西紅花花瓣主黃酮的大孔吸附樹脂純化工藝研究

洪 雨，李 論，劉書蒙，汪 豪

（中國藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，江蘇 南京 210009）

西紅花為鳶尾科植物番紅花Crocus sativusL.的干燥柱頭，具有活血化瘀、涼血解毒、解郁安神之功效，用于治療經(jīng)閉癥瘕、溫毒發(fā)斑、憂郁痞悶等癥[1]。西紅花藥材產(chǎn)量低導(dǎo)致市場價格高昂，但是其生產(chǎn)過程中大量的副產(chǎn)物——西紅花花瓣被作為農(nóng)業(yè)廢棄物丟棄[2]，造成嚴重的資源浪費。為充分利用西紅花資源，開發(fā)西紅花花瓣藥用價值，本研究對其活性成分黃酮類物質(zhì)進行提取并純化。

現(xiàn)有研究表明，西紅花花瓣含有黃酮、酚酸、單萜、生物堿等成分，其中最主要的黃酮類成分為山柰酚-3-O-槐糖苷[3]，具有明顯的抗炎和抗氧化活性[4-9]。目前國內(nèi)外關(guān)于西紅花花瓣中黃酮類成分的提取和分離報道較少，尤其是針對主黃酮成分山柰酚-3-O-槐糖苷的純化工藝尚未見報道。因此，本實驗基于對西紅花花瓣資源的綜合利用，優(yōu)化西紅花花瓣中山柰酚-3-O-槐糖苷大孔吸附樹脂純化工藝，為該成分的后續(xù)開發(fā)研究提供技術(shù)參考。

1 材料與儀器

西紅花花瓣購買于安徽省亳州市藥材市場，經(jīng)中國藥科大學(xué)汪豪教授鑒定為西紅花Crocus sativusL.的干燥花瓣；山柰酚-3-O-槐糖苷為本實驗室自西紅花花瓣中分離得到，經(jīng)NMR、MS等確定結(jié)構(gòu)，純度＞98.0%（HPLC-UV法，面積歸一化法）；HPD-100、HPD-450、HPD-600、AB-8、D101和ADS-17型大孔吸附樹脂（滄州寶恩吸附材料科技有限公司）；HPLC用甲醇為色譜純；其它試劑均為分析純。

XS105DU型電子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；TXB622L型電子天平（日本SHIMADZU公司）；Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；THZ-100B型恒溫培養(yǎng)搖床（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；PB-10型PH計（德國Sartorius公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 山柰酚-3-O-槐糖苷含量測定

2.1.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為0.2%甲酸（A）-甲醇（B），梯度洗脫程序見表1，流速：1.0 mL/min；檢測波長：266 nm；柱溫：40℃；進樣量：10 μL。色譜圖見圖1。

圖1 山柰酚-3-O-槐糖苷HPLC色譜圖Fig. 1 HPLC of kaempferol-3-O-sophoroside

表1 梯度洗脫程序Tab. 1 Gradient elution program

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取山柰酚-3-O-槐糖苷對照品適量，加60%甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，搖勻，即得（山柰酚-3-O-槐糖苷質(zhì)量濃度為1 604 μg/mL）。

2.1.3 供試品溶液制備 粉碎后的藥材過40目篩，取樣品粗粉約0.1 g，精密稱定，精密加入60%甲醇25 mL，稱重，室溫下超聲提取30 min，放冷，加60%甲醇補足失重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液適量，等比稀釋配制質(zhì)量濃度依次為160.4、80.2、40.1、20.05、10.03、5.01、2.51、1.25 μg/mL的溶液，濾過，取續(xù)濾液在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定。以山柰酚-3-O-槐糖苷質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得到方程為Y= 23.27X+ 23.08（R2= 0.999 7），在1.25 ～160.4 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度試驗 取“2.1.4”項下溶液，注入色譜儀連續(xù)測定6次，測得山柰酚-3-O-槐糖苷峰面積RSD為0.47%，表明色譜儀精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗 取同批藥材的干燥粉末，按照“2.1.3”項平行制備供試品溶液6份，注入色譜儀檢測，測得山柰酚-3-O-槐糖苷含量RSD為1.36%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.6”項下供試品溶液1份，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣測定，測得山柰酚-3-O-槐糖苷峰面積RSD為1.29%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 取已知含量的同批藥材干燥粉末，精密稱定0.1 g，精密加入適量“2.1.2”項下對照品溶液，按“2.1.3”項制備供試品溶液，進樣測定，測得山柰酚-3-O-槐糖苷平均加樣回收率為101.03%，RSD為0.94%，表明該方法準確度較高。

