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    傳統(tǒng)發(fā)酵型五加皮酒的處方考證及制備工藝研究

    2022-12-05 05:48:50王曉晴孫允紅
    關(guān)鍵詞:藥酒綠原糖化

    溫 柔,王曉晴,孫允紅,楊 穎, 侯 林

    (1.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,山東 濟(jì)南 250355;2.山東中醫(yī)藥大學(xué) 青島中醫(yī)藥科學(xué)院,山東 青島266000)

    五加皮酒是以五加皮為主藥,在民間廣泛流傳配制的傳統(tǒng)藥酒,具有祛風(fēng)濕、痿痹、壯筋骨,填精髓等功效[1]。唐·《外臺(tái)秘要》[2]記載的五加皮酒方詳細(xì)記述了五加皮酒的制備工藝,其方為“五加根莖細(xì)刨五斗,六月六日曲未三斗,黍米一石,糯米亦得。以五斗共五加同下于大釜中,以木度深淺,與水準(zhǔn)刻之,即更添水一石五斗,并前計(jì)兩石……”先以水煎五加皮取汁浸曲,再煎其藥渣取汁與黍米共煮,放涼加曲發(fā)酵而成。

    目前市面上生產(chǎn)的五加皮酒,多以糧食白酒為酒基,配以多味藥材經(jīng)浸泡、配制、調(diào)色等工藝而制成[3]。白酒即蒸餾酒,普遍酒精度數(shù)偏高,蒸餾酒古稱“燒酒”,《本草綱目》載“燒酒,味辛、甘,性大熱,有大毒”。傳統(tǒng)發(fā)酵型五加皮酒采用的是傳統(tǒng)黃酒釀造工藝制備,酒精度普遍較低。當(dāng)前對(duì)于使用傳統(tǒng)黃酒釀造工藝制備五加皮酒的研究相對(duì)空白,本研究基于《外臺(tái)秘要》中記載的五加皮酒方,對(duì)傳統(tǒng)五加皮酒進(jìn)行處方考證。在古方的基礎(chǔ)上對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵型五加皮酒制備工藝進(jìn)行研究,得到五加皮最佳水提及糖化工藝,為傳統(tǒng)發(fā)酵型五加皮酒的制備研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 處方考證

    1.1 處方沿革

    《神農(nóng)本草經(jīng)》[4]記載最早的釀造五加皮酒大概出自戰(zhàn)國(guó)時(shí)期。《外科大成》[5]記載:杰出的本草學(xué)家陶弘景就錄:“用單味五加皮,煮根莖釀酒,主益人。”《本草綱目》[6]記載五加皮酒的制備方法“用五加皮刮去骨,煎汁和麴米釀成飲之?;蚯兴榇?,浸酒煮飲,或加牛膝、當(dāng)歸、地榆諸藥”。唐·《外臺(tái)秘要》[7]記載的五加皮酒方則詳細(xì)記述了單味五加皮酒的制備工藝,其方“五加根莖細(xì)刨五斗,六月六日曲未三斗,黍米一石,糯米亦得……”先以水煎五加皮取汁浸曲,再煎其藥渣取汁與黍米共煮,放涼加曲發(fā)酵而成?!秱浼鼻Ы鸱健穂8]記載五加皮酒方:“五加皮、枸杞根白皮各一斗。以水一石五斗煮取汁七斗,分取四斗浸曲一斗,余三斗用拌飯下米,多少如常釀法。”《太平圣惠方》[9]記載的五加皮酒為浸漬法制備:“五加皮細(xì)銼一升,以清酒一斗。漬十日,溫服一中盞?!蔽墨I(xiàn)考證可知,傳統(tǒng)的五加皮酒大多是采用釀造法制備而來。先水煎煮五加皮得到五加皮水提液及藥渣,然后將五加皮水提液及藥渣與米、曲共同發(fā)酵。

    1.2 藥材基原

    五加皮最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,被列為上品,又名五加,尚有材漆、五花、木骨、追風(fēng)使、刺通、白剌等異名[10]?!睹t(yī)別錄》有載:“五加皮,五葉者良,生漢中及冤句,五月、七月采蓮,十月采根,陰干?!蔽寮悠ぞ哂凶萄a(bǔ)、祛風(fēng)濕、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨等功效。《神農(nóng)本草經(jīng)》[11]言其“主心腹疝氣,腹痛,益氣,療蹩、小兒不能行、疸創(chuàng)陰蝕?!睍惺状翁岢鑫寮泳哂幸鏆狻燉康淖饔??!睹t(yī)別錄》[12]云:“男子陽(yáng)瘓,囊下濕,小便余瀝,女人陰癢及腰脊痛,兩腳痛風(fēng)弱,五緩,虛嬴,補(bǔ)中益精,堅(jiān)筋骨,強(qiáng)志意,久服輕身耐老?!薄缎滦薇静荨分嘘P(guān)于五加皮功效的記載,且云“久服輕身耐老……五葉者良?!薄侗静菟急驿洝份d:“五加皮,宜下焦風(fēng)濕之緩證。若風(fēng)濕搏于肌表,則非其所司。古方多浸酒醜酒,及酒調(diào)末服之,以行藥勢(shì)?!?020年版《中國(guó)藥典》[13]收錄五加皮為五加科植物細(xì)柱五加皮Acanthopanax gracilistylusW.W. Smith的干燥根皮。

