Toll樣受體在骨退行性疾病發(fā)生發(fā)展中作用機(jī)制的研究進(jìn)展

黎祥濤，蘇天，溫鵬，崔紅旺

海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院創(chuàng)傷醫(yī)學(xué)中心，?？?570102

骨退行性疾病是以一類以骨質(zhì)疏松、關(guān)節(jié)軟骨退變及周圍軟組織慢性炎癥為主要特征的全身性疾病，包括椎間盤退行性變、骨關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)疏松。隨著我國(guó)人口老齡化的進(jìn)展，骨退行性病變發(fā)病率逐年上升，給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。由于其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，治療上多以止痛、理療等對(duì)癥治療為主，治療效果欠佳。研究發(fā)現(xiàn)，固有免疫在骨退行性疾病發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Toll樣受體（TLRs）作為固有免疫模式識(shí)別受體中的典型代表，廣泛參與病原相關(guān)分子模式（PAMPs）的識(shí)別及內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)相關(guān)分子模式（DAMPs）的感知，進(jìn)而啟動(dòng)固有免疫應(yīng)答［1］。TLRs 大量表達(dá)于骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞表面，參與骨退行性疾病發(fā)展［2］。TLRs 傳導(dǎo)信號(hào)根據(jù)銜接蛋白不同可分為MyD88 依賴性和TRIF 依賴性兩種途徑，核因子κB（NF-κB）在這兩種途徑中均發(fā)揮關(guān)鍵性作用，其表達(dá)釋放出高水平的炎癥細(xì)胞因子IL-1、TNF-α、IL-6，可增加成骨細(xì)胞凋亡，同時(shí)通過(guò)B 細(xì)胞產(chǎn)生的NF-κB 配體受體激活劑（RANKL）間接刺激破骨細(xì)胞生成［3］。在骨組織及周圍軟組織損傷區(qū)域中，可檢測(cè)到TLRs、NF-κB 及炎癥介質(zhì)表達(dá)明顯升高，并且TLRs介導(dǎo)的信號(hào)通路釋放炎癥介質(zhì)及蛋白水解酶，調(diào)控骨細(xì)胞凋亡及周圍組織損傷過(guò)程［4］。這提示骨退行性疾病的進(jìn)展可能與TLRs/NF-κB 信號(hào)通路介導(dǎo)的固有免疫反應(yīng)有關(guān)。現(xiàn)將TLRs 在骨退行性疾病中的作用機(jī)制研究進(jìn)展綜述如下。

1 TLRs在椎間盤退行性變發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制

椎間盤退行性變是由于中央髓核和細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白聚糖分解代謝，導(dǎo)致椎間盤的水含量和可壓縮性降低，纖維環(huán)發(fā)生微裂和撕裂，椎間盤結(jié)構(gòu)完整性受到破壞。椎間盤退行性變的病理特征是分解代謝和炎癥刺激過(guò)程，椎間盤分解代謝狀態(tài)是由椎間盤細(xì)胞產(chǎn)生炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)驅(qū)動(dòng)的。TLRs 和炎癥介質(zhì)在變性的椎間盤組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，TLRs激活與椎間盤退行性變進(jìn)展密切相關(guān)［5］。

既往研究顯示，椎間盤感染低毒性厭氧菌（如痤瘡桿菌）是椎間盤退變的原因之一。痤瘡桿菌能夠在人體及動(dòng)物椎間盤環(huán)境中存活，并通過(guò)激活TLRs途徑誘導(dǎo)退行性變。體外研究顯示，加入兩種痤瘡衣原體菌株刺激椎間盤細(xì)胞后，細(xì)胞中IL-1β、IL-6、IL-8 和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶mRNA 表達(dá)均顯著升高；加入TLR2/4 拮抗劑后，細(xì)胞中IL-6 mRNA 表達(dá)降低［6］。