2.2 單因素試驗

2.2.1 上樣液制備 取同批次西紅花花瓣200 g，加入95%乙醇，料液比分別為1∶10、1∶8，加熱回流提取兩次，提取時間均為2 h，濾過，濾液合并，減壓濃縮至100 mL（含生藥2.0 g/mL），4℃冷藏備用。

2.2.2 大孔吸附樹脂預(yù)處理 將樹脂用95%乙醇浸泡過夜，淋洗至溶液無白色渾濁異物，再用純水淋洗至無醇味，抽濾，備用。

2.2.3 大孔吸附樹脂類型的篩選 分別稱取預(yù)處理好的6種大孔吸附樹脂各3 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，加入西紅花花瓣上樣液（生藥濃度為0.15 g/mL）各30 mL，置恒溫搖床中振搖24 h（25℃，120 r/min），在“2.1.1”項色譜條件下測定吸附前后山柰酚-3-O-槐糖苷濃度。抽濾吸附后的樹脂，并用少量純水洗滌，各加入45%乙醇30 mL，置恒溫搖床中振搖24 h（25℃，120 r/min），在“2.1.1”項色譜條件下測定解吸液中山柰酚-3-O-槐糖苷的濃度。計算靜態(tài)吸附量、解吸量及解吸率[吸附量=上樣液體積×（上樣液初始質(zhì)量濃度-吸附后上樣液質(zhì)量濃度）/樹脂干重；解吸量=解吸液體積×解吸液質(zhì)量濃度/樹脂干重；解吸率=（解吸量/吸附量）×100%，吸附率=（吸附量/上樣液總量）×100%][10]。結(jié)果顯示，AB-8、HPD-100型大孔吸附樹脂吸附量最高，但AB-8型的解吸量和解吸率低于HPD-100型大孔吸附樹脂，故最終確定選用HPD-100型大孔吸附樹脂，見圖2。

圖2 6種大孔吸附樹脂對山柰酚-3-O-槐糖苷的靜態(tài)吸附與解吸附性能Fig. 2 Adsorption and desorption capacity of kaempferol-3-Osophoroside on the six macroporous adsorption resins

2.2.4 靜態(tài)吸附曲線繪制 稱取HPD-100型樹脂3 g，加入30 mL上樣液，以25℃、120 rpm振搖12 h，分別在第0、2、4、6、8、10、12 h取樣測定，繪制靜態(tài)吸附曲線，見圖3。在吸附的起始階段，吸附速率快，吸附量隨時間延長明顯增大，隨后吸附變慢，吸附平衡時間為4 h，最大吸附量為93.12 mg/g。

圖3 HPD-100型樹脂對山柰酚-3-O-槐糖苷靜態(tài)吸附曲線Fig. 3 Static adsorption curve of kaempferol-3-O-sophoroside on HPD-100 resin

2.2.5 靜態(tài)吸附等溫線繪制 稱取5份HPD-100型樹脂于50 mL具塞錐形瓶中，每份3 g，加入30 mL不同濃度的上樣液，分別在25、30、35、40、45℃下120 rpm振搖吸附12 h，進樣測定，計算吸附量，繪制吸附等溫線，見圖4。隨著溫度的升高，同一初始質(zhì)量濃度下的吸附量呈下降趨勢，說明HPD-100型樹脂吸附山柰酚-3-O-槐糖苷屬于放熱過程，適當(dāng)降低溫度有利于吸附。因此確定吸附溫度為25℃。

圖4 HPD-100型樹脂對山柰酚-3-O-槐糖苷的吸附等溫線Fig. 4 Adsorption isotherms of kaempferol-3-O-sophoroside on HPD-100 resin

Langmuir和Freundlich吸附等溫模型常用于描述吸附劑與被吸附物質(zhì)的相互作用[11]，圖4中實驗數(shù)據(jù)擬合結(jié)果見表2。由此可知，Langmuir和Freundlich兩種模型都能較好地擬合吸附平衡數(shù)據(jù)，但Langmuir方程（R2＞0.99）更合適，吸附過程更趨于單分子層吸附[12]。Freundlich模型中，常數(shù)1/n介于0.1 ～0.5之間，表明山柰酚-3-O-槐糖苷在HPD-100型樹脂上的吸附過程易進行，為優(yōu)惠型吸附[13]。

