復(fù)合菌固體發(fā)酵蛋殼粉制備乳酸鈣

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 410128)

我國(guó)每年產(chǎn)生大量的廢棄雞蛋殼,如果不及時(shí)對(duì)它們加以處理,雞蛋殼中的殘余物就可能會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染。此外,由于雞蛋殼中約93%的成分為碳酸鈣,這也將在一定程度上導(dǎo)致大量的鈣元素被浪費(fèi)[1-2]。隨著全球?qū)Νh(huán)保問(wèn)題關(guān)注度的提升,越來(lái)越多的研究者開(kāi)展了有關(guān)廢棄蛋殼再利用的研究。對(duì)雞蛋殼的有效再利用不但對(duì)生態(tài)環(huán)境具有保護(hù)作用,而且能提高以雞蛋為原料的產(chǎn)品的附加值,并促進(jìn)我國(guó)蛋雞產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[3]。目前,我國(guó)利用廢棄雞蛋殼提取鈣元素的方式之一是將雞蛋殼中的碳酸鈣通過(guò)各種手段轉(zhuǎn)化成其他附加值更高形式的鈣,比如乳酸鈣、葡萄糖酸鈣和丙酸鈣等有機(jī)酸鈣[4]。將乳酸鈣添加到飼料中對(duì)家畜的健康具有正面效果,王繼華等[5]和Suiryanrayna等[6]的研究顯示:乳酸鈣在仔豬的腸道中可以降低飼料的系酸力,有選擇性地刺激有益細(xì)菌生長(zhǎng)并增加腸壁吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的效率,進(jìn)而改善仔豬健康,特別是對(duì)于新斷奶仔豬較為有益。與其他常用的轉(zhuǎn)化蛋殼源碳酸鈣為乳酸鈣的方法相比,微生物轉(zhuǎn)化法具有能耗低、不產(chǎn)生廢液和廢氣,以及生產(chǎn)成本較低的優(yōu)點(diǎn)[7]。

國(guó)內(nèi)有許多研究者已經(jīng)開(kāi)展了以雞蛋殼為原料通過(guò)微生物發(fā)酵的方式制備乳酸鈣的研究,蘇亮等[8]優(yōu)化了使用鼠李糖桿菌發(fā)酵雞蛋殼制備乳酸鈣的發(fā)酵工藝,使發(fā)酵液中的乳酸鈣質(zhì)量濃度達(dá)到了89.68 g/L。黃翔等[9]使用了4種乳酸菌發(fā)酵雞蛋殼制備乳酸鈣,其乳酸鈣質(zhì)量濃度達(dá)40.01 g/L。也有研究者選擇以鴨蛋殼為原料制備乳酸鈣,胡波平[10]優(yōu)化了使用乳酸桿菌發(fā)酵鴨蛋殼粉制備乳酸鈣的發(fā)酵工藝,使鴨蛋殼的轉(zhuǎn)化率達(dá)到了93.03%。目前有關(guān)發(fā)酵蛋殼制備乳酸鈣的研究大都采用了液體發(fā)酵的方式,以固體發(fā)酵的方式制備乳酸鈣的研究較為少見(jiàn)。相較于液體發(fā)酵,固體發(fā)酵可節(jié)約大量的水資源,也可以減少發(fā)酵時(shí)對(duì)環(huán)境造成的污染,同時(shí)固體發(fā)酵相較于液體發(fā)酵所需要的設(shè)備更少,對(duì)能源的消耗量更低,可以進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本[11]。此外,由于枯草芽孢桿菌能夠分泌多種酶,產(chǎn)生枯草菌素、多黏菌素、制霉菌素和短桿菌肽等多種抗菌物質(zhì),在固體發(fā)酵時(shí)使用枯草芽孢桿菌不僅可以幫助降解發(fā)酵培養(yǎng)基中的大分子物質(zhì),也可以進(jìn)一步降低發(fā)酵培養(yǎng)基被污染的概率[12]。筆者使用實(shí)驗(yàn)室保藏的嗜酸小球菌和枯草芽孢桿菌進(jìn)行復(fù)合菌發(fā)酵蛋殼粉實(shí)驗(yàn),根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,將嗜酸小球菌和枯草芽孢桿菌的接種體積比設(shè)置為2∶1,以發(fā)酵產(chǎn)物中乳酸鈣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)優(yōu)化發(fā)酵工藝,以期為使用微生物進(jìn)行固體發(fā)酵生產(chǎn)蛋殼源乳酸鈣提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌 種

