L-蘇氨酸發(fā)酵液穩(wěn)定性探究及副產(chǎn)物測(cè)定

(1.通遼梅花生物科技有限公司,內(nèi)蒙古 通遼 028024;2.廊坊梅花生物技術(shù)開發(fā)有限公司,河北 廊坊 065001)

L-蘇氨酸的生產(chǎn)方法主要有微生物發(fā)酵法[17-18]、蛋白質(zhì)水解法和合成法[19],其中微生物發(fā)酵法工藝簡(jiǎn)單,成本低,是當(dāng)前的主流方法。在發(fā)酵法生產(chǎn)L-蘇氨酸過程中,發(fā)現(xiàn)提取母液中甘氨酸質(zhì)量濃度較高,而發(fā)酵液中甘氨酸質(zhì)量濃度較低。為探究母液中甘氨酸的來源,筆者對(duì)各生產(chǎn)環(huán)節(jié)的氨基酸質(zhì)量濃度進(jìn)行監(jiān)測(cè),最終確定是溫度和pH變化導(dǎo)致L-蘇氨酸降解,產(chǎn)生甘氨酸。發(fā)酵液過陶瓷膜,除去菌體,得到清液,清液經(jīng)過濃縮、結(jié)晶、分離,得到母液[20]。在L-蘇氨酸提取工藝中,一般L-蘇氨酸清液的pH約為6,濃縮溫度約50 ℃,溫度和pH失控會(huì)影響產(chǎn)品質(zhì)量。因此,筆者開展了L-蘇氨酸穩(wěn)定性研究并對(duì)其副產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈,色譜純,德國Meker公司;甲醇,色譜純,德國Meker公司;鄰苯二甲醛試劑(OPA),安捷倫公司;硼酸緩沖液,安捷倫公司;L-蘇氨酸標(biāo)準(zhǔn)品,Sigma公司;L-甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),Sigma公司;二水合磷酸二氫鈉;氫氧化鈉;鹽酸;乙醛,麥克林;2,4-二硝基苯肼,Sigma公司;所有藥品均為國藥分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀1200,Agilent Technologies;Mili-Q超純水機(jī);電子天平(精度±0.000 1 g),梅特勒;真空泵,津騰;pH計(jì),梅特勒;電子萬用爐,北京永光明。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

L-蘇氨酸發(fā)酵液10 000 r/min離心5 min,得到L-蘇氨酸清液。首先,分別吸取20 mL清液置于3支試管中;然后,分別吸取純水5 mL、6 mol/L的氫氧化鈉溶液5 mL、6 mol/L的鹽酸溶液5 mL,依次滴入盛有L-蘇氨酸清液的試管中,混勻;最后,從每支試管中各取10 mL樣液,密封,分別20,40,60,80,100 ℃水浴處理30 min,取出冷卻。分別檢測(cè)處理前后樣液的pH以及L-蘇氨酸、甘氨酸和乙醛的質(zhì)量濃度。

1.3.2 檢測(cè)方法

測(cè)定氨基酸質(zhì)量濃度的方法主要有HPLC法[21-22]、氨基酸分析儀法[23]、茚三酮法[24]、紙層析法[25-26]、甲醛滴定法[27]和酶法[28]等,筆者采用的是HPLC法。

1) HPLC色譜柱衍生法測(cè)定氨基酸質(zhì)量濃度

實(shí)驗(yàn)組患者主訴良好達(dá)到100%(55例),并表示愿意再次接受檢查治療;常規(guī)組患者主訴良好,且表示愿意再次接受診療的患者占比76.36%(42例),兩組數(shù)據(jù)比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,X2=14.7423)。

流動(dòng)相A的制備:稱取6.24 g二水合磷酸二氫鈉,轉(zhuǎn)移到1 000 mL玻璃燒杯中,加入1 000 mL超純水,攪拌,直至晶體完全溶解,用氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH至7.8。

流動(dòng)相B的制備:準(zhǔn)確量取各試劑并混勻,V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(水)=45∶45∶10。

色譜條件:色譜柱ZORBAX Eclipse AAA 4.6 mm×75 mm 3.5-Micron,柱溫40 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)338 nm,流速2.0 mL/min,OPA柱前衍生。