表2 Langmuir和Freundlich擬合方程Tab. 2 Regression equations of Langmuir and Freundlich adsorption isotherms

2.2.6 上樣液pH篩選 使用10% HCl或4% NaOH溶液分別調(diào)節(jié)上樣液的初始pH值為2、4、6、8，各取30 mL加入HPD-100型樹脂3 g，在25℃恒溫振搖12 h，進樣測定，計算吸附量。結(jié)果上樣液pH值2、4、6、8的吸附量分別為148.06、160.94、152.02、140.87 mg/g。由此可知，pH值為4時，HPD-100型樹脂吸附量最大，其次是pH值為6，這是因為山柰酚-3-O-槐糖苷屬于弱酸性化合物，在這個pH范圍內(nèi)主要以游離型存在，且酸性越強，游離型占比越大，山柰酚-3-O-槐糖苷通過范德華力被樹脂吸附[14]；而在pH值為2時，過酸導(dǎo)致山柰酚-3-O-槐糖苷析出，吸附量反而下降。綜上考慮，上樣液pH值選用4。

2.2.7 上樣液質(zhì)量濃度的篩選 稱取HPD-100型樹脂15 g，濕法裝柱（2 cm×20 cm，1 BV = 40 mL），分別以1 BV/h將不同生藥濃度（2.0、1.0、0.5、0.1 g/mL，pH = 4）的上樣液加載于4根上述樹脂柱，總上樣量均相當(dāng)于15 g生藥，收集流出液，減壓濃縮定容至50 mL，進樣測定，計算吸附量和吸附率。結(jié)果顯示，總上樣量相同時，HPD-100型樹脂對不同生藥濃度（0.1 ～ 2.0 g/mL）上樣液吸附率基本相同，均超過99%。但從上樣效率考慮，上樣濃度越大，上樣體積越小，上樣時間越短，因此選擇生藥濃度為2.0 g/mL的上樣液以1 BV/h加載到HPD-100型大孔吸附樹脂上。

2.2.8 泄露曲線繪制 稱取HPD-100型樹脂15 g，濕法裝柱（2 cm×20 cm，1 BV = 40 mL），量取2.0 g/mL、pH = 4的上樣液60 mL，上樣流速為1 BV/h，每5 mL收集一管流出液，共收集12管，進樣測定，繪制動態(tài)泄露曲線，見圖5。在上樣40 mL時，上樣流出液中山柰酚-3-O-槐糖苷的濃度很低，幾乎沒有泄露；在上樣45 mL時，開始泄露；繼續(xù)上樣，泄露量逐漸增加，上樣50 mL時，泄露量達到山柰酚-3-O-槐糖苷初始質(zhì)量濃度的10%，為保證上樣液中該成分吸附完全，最佳上樣量確定為40 mL，即1 BV。

圖5 山柰酚-3-O-槐糖苷動態(tài)泄露曲線Fig. 5 Dynamic leakage curve of kaempferol-3-O-sophoroside

2.2.9 洗脫劑體積分數(shù)篩選 稱取HPD-100型樹脂5份，每份3 g，加入30 mL一定質(zhì)量濃度的上樣液，在恒溫搖床上振搖12 h，抽濾。配制體積分數(shù)為15%、30%、45%、60%、75%的乙醇溶液，各取30 mL對吸附飽和的HPD-100型大孔吸附樹脂進行解吸，在25℃下120 rpm振搖24 h，在“2.1.1”項色譜條件下測定吸附液和解吸液中山柰酚-3-O-槐糖苷濃度，計算解吸率。結(jié)果解吸率分別為38.38%、62.66%、78.54%、79.46%、71.39%，體積分數(shù)為45%和60%的乙醇溶液解吸率較高，且差別不大，根據(jù)經(jīng)濟性原則，選擇體積分數(shù)為45%的乙醇溶液為洗脫劑。