最新研究認(rèn)為，椎間盤的過(guò)度機(jī)械負(fù)荷會(huì)改變基質(zhì)特性并影響椎間盤細(xì)胞代謝，從而導(dǎo)致退行性椎間盤疾病和椎間盤源性疼痛的發(fā)展，體外椎間盤細(xì)胞的高機(jī)械應(yīng)變培養(yǎng)可使椎間盤細(xì)胞中TLR2、TLR4、TNFα mRNA 表達(dá)上調(diào)［7］。已有研究表明，TLR4參與中央髓核的炎癥反應(yīng)，在發(fā)生椎間盤變性時(shí)其水平上調(diào)。中央髓核細(xì)胞中TLR4 的活化導(dǎo)致細(xì)胞生物物理性質(zhì)的顯著、持久的變化，包括水力滲透性和滲透活性水含量，以及肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的改 變。JACOBSEN 等［8］使 用TLR4 激 動(dòng) 劑 脂 多 糖（LPS）培養(yǎng)從牛椎間盤中分離的中央髓核細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)一氧化氮（NO）釋放增加，IL-6 mRNA 表達(dá)上調(diào)；細(xì)胞水力滲透性和細(xì)胞半徑增加，導(dǎo)致細(xì)胞抗壓剛度降低；利用TLR4 抑制劑TAK-242 處理細(xì)胞能減輕LPS 誘導(dǎo)的皮質(zhì)肌動(dòng)蛋白重塑和IL-6 上調(diào)，保護(hù)中央髓核細(xì)胞的機(jī)械生物學(xué)功能。但是也有研究認(rèn)為，TLRs 對(duì)保持椎間盤的穩(wěn)態(tài)是必須的，TLR2/絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信號(hào)通路對(duì)于髓核細(xì)胞的細(xì)菌吞噬作用和吞噬酶體的形成至關(guān)重要［9］。

在所有細(xì)胞中，TLRs 信號(hào)通路激活的主要結(jié)果都是促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。TLRs信號(hào)通路激活后，促炎細(xì)胞因子和蛋白水解酶的釋放可直接導(dǎo)致椎間盤退變。LI 等［10］報(bào)道，椎間盤退變患者手術(shù)切除的椎間盤組織中存在TLRs mRNA 表達(dá)，其中TLR1、TLR2、TLR4、TLR6 mRNA的表達(dá)量與椎間盤退變程度相關(guān)。WANG 等［11］報(bào)道，以IL-1β 或TNF-α 培養(yǎng)椎間盤細(xì)胞均可增加TLR1、TLR2、TLR4 mRNA 表達(dá)，并造成細(xì)胞衰老和凋亡增加；細(xì)胞凋亡率與IL-1β、TNF-α 濃度和持續(xù)時(shí)間呈正相關(guān)。由此可見(jiàn)，椎間盤細(xì)胞分泌的炎癥因子IL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF-α 與椎間盤退行性變的進(jìn)展直接相關(guān)，具有促進(jìn)趨化因子產(chǎn)生、激活TLRs和分解代謝酶分泌的協(xié)同效應(yīng)。

在椎間盤退行性變過(guò)程中，基質(zhì)降解的蛋白酶活性至關(guān)重要。TLRs 激活導(dǎo)致椎間盤組織中的基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）及聚蛋白多糖酶（ADAMTS）表達(dá)增加，MMPs 和ADAMTS 具有分解細(xì)胞外基質(zhì)中軟骨組織構(gòu)成分子的能力，如纖維連接蛋白、肽聚糖、Ⅰ型和Ⅱ型膠原等。除了上調(diào)基質(zhì)降解酶外，TLRs信號(hào)通路激活還可以抑制細(xì)胞外基質(zhì)合成，從而進(jìn)一步加劇分解代謝［12］。GLAESER 等［13］報(bào)道，對(duì)終板軟骨細(xì)胞采用IL-1β 預(yù)刺激并進(jìn)行機(jī)械負(fù)載，NF-κB mRNA 表達(dá)明顯升高，下游MMP-3、IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 表達(dá)增加；加入NF-κB 抑制劑NEMO 寡肽與終板軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)能夠增加細(xì)胞活力，并降低IL-1β 預(yù)刺激、機(jī)械負(fù)載細(xì)胞中的MMP-3 mRNA 表達(dá)水平。TLRs 是眾多理化及生物因素作用于中央髓核和細(xì)胞外基質(zhì)的靶點(diǎn)，TLRs信號(hào)通路激活可導(dǎo)致異常的炎癥因子及蛋白酶的釋放引起組織破裂。因此，阻斷TLRs/NF-κB 信號(hào)通路可能為椎間盤降解提供一種潛在的降級(jí)治療方法。

