miRNA在股骨頭壞死修復(fù)過程中的作用研究進(jìn)展

潘海達(dá)，曾平

1 永嘉縣中醫(yī)醫(yī)院傷骨科，浙江永嘉 325100；2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院仙葫院區(qū)骨科

股骨頭壞死（ONFH）是指各種原因造成股骨頭局部血流動力學(xué)改變導(dǎo)致的髖關(guān)節(jié)疾病，具有病程纏綿、難以修復(fù)的特點。其早期癥狀不明顯，發(fā)病隱秘，大多數(shù)患者就診時股骨頭軟骨面已出現(xiàn)塌陷，即不同程度的微骨折。ONFH 進(jìn)展不可逆，如不積極治療，將很快發(fā)展至骨關(guān)節(jié)炎階段。ONFH 的預(yù)后取決于缺血再灌注、新生股骨對死骨的爬行替代程度［1］。在ONFH 修復(fù)過程中，會經(jīng)歷骨質(zhì)壞死變性、壞死骨質(zhì)吸收肉芽組織長入、血管組織鈣化修復(fù)三個階段，包含破骨細(xì)胞增殖壞死骨質(zhì)吸收、修復(fù)帶內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長活躍及成骨細(xì)胞骨爬行替代過程［2］。miRNA 是一類小的非編碼RNA，具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)的功能。miRNA 表達(dá)具有高度的組織特異性，并在關(guān)鍵的生理過程中受到動態(tài)調(diào)控［3］。研究表明，miRNA 幾乎參與了所有生物過程，包括細(xì)胞增殖、分化、衰老、凋亡、腫瘤形成和應(yīng)激反應(yīng)［4］?，F(xiàn)就miRNA 在ONFH 病理修復(fù)過程中作用的研究進(jìn)展綜述如下。

1 miRNA參與ONFH修復(fù)過程中的血管生成

ONFH 在磁共振成像T2加權(quán)成像中具有典型的“雙線征”，其中高信號區(qū)即血管長入及肉芽組織爬行替代區(qū)域。血管長入涉及細(xì)胞增殖、遷移、分化、管形成，并受到血管生成因子的調(diào)控，miRNA參與了ONFH壞死修復(fù)過程中血管的生成及爬行替代。

血管生成受多種生長因子的調(diào)節(jié)，例如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和血管內(nèi)皮鈣黏蛋白。研究顯示，在小鼠靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中，miR-10a 過表達(dá)可導(dǎo)致VEGF 和血管內(nèi)皮鈣黏蛋白表達(dá)水平降低；而轉(zhuǎn)染miR-10a抑制劑后，細(xì)胞中VEGF 和血管內(nèi)皮鈣黏蛋白表達(dá)水平恢復(fù)正常。miR-92a 作為血管生成的負(fù)向調(diào)節(jié)劑，在人類內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)，其表達(dá)量與年齡呈負(fù)相關(guān)。MURATA 等［4］比較了4 例大轉(zhuǎn)子骨折患者和4 例健康對照者的血漿miRNA 濃度，發(fā)現(xiàn)骨折患者發(fā)病24 h 后miR-92a 表達(dá)水平開始降低，而發(fā)病后21 d 恢復(fù)正常；為了確定miR-92a 在骨折愈合中的作用，該研究對股骨骨折小鼠靜脈注射miR-92a 拮抗劑LNA 穩(wěn)定寡核苷酸，結(jié)果顯示拮抗劑組較對照組骨痂形成、重塑良好，其血管數(shù)量、血管面積較對照組分別高出74%、200%。這表明抑制miR-92a表達(dá)可以促進(jìn)血管新生，促進(jìn)ONFH局部微骨折的修復(fù)和壞死組織的爬行替代。