2.2.10 洗脫曲線繪制 稱取HPD-100型樹脂15 g，濕法裝柱（2 cm×20 cm，1 BV = 40 mL），設(shè)定上樣液生藥濃度2.0 g/mL，pH = 4，上樣體積為40 mL，以1 BV/h上柱，先用純水洗脫3 BV，流出液棄去，再以45%乙醇進行洗脫，流速為1 BV/h，每5 mL收集一管流出液，測定山柰酚-3-O-槐糖苷的濃度，繪制動態(tài)洗脫曲線，見圖6。由此可知，45%體積分數(shù)乙醇洗脫的曲線峰形集中，沒有明顯拖尾，120 mL（3 BV）的洗脫劑即可將山柰酚-3-O-槐糖苷完全洗脫，故選擇3 BV作為洗脫劑體積。

圖6 山柰酚-3-O-槐糖苷的動態(tài)解吸曲線Fig. 6 Dynamic desorption curve of kaempferol-3-O-sophoroside

2.2.11 驗證試驗 根據(jù)上述各單因素實驗結(jié)果確定最佳工藝條件為：上樣液pH = 4，上樣生藥濃度為2.0 g/mL，上樣體積為1 BV（40 mL），25℃下，1 BV/h加載到15 g處理好的HPD-100型大孔吸附樹脂柱上，依次用純水洗脫3 BV，45%乙醇洗脫3 BV，洗脫流速為1 BV/h，進行3次平行試驗，收集45%乙醇洗脫部分，測定山柰酚-3-O-槐糖苷濃度。剩余洗脫液濃縮至干，稱重，計算浸膏中山柰酚-3-O-槐糖苷的純度和回收率，分別為57.4%和54.7%，RSD分別為1.54%和2.16%。純化后的浸膏中山柰酚-3-O-槐糖苷的純度提高到純化前的8.61倍，可知此工藝條件下HPD-100型大孔吸附樹脂對西紅花花瓣中山柰酚-3-O-槐糖苷的富集效果和重復(fù)性良好。

3 討論

長期以來，西紅花花瓣被當(dāng)成農(nóng)業(yè)廢棄物處理,但其含有豐富的黃酮類成分，尤其是抗炎抗氧化效果顯著的山柰酚-3-O-槐糖苷，具有可觀的開發(fā)潛力。大孔吸附樹脂是一種人造的聚合物吸附劑，其球形內(nèi)部含有無數(shù)立體網(wǎng)狀孔穴結(jié)構(gòu)，具有表面電性或氫鍵而具有吸附性[15]，并且其理化性質(zhì)穩(wěn)定、成本低、比表面積大、吸附容量大、有選擇性和吸附速度快，已廣泛應(yīng)用于黃酮類化合物的分離純化[16]。因此本實驗中采用大孔吸附樹脂對西紅花花瓣中山柰酚-3-O-槐糖苷進行富集。在大孔吸附樹脂篩選實驗中，HPD-100型樹脂對山柰酚-3-O-槐糖苷吸附率和吸附量最大，這與大孔吸附樹脂的極性、孔徑、比表面積等性質(zhì)有關(guān)[12]。HPD-100型樹脂為弱極性樹脂，與被吸附的山柰酚-3-O-槐糖苷的極性接近，且HPD-100型樹脂的比表面積在6種大孔吸附樹脂中最大，比表面積越大越有利于吸附[17]，故HPD-100型大孔吸附樹脂吸附性能最佳。

本實驗通過單因素法優(yōu)選出了利用大孔吸附樹脂純化西紅花花瓣主黃酮成分山柰酚-3-O-槐糖苷的工藝條件，有效提高了提取物中山柰酚-3-O-槐糖苷的純度，為后續(xù)活性研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。但是本實驗得到的最佳工藝是實驗室優(yōu)化的結(jié)果，對于山柰酚-3-O-槐糖苷工業(yè)生產(chǎn)時如何上樣與洗脫還需結(jié)合實際生產(chǎn)條件進一步探索。

4 結(jié)論

本研究最終確定的純化工藝為：以生藥濃度2.0 g/mL西紅花花瓣提取液（pH = 4），25℃下1 BV/h 加載到15 g預(yù)處理好的HPD-100型大孔吸附樹脂柱上，上樣體積為40 mL，先用純水洗脫3 BV，再以45%乙醇洗脫3 BV，洗脫流速為1 BV/h，收集45%乙醇洗脫部分。純化后的浸膏中山柰酚-3-O-槐糖苷的純度達到57.40%，是西紅花花瓣粗提物的8.61倍，此工藝對西紅花花瓣中山柰酚-3-O-槐糖苷的富集效果良好，且簡單、穩(wěn)定、可行。