2 TLRs在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制

骨關(guān)節(jié)炎是以軟骨和軟骨下骨變性以及滑膜炎相關(guān)為主要病理變化的慢性退行性骨關(guān)節(jié)病。固有免疫受體識(shí)別體內(nèi)外危險(xiǎn)因素后觸發(fā)軟骨和滑膜細(xì)胞的慢性炎癥反應(yīng)，與骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展有直接關(guān)系，無(wú)菌性炎癥可由軟骨細(xì)胞釋放并激活模式識(shí)別受體的損傷相關(guān)分子模式引起［14］。TLR2和TLR4作為固有免疫識(shí)別受體TLRs家族代表，在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展中具有重要作用。

研究顯示，骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)軟骨及滑膜組織中TLR2 和TLR4 mRNA 表達(dá)較正常組織明顯上調(diào)；并且在骨關(guān)節(jié)炎患者滑膜關(guān)節(jié)液和組織中含有能夠激活TLRs 的幾種DAMPs，包括肽聚糖、脫蛋白、S100/鈣粒蛋白家族和透明質(zhì)酸等［15］。YOU 等［16］對(duì)原代培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞加入透明質(zhì)酸后，TLR4、MyD88、TRAF-6 mRNA 表達(dá)明顯增加，下游誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子及MMPs 表達(dá)升高，表明TLRs 被透明質(zhì)酸識(shí)別后可激活信號(hào)通路，引起慢性炎癥和基質(zhì)金屬蛋白酶釋放，引發(fā)關(guān)節(jié)軟骨的分解反應(yīng)。大多數(shù)DAMPs 是由骨關(guān)節(jié)內(nèi)外因素?fù)p傷所產(chǎn)生的軟骨或滑膜衍生物，也有一些來(lái)自于軟骨細(xì)胞衰老崩解釋放的內(nèi)源性物質(zhì)，如dsRNA、高遷移率族蛋白1（HMGB-1）、尿調(diào)素等。LI 等［17］向大鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射HMGB-1 構(gòu)建關(guān)節(jié)炎模型，發(fā)現(xiàn)HMGB-1 可激活TLR4/NF-κB 信號(hào)通路，導(dǎo)致軟骨組織中MMP-13、ADAMTS5、IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)上調(diào)，引起關(guān)節(jié)軟骨破壞、軟骨下骨變性和滑膜炎；而對(duì)TLR4 和Myd88 基因敲除大鼠進(jìn)行同樣的試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)軟骨組織中MMP-13、ADAMTS5、IL-1β、IL-6 mRNA 表達(dá)受到明顯抑制。

研究發(fā)現(xiàn)，骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨組織中TLR7 mRNA 表達(dá)顯著高于健康受試者；向軟骨細(xì)胞中加入TLR4 激活劑LPS 共培養(yǎng)后，TLR7 mRNA 表達(dá)顯著提高，MMP-3、MMP-13 表達(dá)上調(diào)，半胱天冬酶3 和Bax 凋亡蛋白表達(dá)增加，促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡和基質(zhì)降解；加入TLR7 抑制劑siRNA 轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞后，LPS 刺激軟骨細(xì)胞中IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA 表達(dá)顯著下降，緩解LPS 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和ECM 降解［18］。此外，STOLBERG 等［19］對(duì)人類和小鼠軟骨組織進(jìn)行RT-PCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，TLR3、TLR9 也在軟骨組織中表達(dá)；通過(guò)小鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射環(huán)孢素G 構(gòu)建骨關(guān)節(jié)炎模型發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比TLR3 和TLR9敲除顯著降低了小鼠軟骨細(xì)胞凋亡和軟骨基質(zhì)降解，減少滑膜中IL-1β、TNF-α 炎癥浸潤(rùn)，減緩了骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展長(zhǎng)達(dá)8周。

