（psPAX2 和pMD2. G）分別轉(zhuǎn)染至HEK293T 細胞。轉(zhuǎn)染3 h 后更換為完全培養(yǎng)基，48 h 后收集病毒上清并用0.45 μm 濾器過濾，濾液置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 MCM2、MCM6 基因沉默穩(wěn)定胰腺癌細胞的建立 取對數(shù)生長期PANC-1 細胞接種到6 cm 培養(yǎng)皿中，待細胞融合度為50% 左右，分為對照組、shMCM2、shMCM6 組，分 別 加 入1 mL Scramble、shMCM2、shMCM6慢病毒溶液和終濃度為8 μg/L的polybrene。病毒感染24 h 后，更換含2 mg/L 嘌呤霉素的培養(yǎng)基進行篩選。采用Western blotting 法檢測三組MCM2、MCM6 蛋白表達，結(jié)果顯示，shMCM2 組MCM2 蛋白表達低于對照組（0.31 ± 0.13 vs 1.11 ± 0.16，P＜0.01），shMCM6 組MCM6 蛋白表達低于對照組（0.62 ± 0.03 vs 1.06 ± 0.07，P＜0.05），表明MCM2和MCM6基因沉默穩(wěn)定細胞系構(gòu)建成功。

1.5 細胞增殖能力觀察 采用CCK-8 法。取三組細胞，配制成細胞懸液，按每孔100 μL 接種至96 孔板，每組設(shè)3 個復(fù)孔。培養(yǎng)0、24、48、72 h 后，加入10 μL CCK-8 試劑孵育3 h，在酶標儀450 nm 處檢測相應(yīng)的OD 值，并繪制增殖曲線。將各組0 h 測得的OD 值設(shè)1，其他時間點進行OD 值歸一化，計算細胞增殖率。

1.6 細胞橫向遷移能力觀察 采用細胞劃痕實驗。取三組細胞，以3×105/孔接種于6 孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞融合度為100%時，更換為無血清培養(yǎng)基，饑餓培養(yǎng)3 h。用1 mL槍頭垂直于6孔板劃痕，分別于0 h和24 h在相同位置拍照，Image J 軟件分析劃痕面積，計算面積比，代表細胞橫向增殖能力。

1.7 細胞縱向遷移能力觀察 采用Transwell實驗。在Transwell 孔 板 下 室 加 入600 μL 含15% FBS 的DMEM，上室加入100 μL 含4×104個細胞的無血清DMEM 細胞懸液，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。加入0.1%結(jié)晶紫染色15 min，在4 倍鏡下任意選取5個不同視野拍照，用Image J軟件進行分析。以穿過Transwell小室膜的細胞數(shù)目除以接種的總細胞數(shù)目計算細胞遷移率，代表細胞縱向遷移能力。

1.8 細胞周期蛋白Cyclin A1、B1、D1、E1 mRNA 檢測 采用RT-qPCR 法。取三組細胞接種于6 孔板，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞融合度達到100%，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用SYBR Green 試劑進行實時定量PCR 檢測Cyclin A1、B1、D1、E1 mRNA 表達。引物序列見表1。反應(yīng)條件：95 ℃變性2 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，共40 個循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參，通過目的基因的Ct 值，以2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量，同時將對照組的各種細胞周期蛋白mRNA 相對表達量標準化為1，實驗組進行歸一化處理。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)均來自3 次獨立重復(fù)實驗，符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，組間比較采用Student′st檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 三組細胞增殖率比較 隨著培養(yǎng)時間延長，三組細胞活性均不斷增加，shMCM2 和shMCM6 組在72 h的細胞增殖率低于對照組（P均＜0.01）。見表2。

表2 三組不同時間點細胞增殖率比較± s）

表2 三組不同時間點細胞增殖率比較± s）

注：與對照組比較，*P＜0.01。

組別shMCM2組shMCM6組對照組細胞增殖率24 h 2.34 ± 0.30 2.48 ± 0.40 2.81 ± 0.72 48 h 4.04 ± 0.53 4.33 ± 0.39 4.92 ± 0.31 72 h 4.71 ± 0.25*5.01 ± 0.47*6.87 ± 0.40

2.2 三組細胞遷移能力比較 與對照組相比，shMCM2組細胞橫向遷移的劃痕面積比和縱向遷移率均降低（P均＜0.01）；shMCM6 組細胞橫向遷移的劃痕面積比與對照組比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），縱向遷移率低于對照組（P＜0.05）。見表3。

表3 三組細胞遷移能力比較（± s）

表3 三組細胞遷移能力比較（± s）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別shMCM2組shMCM6組對照組劃痕面積比0.93 ± 0.03**0.85 ± 0.06 0.73 ± 0.06縱向遷移率（%）6.79 ± 1.13**8.48 ± 1.03*10.53 ± 1.11

2.3 三組細胞Cyclin A1、B1、D1、E1 mRNA表達水平比較 與對照組相比，shMCM2組Cyclin A1、B1、D1、E1 mRNA 表達水平降低，shMCM6 組Cyclin A1、B1 mRNA表達水平降低（P＜0.05或＜0.01）。見表4。