洗脫條件:流動(dòng)相A,B按不同比例混合,梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:準(zhǔn)確稱取L-蘇氨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.1 g,先用蒸餾水定容至100 mL,配制成1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液,再分別稀釋成不同質(zhì)量濃度的溶液備用,即0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 g/L。將不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液采用HPLC法進(jìn)行色譜分離,以峰面積為縱坐標(biāo),標(biāo)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

樣品稀釋處理:將待測(cè)樣品稀釋到質(zhì)量濃度到標(biāo)準(zhǔn)曲線中間點(diǎn)0.5 g/L的附近,搖勻,用0.22 μm的濾膜過濾。將處理好的試樣上機(jī)編序列,進(jìn)行柱前衍生色譜分離測(cè)定。

2) HPLC衍生法測(cè)乙醛質(zhì)量濃度

流動(dòng)相為V(乙腈)∶V(水)=65∶35,色譜條件為色譜柱C18-A(250 mm×4.6 mm×5 μm),柱溫30 ℃,進(jìn)樣量10 μL,波長(zhǎng)360 nm。

衍生劑的制備:稱取1 g的2,4-二硝基苯肼置于1 000 mL的容量瓶中,加入6 mL的85%磷酸,用乙腈定容至1 000 mL。

標(biāo)準(zhǔn)品的制備:稱取約0.01 g乙醛標(biāo)準(zhǔn)品,用乙腈定容至100 mL,搖勻。取0.1 mL配制好的乙醛標(biāo)準(zhǔn)品置于10 mL容量瓶中,加入1 mL衍生劑,搖勻后用乙腈定容至10 mL,在室溫下放置25 min,用0.22 μm有機(jī)相針式濾器過濾,上機(jī)檢測(cè)。

樣品的制備:取1 mL樣品于10 mL容量瓶中,加入1 mL衍生劑,搖勻后用乙腈定容至10 mL,在室溫下放置25 min,用0.22 μm有機(jī)相針式濾器過濾,上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

在發(fā)酵代謝途徑中,L-蘇氨酸可分解為兩碳甘氨酸和兩碳乙醛,通過對(duì)L-蘇氨酸代謝途徑、代謝副產(chǎn)物成分及理化性質(zhì)的分析,得出溫度和pH是影響發(fā)酵液中L-蘇氨酸分解的關(guān)鍵因素,因此筆者展開不同溫度和pH的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

2.1 pH變化

將L-蘇氨酸發(fā)酵液10 000 r/min離心5 min,得到L-蘇氨酸清液。先分別吸取20 mL清液置于3支試管中,再分別吸取6 mol/L的鹽酸溶液5 mL、純水5 mL、6 mol/L氫氧化鈉溶液5 mL，依次滴入盛有L-蘇氨酸清液的試管中,分別得到pH為0.4,6.0,13.1的樣液。樣液分別經(jīng)過20,40,60,80,100 ℃水浴處理30 min,當(dāng)pH為0.4時(shí),隨著溫度的升高,pH相差約±0.02;當(dāng)pH為6時(shí),隨著溫度的升高,pH相差約±0.02;當(dāng)pH為13時(shí),隨著溫度的升高,pH相差約±0.02,具體結(jié)果見表2。由表2可知:不同pH的L-蘇氨酸樣液,經(jīng)不同溫度加熱處理,pH無變化。

表2 不同溫度下pH的變化

2.2 L-蘇氨酸質(zhì)量濃度變化

取L-蘇氨酸發(fā)酵液10 000 r/min離心5 min,得到L-蘇氨酸清液,分別吸取20 mL清液于試管中,再分別吸取6 mol/L鹽酸和純水各5 mL,得到pH為0.4和6的樣液,分別經(jīng)過20,40,60,80,100 ℃水浴處理后,L-蘇氨酸質(zhì)量濃度相差小于0.3 g/L,可視為相同;吸取20 mL清液于試管中,再吸取6 mol/L氫氧化鈉,得到pH為13.1的樣液,分別經(jīng)過20,40,60,80,100 ℃水浴處理后,在80 ℃條件下,L-蘇氨酸開始逐漸分解,100 ℃時(shí)分解加劇,L-蘇氨酸降解了9.0 g/L,具體見表3。由表3可知:在酸性和中性加熱條件下L-蘇氨酸較穩(wěn)定;在堿性加熱條件下L-蘇氨酸開始分解,質(zhì)量濃度降低,降解率約10%。