與miR-92a 相反，miR-126 是體內(nèi)血管生成信號傳導(dǎo)的正向調(diào)節(jié)劑。miR-126 可通過直接抑制多個靶標(biāo)來增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞對VEGF 的反應(yīng)，包括Sprouty 相關(guān)的EVH1 結(jié)構(gòu)域含蛋白1、磷酸肌醇3 激酶調(diào)節(jié)亞基2、血管細(xì)胞黏附分子1［5］，從而促進(jìn)血管生成及維持血管內(nèi)皮細(xì)胞的完整性。

缺氧與血管新生密不可分，缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）與VEGF 協(xié)同作用，在低氧低灌注條件下刺激血管新生，改善局部缺血。研究顯示，miR-18a、miR-20a、miR-20b等均參與了細(xì)胞內(nèi)HIF的調(diào)控，影響血管生成［6］。同時，血管的生成與爬行替代對局部組織修復(fù)、壞死吸收具有滋養(yǎng)作用，特別是在承重區(qū)，即股骨頭中內(nèi)、側(cè)柱，壞死區(qū)血供對于“帶塌陷”生存、血供豐富與否起到關(guān)鍵性作用。

2 miRNA參與ONFH修復(fù)過程中的骨代謝

2.1 miRNA與破骨細(xì)胞 ONFH患者股骨頭X線下“新月征”的出現(xiàn)，提示局部股骨頭存在病理性微骨折，其過程包含空骨陷窩的增多、破骨細(xì)胞的增殖及骨質(zhì)的吸收和破壞。在ONFH發(fā)病過程中，破骨細(xì)胞對骨質(zhì)的破壞與吸收對于疾病進(jìn)程和預(yù)后尤為重要。

c-Fos 與破骨細(xì)胞功能調(diào)節(jié)密切相關(guān)，c-Fos 作為破骨細(xì)胞的“感受器”被核因子κB 受體激活因子（RANK）配體激活后，可以誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化［7］。c-Fos 的觸發(fā)激活過程需要miR-21 參與，同時miR-21還可以上調(diào)程序性細(xì)胞死亡4蛋白（PDCD4）表達(dá)水平，并激活c-Fos，從而激活破骨細(xì)胞。實驗發(fā)現(xiàn)，敲除miR-21的小鼠PDCD4蛋白表達(dá)水平受到抑制，提示破骨細(xì)胞的激活及活性與miR-21相關(guān)［8］。

與miR-21 具有相反作用的有miR-503 和miR-148a。RANK 是一種表達(dá)在破骨細(xì)胞前體上的Ⅰ型膜蛋白，miR-503的種子區(qū)與RANK mRNA的氨基酸編碼序列可互補(bǔ)結(jié)合。在卵巢切除小鼠中，抑制miR-503 表達(dá)可導(dǎo)致破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)從而骨吸收增加；體外實驗表明，向人外周血單個核細(xì)胞培養(yǎng)基中分別轉(zhuǎn)染pre-miR-503、antago-miR-503 后用于培養(yǎng)破骨細(xì)胞，前者培養(yǎng)的破骨細(xì)胞活性降低，而后者培養(yǎng)的破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)［9］。在一項微陣列測定中發(fā)現(xiàn)，has-miR-148a、has-miR-483、has-miR-223、hasmiR-21、has-miR-214 被上調(diào)，而has-miR-155、hasmiR-125a、has-miR-27b、has-miR-145 被下調(diào)；實時熒光定量PCR 結(jié)果與miRNA 微陣列結(jié)果一致，其中miR-148a 在破骨細(xì)胞分化中顯著上調(diào)；體外實驗表明，miR-148a可通過抑制NFATc1和肌肉—神經(jīng)纖維肉瘤癌基因同源物B從而抑制破骨細(xì)胞活性［10］。

miRNA通過介導(dǎo)破骨分化及活性，影響死骨的吸收及骨質(zhì)的破壞，對于壞死骨組織吸收、塌陷的進(jìn)展與否，具有決定性意義。如何通過miRNA抑制破骨細(xì)胞活性，從而延緩甚至阻滯塌陷的進(jìn)展，保持股骨頭球形結(jié)構(gòu)完整，對于ONFH的治療具有重要意義。