    1.3 藥材炮制

    《外臺(tái)秘要》記載的五加皮酒方,詳細(xì)記述了五加皮的炮制方法:“五加根莖細(xì)刨五斗,六月六日曲未……”《太平圣惠方》記載“五加皮細(xì)銼一升……”仲景云:“銼如麻豆大,與咀同義。咀,古之制也,古無(wú)鐵刃,以口咬細(xì),令如麻豆,為粗藥煎之,使藥水清飲于腹中,則易升易散也,此所謂咀也。今人以刀器銼如麻豆大,此咀之易成也。”[1“4]如麻豆大”在煮散的粒度描述中十分常見,“麻豆”在歷代古籍文獻(xiàn)中卻未見有明確記載。但“麻”在歷代古籍文獻(xiàn)中均有明確且統(tǒng)一的釋義,即我國(guó)傳統(tǒng)種植的大麻,古代五谷之一的大麻籽實(shí)以及古代百姓衣著及喪服所用的麻布均來源于大麻[15]?!奥椤睘樯?浦参锎舐?,“麻豆”為大麻的成熟果實(shí),即火麻仁。2020 年版《中國(guó)藥典》中記載火麻仁呈卵圓形,長(zhǎng) 4 ~ 5.5 mm,直徑 2.5 ~ 4 mm。因此,“麻豆大”推測(cè)為2 ~ 5 mm。而 4目篩孔徑為 4.75 mm,一號(hào)篩(10目)的孔徑則為2.00 mm[16-19]。因此,“如麻豆大”可取過4目篩但不過一號(hào)篩(10目)的粗顆粒。由此推測(cè),《外臺(tái)秘要》記載的五加皮酒方中五加皮應(yīng)取粉碎后過4目篩但不過10目篩的粗粉。

    1.4 計(jì)量考證

    原方中記載五加皮用量為五斗,黍米為一石,水為兩石。已知五加皮粉碎的粒度,由此可以計(jì)算出五加皮粉末的密度。實(shí)驗(yàn)得到五加皮粉末松密度和振實(shí)密度分別為0.412、0.410,黍米的松密度和振實(shí)密度分別為0.831、0.836。查閱文獻(xiàn)可知古代與現(xiàn)代換算關(guān)系:1斗 = 2 000 mL,一石 = 10斗[20]。由此可推出,五加皮∶黍米∶水= 1∶4∶10。

    2 傳統(tǒng)發(fā)酵型五加皮酒的制備工藝研究

    2.1 材料

    2.1.1 儀器 2695型高效液相色譜儀包括2998型檢測(cè)器、Empower色譜工作站(美國(guó)Waters公司);DK-S14 型電熱恒溫水浴鍋、DHG-9140B 型電熱鼓風(fēng)干燥箱[中儀國(guó)科(北京)科技有限公司];FA2104型萬(wàn)分之一電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司);CPA225D 型十萬(wàn)分之一電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司];KQ-500E 型超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司);LA759 型超純水機(jī)(英國(guó) ELGA 公司)。

    2.1.2 藥材及試劑 黍米購(gòu)自沈陽(yáng)信昌糧食貿(mào)易有限公司;五加皮(生產(chǎn)批號(hào):210601)購(gòu)自青島天成中藥飲片有限公司,經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)侯林副教授鑒定,均符合2020年版《中國(guó)藥典》(一部)相關(guān)項(xiàng)下要求;綠原酸對(duì)照品(批號(hào):Y24J7K16726,純度≥98%,上海源葉生物科技有限公司);葡萄糖對(duì)照品(批號(hào):20191029,分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);乙腈為色譜純(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);磷酸為分析純;超純水為實(shí)驗(yàn)室自制。

    2.2 工藝流程

    五加皮粉碎過篩后煎煮得到五加皮水提液及藥渣。黍米經(jīng)浸泡、洗米、燙米后與五加皮水提液及藥渣共煮進(jìn)行煮糜。將煮好的糜倒入消毒后的鐵盤中,使其快速降溫。降到指定溫度后加入麥曲進(jìn)行糖化。糖化結(jié)束后加入酵母,轉(zhuǎn)移至缸中進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵7 d后過濾取濾液,將過濾后的酒液置于85℃水浴30 min,即可。

    2.3 五加皮水提工藝研究

    2.3.1 樣品溶液制備 取五加皮粗粉50 g于圓底燒瓶中,加入水,浸泡,回流,得到五加皮水提液,將提取液離心、過濾、定容至500 mL。

    2.3.2 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn),按方法測(cè)定浸出物含量和綠原酸含量,對(duì)浸出物含量和綠原酸含量進(jìn)行綜合評(píng)分,以綜合評(píng)分為指標(biāo),正交因素水平見表1。