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis),嗜酸小球菌(Pediococcusacidilactici)。

1.1.2 主要試劑與原料

NaCl,無(wú)水乙酸鈉,KH2PO4,K2HPO4,葡萄糖,鈣試劑羧酸鈉鹽,EDTA,NaOH,蛋白胨,胰蛋白胨,酵母粉,豆粕,蛋殼粉(將收集來(lái)的雞蛋殼去除內(nèi)膜后粉碎獲得)。

1.1.3 培養(yǎng)基及其他試劑配制方法

MRS液體培養(yǎng)基:葡萄糖6 g,K2HPO40.3 g,無(wú)水乙酸鈉2 g,酵母提取粉0.8 g,蛋白胨1.2 g,超純水200 mL。待培養(yǎng)基成分充分溶解后,將配制好的培養(yǎng)基放置于滅菌鍋中于115 ℃滅菌30 min,待培養(yǎng)基冷卻至室溫后留作備用。

LB液體培養(yǎng)基:胰蛋白胨2 g,酵母提取粉1 g,氯化鈉2 g,超純水200 mL。待培養(yǎng)基成分充分溶解后,將配制好的培養(yǎng)基放置于滅菌鍋中于115 ℃滅菌30 min,待培養(yǎng)基冷卻至室溫后留作備用。

鈣試劑羧酸鈉指示劑:稱取鈣試劑羧酸鈉鹽0.1 g,加入約110 ℃干燥過(guò)的氯化鈉10 g,研磨并混勻。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化

在先前配制好的MRS液體培養(yǎng)基中接種嗜酸小球菌,放置于培養(yǎng)箱中,在溫度為37 ℃條件下培養(yǎng)16 h,按1%的接種量活化2次。

在先前配制好的LB液體培養(yǎng)基中接種枯草芽孢桿菌,放置于搖床中,在溫度為37 ℃,轉(zhuǎn)速為130 r/min條件下培養(yǎng)16 h,按1%的接種量活化2次。

1.2.2 發(fā)酵產(chǎn)物中乳酸鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定方法

精確稱取0.3 g烘干后的發(fā)酵產(chǎn)物,使用50 mL超純水充分溶解,加入5 mL質(zhì)量濃度為100 g/L的氫氧化鈉溶液與0.1 g鈣試劑羧酸鈉指示劑，使用濃度為0.05 mol/L的EDTA溶液進(jìn)行滴定,記錄EDTA溶液的消耗量,單位為mL。發(fā)酵產(chǎn)物中乳酸鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)算式為

ω1=v1c1×0.727 4×100%

式中:v1為滴定時(shí)消耗的EDTA溶液的體積;c1為EDTA溶液的濃度;0.727 4為計(jì)算系數(shù)。

1.2.3 發(fā)酵單因素實(shí)驗(yàn)

1) 蛋殼粉添加量

以50 g豆粕為發(fā)酵基質(zhì),蛋殼粉添加量分別為2%,4%,6%,8%,10%,葡萄糖添加量為10%,NaCl添加量為3%,無(wú)水乙酸鈉添加量為0.5%,KH2PO4添加量為0.2%,嗜酸小球菌和枯草芽孢桿菌的接種體積比為2∶1,接種量為24%,發(fā)酵基質(zhì)含水量為50%,在37 ℃條件下發(fā)酵120 h后烘干,并測(cè)定乳酸鈣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2) 葡萄糖添加量

以50 g豆粕為發(fā)酵基質(zhì),葡萄糖添加量分別為2%,5%,8%,11%,14%,蛋殼粉添加量為8%,NaCl添加量為3%,無(wú)水乙酸鈉添加量為0.5%,KH2PO4添加量為0.2%,嗜酸小球菌和枯草芽孢桿菌的接種體積比為2∶1,接種量為24%,發(fā)酵基質(zhì)含水量為50%,在37 ℃條件下發(fā)酵120 h后烘干,并測(cè)定乳酸鈣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

3) 含 水 量

以50 g豆粕為發(fā)酵基質(zhì),發(fā)酵基質(zhì)含水量分別為20%,30%,40%,50%,60%,葡萄糖添加量為5%,蛋殼粉添加量為8%,NaCl添加量為3%,無(wú)水乙酸鈉添加量為0.5%,KH2PO4添加量為0.2%,嗜酸小球菌和枯草芽孢桿菌的接種體積比為2∶1,接種量為24%,在37 ℃條件下發(fā)酵120 h后烘干,并測(cè)定乳酸鈣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