2.2 miRNA 與成骨細(xì)胞 在ONFH 壞死修復(fù)過程中，“硬化帶”的出現(xiàn)一定程度上是成骨細(xì)胞主導(dǎo)的骨修復(fù)在影像學(xué)上的表現(xiàn)。ONFH的預(yù)后與其修復(fù)方式是“成骨性修復(fù)”還是“破骨性修復(fù)”相關(guān)［11］。因此，成骨細(xì)胞的活性對于ONFH的修復(fù)具有重要意義。

研究發(fā)現(xiàn)，miR-214 在體內(nèi)和體外均對成骨細(xì)胞的增殖分化具有抑制作用［11］。已知轉(zhuǎn)錄激活因子4C（ATF4）對成骨細(xì)胞分化和功能具有關(guān)鍵作用，miR-214可直接與ATF4的3'-UTR位點結(jié)合，從而表現(xiàn)出對成骨細(xì)胞活性的抑制作用［12］。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）在成骨細(xì)胞生長、分化、凋亡等過程中發(fā)揮重要作用［13］。小鼠成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-542-3p 后可抑制BMP 表達(dá)，導(dǎo)致成骨細(xì)胞凋亡增加及增殖減少；對成骨細(xì)胞給予miR-542-3p 干預(yù)后，細(xì)胞內(nèi)半胱天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）含量增加，Caspase-3作為成骨細(xì)胞凋亡因子，會導(dǎo)致成骨細(xì)胞凋亡；同樣干預(yù)BMP 形成的還有miR-133 和miR-135，過表達(dá)miR-133或miR-135會抑制堿性磷酸酶、骨鈣素和同源框A10生成，進(jìn)而抑制成骨分化［14］。骨膠原蛋白代謝異?？蓪?dǎo)致ONFH、骨關(guān)節(jié)炎在內(nèi)的各種骨病發(fā)生。對于成骨細(xì)胞系，miR-29b雖然不會抑制未成熟成骨細(xì)胞中的膠原蛋白表達(dá)，但會導(dǎo)致分化后期膠原mRNA水平下降［15］。這可能是由于miR-29b選擇性剪接不同的膠原3′-UTR位點所致［16］。

骨穩(wěn)態(tài)對ONFH 的轉(zhuǎn)歸、進(jìn)展具有重要作用，成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞處于競爭狀態(tài)。在治療ONFH時，如何在抑制破骨細(xì)胞活性的同時促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，miRNA提供了一個新的角度。

3 miRNA 參與ONFH 修復(fù)過程中的間充質(zhì)干細(xì)胞分化

間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞（MSCs）在組織工程和再生醫(yī)學(xué)中具有廣闊的應(yīng)用前景。MSCs 能夠分化為脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和肌細(xì)胞，其中成脂分化與骨分化存在相互抑制關(guān)系。脂肪代謝紊亂是ONFH的重要病因之一［2］，因此在ONFH 的治療中，MSCs的分化至關(guān)重要。

MSCs在分化過程中受多種信號通路交互影響，其中包含RUNX 家族轉(zhuǎn)錄因子2（Runx2）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）。miR-204可以通過抑制Runx2，從而抑制MSCs 的成骨分化，同時增強(qiáng)MSCs 的成脂分化。與其類似作用的還有miR-637，不同的是miR-637 作為成骨轉(zhuǎn)錄因子抗體發(fā)揮作用［17］。研究顯示，對MSCs 給予糖皮質(zhì)激素干預(yù)后，miR-708 含量明顯增高，且成脂分化活躍、成骨抑制［18］。另有研究發(fā)現(xiàn)，miR-708 與母親DPP 同源物3（SMAD3）3′-UTR 位點相結(jié)合后，激活的SMAD3 可以干擾CCAAT轉(zhuǎn)錄因子與Runx2啟動子內(nèi)的負(fù)調(diào)控元件結(jié)合，從而介導(dǎo)MSCs成脂或成骨分化趨勢［19］。