脂多糖結(jié)合蛋白LBP和CD14是TLRs的輔助分子，對(duì)于低度炎癥引起的創(chuàng)傷后骨關(guān)節(jié)炎軟骨破壞是必需的。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，向小鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射TLR2/4 激活劑LPS 后，與野生型小鼠相比，LBP 和CD14 基因敲除小鼠軟骨中IL-1β、IL-6 和ADAMTS5 mRNA 表達(dá)受到抑制，有效緩解了軟骨破壞和滑膜炎［20］?？梢?jiàn)，TLRs介導(dǎo)的信號(hào)通路參與骨關(guān)節(jié)炎軟骨凋亡和滑膜變性的過(guò)程，對(duì)組織修復(fù)和關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞具有重要作用。因此，以TLRs及其介導(dǎo)的信號(hào)通路上作用元件、輔助因子、下游炎癥介質(zhì)等為靶點(diǎn)進(jìn)行干預(yù)，最終達(dá)到骨關(guān)節(jié)炎的緩解甚至治愈，成為骨關(guān)節(jié)炎預(yù)防及治療的新趨勢(shì)。

3 TLRs在骨質(zhì)疏松癥發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制

骨質(zhì)疏松癥的特征是骨密度低，骨小梁微結(jié)構(gòu)退變，骨脆性增強(qiáng)和骨折易感性增加，尤其在絕經(jīng)后婦女中更常見(jiàn)。雌激素缺乏是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松發(fā)生的直接原因，當(dāng)雌激素不足時(shí)，骨合成代謝和抗破骨作用減少，導(dǎo)致持續(xù)的骨破壞引起骨質(zhì)疏松。此外，絕經(jīng)后婦女免疫狀態(tài)的改變也間接導(dǎo)致骨破壞［21］。崔紅旺等［22］報(bào)道，絕經(jīng)前健康婦女接受卵巢切除術(shù)8周后TNF-α 表達(dá)明顯增加，其表達(dá)水平與骨吸收指標(biāo)BV/TV、Tb. Th、Tb. N、Tb. Sp 和骨密度呈正相關(guān)。MARAHLEH 等［23］報(bào)道，將TNF-α與小鼠原代顱骨細(xì)胞共培養(yǎng)后，細(xì)胞中的RANKL mRNA 表達(dá)顯著提高，但OPG mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化，表明TNF-α可間接增高RANKL/OPG 比例，支持破骨細(xì)胞前體存活和分化。在破骨細(xì)胞前體細(xì)胞中加入TNF-α 后，TRAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加；而在TNF受體Ⅰ和Ⅱ缺陷的破骨細(xì)胞前體細(xì)胞共培養(yǎng)物中加入TNF-α 后，未檢出TRAP 陽(yáng)性細(xì)胞。這提示TNF-α 可直接激活破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表面TNF 受體，促進(jìn)破骨前體細(xì)胞分化。由此可見(jiàn)，免疫系統(tǒng)激活導(dǎo)致炎癥因子表達(dá)上調(diào)能夠促進(jìn)破骨前體細(xì)胞分化，加重骨質(zhì)疏松。

TLRs 的表達(dá)模式在破骨細(xì)胞的不同階段各有不同，破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表達(dá)TLR1～9，在向成熟破骨細(xì)胞分化的過(guò)程中主要表達(dá)TLR2 和TLR4，提示TLR2 和TLR4 在破骨細(xì)胞分化過(guò)程中起主要作用。來(lái)自造血干細(xì)胞的破骨細(xì)胞表達(dá)TLRs 并對(duì)DAMPs有反應(yīng)，DAMPs 刺激后會(huì)引起破骨細(xì)胞前體細(xì)胞活化，從而促進(jìn)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞向破骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，促進(jìn)骨質(zhì)疏松癥的進(jìn)展［24］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，在糖尿病骨質(zhì)疏松小鼠中，敲除TLR4 基因可降低TRAP 陽(yáng)性細(xì)胞細(xì)胞率和TNF-α mRNA 表達(dá)水平，改善骨小梁碎裂程度，認(rèn)為TLR4 基因敲除可通過(guò)抑制TLR4 激活和TNF-α 釋放來(lái)減輕骨質(zhì)疏松［25］。因此，調(diào)節(jié)或抑制TLR4 可作為治療骨質(zhì)疏松癥的新的研究方向。ALQRANEI 等［26］報(bào)道，在破骨前體細(xì)胞中加入TLR2/4激活劑LPS后，TRAP 陽(yáng)性細(xì)胞顯著增加；而在加入RANKL預(yù)培養(yǎng)與未加入RANKL的破骨前體細(xì)胞同時(shí)加入LPS 后，兩者之間TRAP 陽(yáng)性細(xì)胞率無(wú)顯著差異，RANKL、OPG mRNA 表達(dá)水平無(wú)明顯變化，表明TLR4 激活能獨(dú)立于RANKL/RANKL/OPG 軸以外引發(fā)破骨細(xì)胞活化；在LPS 孵育的破骨前體細(xì)胞中加入TLR2/4 抑制劑TAK-242 能夠顯著降低TRAP 陽(yáng)性細(xì)胞率，表明對(duì)TLR4 干預(yù)能抑制破骨前體細(xì)胞活化，延緩骨質(zhì)疏松進(jìn)展。