表3 不同溫度下L-蘇氨酸質(zhì)量濃度的變化

2.3 甘氨酸質(zhì)量濃度變化

L-蘇氨酸發(fā)酵液經(jīng)過前處理后,得到pH為0.4,6的樣液,經(jīng)不同溫度處理后,甘氨酸質(zhì)量濃度相差約0.01 g/L,L-蘇氨酸的質(zhì)量濃度不變;L-蘇氨酸發(fā)酵液經(jīng)前處理后得到pH為13.1的樣液,在80 ℃條件下,甘氨酸質(zhì)量濃度開始提高,在100 ℃時(shí)約提高4 g/L,加熱后甘氨酸質(zhì)量濃度提高了3.5 g/L,具體結(jié)果見表4。由表4可知:在酸性和中性加熱條件下L-蘇氨酸較穩(wěn)定,在堿性加熱(80,100 ℃)條件下甘氨酸質(zhì)量濃度提高。

表4 不同溫度下甘氨酸質(zhì)量濃度的變化

2.4 乙醛質(zhì)量濃度變化

L-蘇氨酸發(fā)酵液經(jīng)過前處理后得到pH為0.4,6的樣液,經(jīng)不同溫度處理后,檢測(cè)到乙醛質(zhì)量濃度為0;L-蘇氨酸發(fā)酵液經(jīng)過前處理后得到pH為13.1的樣液,經(jīng)不同溫度處理后,乙醛質(zhì)量濃度在100 ℃時(shí)約提高0.002 g/L,具體結(jié)果見表5。由表5可知:只有在100 ℃,pH 13.1加熱條件下,才能檢測(cè)到乙醛。

表5 不同溫度下乙醛質(zhì)量濃度變化

2.5 母 液

取5批不同批次的L-蘇氨酸發(fā)酵液和母液,分別檢測(cè)L-蘇氨酸和甘氨酸質(zhì)量濃度,其中1,2,3批母液中L-蘇氨酸質(zhì)量濃度為115～119 g/L,甘氨酸為16～17 g/L;4,5批母液中L-蘇氨酸質(zhì)量濃度下降到約75 g/L,甘氨酸質(zhì)量濃度提高了35 g/L;發(fā)酵液中L-蘇氨酸質(zhì)量濃度為110 g/L,甘氨酸為0.4 g/L,具體結(jié)果見表6。一般母液中L-蘇氨酸質(zhì)量濃度約115 g/L,而4,5兩個(gè)批次中L-蘇氨酸質(zhì)量濃度偏低,值為40 g/L,甘氨酸質(zhì)量濃度提高到約原來的2倍。分析其原因:樣液4,5批清液的pH約13,在提取工藝中溫度失控,約為80 ℃,導(dǎo)致L-蘇氨酸分解成甘氨酸,甘氨酸在母液中殘留積累。因此,在提取工藝中,要嚴(yán)格遵照標(biāo)準(zhǔn),避免由于操作失誤或儀器失控引起料液分解,確保產(chǎn)品質(zhì)量。發(fā)酵液液相色譜峰圖如圖1所示,母液液相色譜峰圖如圖2所示。

表6 發(fā)酵液和母液中L-蘇氨酸和甘氨酸質(zhì)量濃度

1—甘氨酸;2—L-蘇氨酸。

1—甘氨酸;2—L-蘇氨酸。

3 結(jié) 論

L-蘇氨酸發(fā)酵液的穩(wěn)定性受溫度和pH的影響。筆者采用不同pH和溫度進(jìn)行驗(yàn)證,得出L-蘇氨酸發(fā)酵液在酸性、中性條件下穩(wěn)定,在堿性加熱(80,100 ℃)條件下,分解為甘氨酸。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:不同批次的L-蘇氨酸、甘氨酸質(zhì)量濃度差異較大,其中母液4,5批在提取過程中溫度高于80 ℃,pH為13,此時(shí)L-蘇氨酸分解,甘氨酸質(zhì)量濃度提高。故在L-蘇氨酸提取工藝中,要嚴(yán)格控制溫度和pH,確保它們?cè)谝?guī)定范圍內(nèi),以防止L-蘇氨酸分解,保證產(chǎn)品質(zhì)量。