表4 三組細胞Cyclin A1、B1、D1、E1 mRNA表達水平 比較（ s）

表4 三組細胞Cyclin A1、B1、D1、E1 mRNA表達水平 比較（ s）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別shMCM2組shMCM6組對照組Cyclin A1 mRNA 0.18 ± 0.07**0.29 ± 0.22**1.00 ± 0.00 Cyclin B1 mRNA 0.55 ± 0.22*0.57 ± 0.15**1.00 ± 0.00 Cyclin D1 mRNA 0.32 ± 0.02**1.04 ± 0.30 1.00 ± 0.00 Cyclin E1 mRNA 0.73 ± 0.01*0.97 ± 0.18 1.00 ± 0.00

3 討論

胰腺癌早期癥狀不明顯，缺乏相應(yīng)的關(guān)鍵標志物，大部分確診時已至晚期，預(yù)后極差。研究顯示，胰腺癌組織中MCM2～7表達上調(diào)［10］；通過瞬時轉(zhuǎn)染降低胰腺癌細胞MCM4、MCM7 表達可增加細胞對吉西他濱和5-FU 的藥物敏感性［11］。在近期的數(shù)據(jù)庫篩選結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，MCM2 可作為胰腺癌的診斷和預(yù)后的潛在生物標志物［12］。然而，胰腺癌細胞易于增殖及轉(zhuǎn)移等機制尚未闡明，廣泛高表達于各類癌細胞中的MCM 復(fù)合物能否作為胰腺癌新型的治療靶點，成為近年研究熱點。

細胞的惡性增殖和高的遷移侵襲能力，是惡性腫瘤細胞的重要生物學特性，與腫瘤的發(fā)展進程密切相關(guān)。細胞MCM 蛋白表達與多種腫瘤細胞的增殖、遷移及侵襲能力有關(guān)［13-16］。研究表明，在肺癌細胞中瞬時敲低MCM2 基因，其細胞增殖能力和遷移能力均降低［17］。LIU 等［18］研究顯示，在肝癌細胞中沉默MCM6基因能夠抑制肝癌細胞的體外增殖和遷移能力，進一步研究發(fā)現(xiàn)MCM6 是通過激活MEK/ERK 信號通路發(fā)揮促腫瘤作用，進而調(diào)節(jié)肝癌的轉(zhuǎn)移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。體內(nèi)外研究顯示，敲低MCM7能夠抑制膠質(zhì)母細胞瘤和肝癌細胞的增殖［19-20］。在髓母細胞瘤中，過表達MCM2、MCM3 和MCM7 能夠顯著增強細胞的增殖、遷移和侵襲能力，而敲低MCM2、MCM3 和MCM7 均不同程度降低細胞的增殖、遷移和侵襲能力［13］。本研究結(jié)果顯示，沉默PANC-1 細胞中的MCM2 或MCM6 均可抑制胰腺癌的增殖和遷移能力，說明MCM 蛋白在促進胰腺癌發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。

多項研究報道了MCM2～7 參與細胞周期及信號通路的調(diào)節(jié)。在非小細胞肺癌中，MCM2 沉默誘發(fā)細胞G1/S 期阻滯，抑制了Cyclin D1 和CDK4 表達，但上調(diào)了p21 和p53 表達，表明MCM2 缺失可導(dǎo)致細胞周期停滯，阻礙腫瘤細胞增殖［21］。瞬時沉默肝癌細胞中的MCM6 可下調(diào)CyclinA、B1、D1、E 表達，延緩細胞S/G2期的進展，從而抑制細胞增殖［5］。在肝癌細胞中，MCM7 表達與Cyclin D1 表達相關(guān)［20］；在食管鱗狀細胞癌中，敲低MCM7 能夠降低Cyclin D1、Cyclin E2 表達，同時抑制AKT 和mTOR磷酸化［22］。本研究結(jié)果顯示，沉默MCM2 表達能夠使胰腺癌PANC-1 細胞Cyclin A1、B1、D1、E1 mRNA表達降低，而沉默MCM6 表達可使細胞Cyclin A1、B1 mRNA表達降低。提示MCM復(fù)合物抑制PANC-1細胞增殖和遷移的作用可能是通過下調(diào)細胞Cyclin mRNA表達引起細胞周期阻滯造成的。

綜上所述，MCM 復(fù)合物蛋白缺失可降低胰腺癌PANC-1細胞的增殖和遷移能力，其機制可能是通過降低細胞Cyclin mRNA 表達來發(fā)揮作用。目前，已經(jīng)有靶向MCM2～7表達以及MCM2～7解螺旋酶活性的小分子抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡的報道［23］，說明靶向MCM 復(fù)合物治療腫瘤是一種新型的有潛力的治療策略。后續(xù)我們將繼續(xù)研究MCM 復(fù)合物對胰腺癌細胞信號傳導(dǎo)通路的影響，進一步了解MCM 蛋白在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為其成為胰腺癌診斷及治療的分子靶點提供理論基礎(chǔ)。