PPARγ 是脂肪形成的重要調(diào)控因子，其在脂肪細(xì)胞形成中具有不可替代的作用，經(jīng)激活的PPARγ不僅能夠抑制成骨分化，還能明顯增加MSCs 的成脂分化［20］。miR-27b 可以抑制PPARγ 和CCAAT 轉(zhuǎn)錄因子這兩種關(guān)鍵的成脂轉(zhuǎn)錄因子，從而抑制MSCs成脂分化。同樣，miR-21 也可以通過抑制Smad3 磷酸化從而抑制MSCs成脂分化［21］。

此外，Wnt/β-Catenin 信號通路在調(diào)控MSCs 分化中起到重要作用。糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）、連環(huán)蛋白拮抗因子同源物1 作為miR-8485 的靶點，當(dāng)miR-8485 在體內(nèi)高表達(dá)時，其可激活連環(huán)蛋白拮抗因子同源物1、GSK-3β，從而激活Wnt/β-Catenin信號通路，進(jìn)而促使MSCs向軟骨分化。

4 miRNA參與ONFH修復(fù)過程中的炎癥反應(yīng)

研究顯示，ONFH 患者血清中的淋巴細(xì)胞數(shù)量與病情嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)［22］。減少的淋巴細(xì)胞可以產(chǎn)生TGF-β、IL-4、IL-10 等炎癥因子，而局部無菌性炎 癥 也 是ONFH 的 病 理 表 現(xiàn)［2］。miRNA 參 與 了ONFH修復(fù)過程中的炎癥反應(yīng)。

TGF-β 可通過刺激PLCγ/PKCα 磷酸化，增強(qiáng)血紅素加氧酶1（HO-1）等多種炎癥因子表達(dá)；miR-744可與TGF-β 近端的3'-UTR 位點結(jié)合，從而減少局部炎癥反應(yīng)；轉(zhuǎn)染miR-744 的人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清中，TGF-β含量明顯減少［23］。miR-519b則能干擾HO-1轉(zhuǎn)錄，隨著miR-519b表達(dá)降低，HO-1表達(dá)增強(qiáng)，表明miR-519b 可以通過TGF-β 直接參與ONFH局部炎癥反應(yīng)［24］。

磷脂酶和張力蛋白同源物（PTEN）是T淋巴細(xì)胞活化的負(fù)調(diào)節(jié)劑，同時又是miR-181a 的作用靶點。miR-181a 抑制PTEN 可激活PI3K 信號通路和活化T淋巴細(xì)胞核因子5表達(dá)［25］。高表達(dá)的miR-181a激活PI3K 通路，并刺激T 淋巴細(xì)胞增殖、分化等生物過程；miR-181a還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞對外界刺激的敏感性，改變T淋巴細(xì)胞的信號閾值，進(jìn)而影響T淋巴細(xì)胞活性［26］。在ONFH 的病理過程中，無菌性炎癥反復(fù)刺激，導(dǎo)致局部微循環(huán)障礙，是ONFH局部持續(xù)腫脹、疼痛的重要原因之一。目前研究顯示，miNRA 與ONFH的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后相關(guān)，但將miRNA 作為ONFH的診斷甚至治療手段還需要進(jìn)一步探索。

miRNA 是影響病理生理、疾病轉(zhuǎn)歸的重要生物因子。miRNA參與了ONFH血管生成、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、MSCs 修復(fù)過程、局部炎癥反應(yīng)等生理病理過程，對ONFH 的發(fā)生、發(fā)展、診斷、治療、預(yù)后具有重要意義。目前關(guān)于miRNA 參與ONFH 修復(fù)的具體過程、機(jī)制尚處于探索階段，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，miRNA參與ONFH生物學(xué)的過程將逐漸明了，從而為ONFH的臨床診療提供新的思路。