4) 發(fā)酵時(shí)間

以50 g豆粕為發(fā)酵基質(zhì),發(fā)酵時(shí)間分別為72,96,120,144,168 h,葡萄糖添加量為5%,蛋殼粉添加量為8%,NaCl添加量為3%,無(wú)水乙酸鈉添加量為0.5%,KH2PO4添加量為0.2%,嗜酸小球菌和枯草芽孢桿菌的接種體積比為2∶1,接種量為24%,發(fā)酵基質(zhì)含水量為50%,在37 ℃條件下發(fā)酵后烘干,并測(cè)定乳酸鈣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

5) 接 種 量

以50 g豆粕為發(fā)酵基質(zhì),接種量分別為6%,12%,18%,24%,30%,嗜酸小球菌和枯草芽孢桿菌的接種體積比為2∶1,葡萄糖添加量為5%,蛋殼粉添加量為8%,NaCl添加量為3%,無(wú)水乙酸鈉添加量為0.5%,KH2PO4添加量為0.2%,發(fā)酵基質(zhì)含水量為50%,在37 ℃條件下發(fā)酵96 h后烘干,并測(cè)定乳酸鈣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋殼粉添加量對(duì)乳酸鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

發(fā)酵產(chǎn)物中的乳酸鈣是由乳酸與蛋殼中的碳酸鈣反應(yīng)所得,蛋殼粉添加量對(duì)乳酸鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響如圖1所示。

圖1 蛋殼粉添加量對(duì)乳酸鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

由圖1可以看出:當(dāng)?shù)皻し厶砑恿繌?%逐漸增長(zhǎng)到8%時(shí),發(fā)酵產(chǎn)物中乳酸鈣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)從1.15%逐漸增加到4.48%;當(dāng)?shù)皻し厶砑恿繛?0%時(shí),發(fā)酵產(chǎn)物中乳酸鈣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)反而下降到2.67%。這可能是因?yàn)椋涸趯?shí)驗(yàn)中,乳酸菌分泌的乳酸會(huì)與添加的蛋殼粉反應(yīng),當(dāng)?shù)皻し圻^(guò)多時(shí),乳酸菌分泌的乳酸在與蛋殼粉反應(yīng)生成乳酸鈣后可能無(wú)法再使培養(yǎng)基的pH值進(jìn)入適宜其生長(zhǎng)的范圍了。因此,在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中設(shè)置蛋殼粉添加量為8%。

2.2 葡萄糖添加量對(duì)乳酸鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

葡萄糖是細(xì)菌產(chǎn)生乳酸的原料,也是其生長(zhǎng)發(fā)育所需的重要碳源之一。當(dāng)葡萄糖添加量較低時(shí),增加葡萄糖可以使細(xì)菌分泌更多的乳酸并促進(jìn)菌群的生長(zhǎng);當(dāng)葡萄糖添加量過(guò)高時(shí),過(guò)多的葡萄糖反而有可能抑制細(xì)菌利用其他非葡萄糖碳源,導(dǎo)致細(xì)菌的總產(chǎn)酸量下降。此外,過(guò)多的葡萄糖還會(huì)增加滲透壓,導(dǎo)致細(xì)菌菌體失水,對(duì)細(xì)菌的代謝活動(dòng)產(chǎn)生抑制作用,葡萄糖添加量對(duì)乳酸鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響如圖2所示。

圖2 葡萄糖添加量對(duì)乳酸鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

由圖2可以看出:當(dāng)葡萄糖添加量從2%逐漸增加到14%時(shí),乳酸鈣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)先上升后下降;當(dāng)葡萄糖添加量為5%時(shí),發(fā)酵產(chǎn)物中的乳酸鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高,為5.55%。這可能是因?yàn)椋寒?dāng)葡萄糖的添加量為5%時(shí),既有益于細(xì)菌的生長(zhǎng)發(fā)育,又不至于產(chǎn)生葡萄糖效應(yīng)抑制細(xì)菌利用其他碳源,此時(shí)細(xì)菌的總產(chǎn)酸量達(dá)到了最大值。因此,在后續(xù)的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中設(shè)置葡萄糖添加量為5%。