研究發(fā)現(xiàn)，TLRs 信號(hào)通路可將RANKL 信號(hào)通路中的下游分子隔離開來(lái)，從而抑制破骨細(xì)胞早期分化。在小鼠骨髓源性巨噬細(xì)胞和人外周血單核細(xì)胞中，同時(shí)加入RANKL 和TLRs 激活劑LPS 后，與較單純RANKL 孵育相比TRAP 陽(yáng)性細(xì)胞率顯著降低，表明TLRs在破骨前體活化早期階段有負(fù)面作用；而在破骨前體細(xì)胞中加入RANKL 預(yù)處理24 h 后再加入LPS 培養(yǎng)48h 后，與單純RANKL 孵育72 h 相比，TRAP 陽(yáng)性細(xì)胞率顯著提高，表明盡管TLRs 在破骨細(xì)胞形成的早期階段有負(fù)面作用，但在破骨前體細(xì)胞分化的后期階段具有積極作用［27］。因此，靶向TLRs 誘導(dǎo)的破骨前體細(xì)胞活化可能是一種有效的抑制骨質(zhì)疏松癥等溶骨性疾病治療策略。

TLRs 受體不僅表達(dá)在破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表達(dá)，在成骨細(xì)胞膜表面也有大量表達(dá)。FISCHER 等［28］從小鼠顱骨分離出成骨細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，加入LPS后，成骨細(xì)胞膜上的TLR2、TLR4 mRNA 表達(dá)上調(diào)，RANKL mRNA 在2 h 內(nèi)顯著上調(diào)，而OPG mRNA 水平相對(duì)較低，表明成骨細(xì)胞膜上TLR2/4 的激活能夠上調(diào)RANKL mRNA 表達(dá)，促進(jìn)破骨前體細(xì)胞活化，進(jìn)而發(fā)生骨質(zhì)疏松。此外，王瑞等［29］、張倩璐等［30］報(bào)道，在孵育的成骨細(xì)胞中加入LPS后，成骨分化基因ALP 和OCN 表達(dá)受到抑制，用siRNA 轉(zhuǎn)染TLR4 后顯著增加成骨分化基因水平和成骨細(xì)胞礦化能力?？傊?，TLRs可以通過(guò)增加破骨前體細(xì)胞活化和抑制成骨細(xì)胞活性導(dǎo)致骨質(zhì)疏松，成骨細(xì)胞也可能通過(guò)干擾RANKL/RANK/OPG 軸，作用于未分化破骨細(xì)胞前體細(xì)胞加劇骨質(zhì)疏松。因此，通過(guò)靶向調(diào)控TLRs 及下游信號(hào)不失為一種干預(yù)骨質(zhì)疏松進(jìn)展的方法。

綜上所述，固有免疫系統(tǒng)異常激活釋放炎癥介質(zhì)參與骨細(xì)胞凋亡和組織損傷過(guò)程，在椎間盤退行性變、骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。當(dāng)前以TLRs 作為固有免疫異常激活干預(yù)靶點(diǎn)的研究尚處于起步階段，具體信號(hào)通路錯(cuò)綜復(fù)雜，深入研究TLRs 在骨退行性疾病中的作用機(jī)制可以為骨退行性疾病的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。TLRs 激活導(dǎo)致溶骨性改變和基質(zhì)蛋白水解機(jī)制是開發(fā)新型抗骨退行性病變藥物的一種很有前途的治療策略，但是目前還局限于離體細(xì)胞或動(dòng)物試驗(yàn)，臨床證據(jù)不足，還需要進(jìn)行更多的臨床試驗(yàn)。