2.3 含水量對(duì)乳酸鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

微生物的生長(zhǎng)發(fā)育離不開(kāi)水,細(xì)菌的各種代謝活動(dòng)都需要水分子的參與。發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量對(duì)乳酸鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響如圖3所示。

圖3 含水量對(duì)乳酸鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

由圖3可以看出:當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量為20%～60%時(shí),乳酸鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨含水量的增加而增加;當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量為60%時(shí),乳酸鈣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高。雖然含水量為60%時(shí)的乳酸鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)更高,但是此時(shí)烘干發(fā)酵產(chǎn)物所需的時(shí)間相較于含水量為50%時(shí)烘干發(fā)酵產(chǎn)物所需的時(shí)間過(guò)長(zhǎng),從節(jié)約能源的角度考慮,在后續(xù)的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中設(shè)置含水量為50%。

2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)乳酸鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

如果發(fā)酵時(shí)間設(shè)置過(guò)短,培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)未完全消耗便結(jié)束發(fā)酵,將影響乳酸鈣的產(chǎn)出;如果發(fā)酵時(shí)間設(shè)置過(guò)長(zhǎng),營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)已被充分利用后仍不結(jié)束發(fā)酵,又將導(dǎo)致時(shí)間的浪費(fèi)。發(fā)酵時(shí)間對(duì)乳酸鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響如圖4所示。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)乳酸鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

由圖4可以看出:當(dāng)發(fā)酵時(shí)間從72 h延長(zhǎng)到96 h時(shí),發(fā)酵產(chǎn)物中乳酸鈣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)有較大幅度的提升;當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)到96 h后,乳酸鈣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)幾乎不再隨發(fā)酵時(shí)間的增加而增加。這可能是因?yàn)椋寒?dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)到96 h后,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)已被大量消耗,這導(dǎo)致此后菌群的代謝活動(dòng)維持在一個(gè)較低的水平,嗜酸小球菌所分泌的乳酸大幅減少,乳酸鈣的產(chǎn)量無(wú)明顯增加。因此,在后續(xù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中設(shè)置發(fā)酵時(shí)間為96 h。

2.5 接種量對(duì)乳酸鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

實(shí)驗(yàn)采用的發(fā)酵方式為固體生料發(fā)酵,發(fā)酵培養(yǎng)基中含有雜菌,接種量過(guò)低可能導(dǎo)致接種的細(xì)菌難以建立優(yōu)勢(shì)菌群,無(wú)法及時(shí)將環(huán)境調(diào)整到適宜菌群生長(zhǎng)的狀態(tài),使細(xì)菌的增殖受到了抑制;接種量過(guò)高則可能使菌群在發(fā)酵初期便消耗了過(guò)多的營(yíng)養(yǎng),導(dǎo)致此后細(xì)菌繁殖速度變慢,菌體老化,產(chǎn)酸速度放慢,反而使得乳酸的總產(chǎn)量下降[13]。接種量對(duì)乳酸鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響如圖5所示。

圖5 接種量對(duì)乳酸鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

由圖5可以看出:當(dāng)接種量從6%逐漸增加到18%時(shí),乳酸鈣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)從4.36%增加到6.09%;當(dāng)接種量逐漸增加到30%時(shí),乳酸鈣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)反而又下降到4.64%。因此,將接種量設(shè)置為18%。

3 結(jié) 論

我國(guó)每年有大量的廢棄雞蛋殼被浪費(fèi),通過(guò)發(fā)酵廢棄雞蛋殼生產(chǎn)乳酸鈣有望成為提高廢棄雞蛋殼利用率的一種途徑。實(shí)驗(yàn)以發(fā)酵產(chǎn)物中乳酸鈣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo),通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了使用嗜酸小球菌和枯草芽孢桿菌固體發(fā)酵雞蛋殼生產(chǎn)乳酸鈣的發(fā)酵工藝。結(jié)果表明:在發(fā)酵溫度為37 ℃,嗜酸小球菌和枯草芽孢桿菌的接種體積比為2∶1的條件下,最佳發(fā)酵工藝為蛋殼粉的添加量為8%,葡萄糖的添加量為5%,含水量為50%,發(fā)酵時(shí)間為96 h,接種量為18%,發(fā)酵產(chǎn)物中乳酸鈣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到了6.09%。筆者實(shí)驗(yàn)雖然為發(fā)酵蛋殼粉制備乳酸鈣提供了一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ),但是所得到的數(shù)據(jù)不夠完善,仍需要進(jìn)行更深層次的研究,才能對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。