    表1 五加皮水提工藝正交因素水平表Tab. 1 Level table of orthogonal factors water extraction technology of Acanthopanacis Cortex

    2.4 五加皮糖化工藝研究

    2.4.1 糖化液的制備 取黍米500 g,浸泡24 h后進(jìn)行燙米,再浸泡24 h,與五加皮提取液及藥渣共煮進(jìn)行糊化,攤涼,加入麥曲糖化,得到糖化液。

    2.4.2 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn),以還原糖為指標(biāo),正交因素水平見表2。

    表2 五加皮糖化工藝正交因素水平表Tab. 2 Level table of orthogonal factor of saccharification process of Acanthopanacis Cortex

    2.5 方法

    2.5.1 浸出物含量測(cè)定 精密量取25 mL水提液于干燥至恒重的蒸發(fā)皿,水浴蒸干。105℃干燥3 h,置干燥器中冷卻30 min,迅速精密稱定重量,平行測(cè)定兩次,以干燥品計(jì)算供試品中水溶性浸出物的含量。

    2.5.2 綠原酸含量測(cè)定 (1) 色譜條件 色譜柱為WondaSil C18(250 mm×4.6 mm,5μm);流動(dòng)相為乙腈(B)-0.05%磷酸水(A),梯度洗脫(0 ~ 10 min,5% →10%B,10 ~ 30 min,10% →15%B,30 ~ 40 min,15%→85%B);檢測(cè)波長(zhǎng):270 nm;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:10 μL。

    (2) 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取5.08 mg綠原酸對(duì)照品,加甲醇溶解,定容至5 mL容量瓶中,即得。

    (3) 供試品溶液的制備 精密吸取“2.3.1”項(xiàng)下樣品溶液25 mL于蒸發(fā)皿中,水浴蒸干。加甲醇溶解,定容至25 mL,過濾,取濾液。

    (4) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密吸取規(guī)定配制的綠原酸對(duì)照品溶液2.5 mL,按半倍稀釋法,定容至5 mL容量瓶中,依次得到濃度為0.031 15、0.062 23、0.124 46、0.248 92、0.497 84、0.995 68 mg/mL系 列對(duì)照品。按“2.5.2(1)”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,測(cè)定峰面積。以濃度為橫坐標(biāo)(X,mg/mL),峰面積為縱坐標(biāo)(Y),得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    2.5.3 還原糖含量測(cè)定 (1) 對(duì)照品溶液的制備

    精密稱取50 mg經(jīng)105℃干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖對(duì)照品,置50 mL容量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得。

    (2) 供試品溶液的制備 取“2.4.1”項(xiàng)下糖化液4 000 r/min離心20 min,上清液定容至100 mL容量瓶,取上清液1 mL定容至100 mL容量瓶中,得到供試品溶液。精密吸取1 mL供試品溶液,測(cè)定吸光度,計(jì)算還原糖含量。

    (3) 線性關(guān)系考察 采用 3,5-二硝基水楊酸比色法。分別精確吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.7 mL 置于10 mL 具塞試管中,蒸餾水補(bǔ)至2.0 mL,加入 3,5-二硝基水楊酸試劑1.5 mL,將各試管中的溶液混合均勻,沸水浴 5 min 取出,立即冷卻至室溫,定容至刻度,搖勻,在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

    2.5.4 浸出物和綠原酸權(quán)重系數(shù)確定 采用CRITIC法[21-24]。CRITIC法是一種客觀權(quán)重賦權(quán)法,它以兩個(gè)基本概念為基礎(chǔ),一是對(duì)比強(qiáng)度,以標(biāo)準(zhǔn)差的形式來表現(xiàn); 二是評(píng)價(jià)指標(biāo)之間的沖突性,以指標(biāo)之間的相關(guān)性為基礎(chǔ),故該方法是基于評(píng)價(jià)指標(biāo)的對(duì)比強(qiáng)度和指標(biāo)之間的沖突性來綜合衡量指標(biāo)的客觀權(quán)重,在考慮指標(biāo)變異性大小的同時(shí)兼顧指標(biāo)之間的相關(guān)性,完全利用數(shù)據(jù)自身的客觀屬性進(jìn)行科學(xué)評(píng)價(jià)。

    3 結(jié)果與分析

    3.1 五加皮水提工藝研究

    3.1.1 綠原酸HPLC分析結(jié)果 按照“2.5.2(2)(3)”項(xiàng)下方法制備對(duì)照品溶液和五加皮供試品溶液,按“2.5.2(1)”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析。色譜圖見圖1、圖2,各峰之間分離度足夠,峰形良好,可以用于樣品的HPLC分析。

    圖1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜Fig. 1 HPLC of chlorogenic acid standard

    圖2 五加皮供試品HPLC圖譜Fig. 2 HPLC of Acanthopanacis Cortex sample

    3.1.2 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線 按“2.5.2(4)”項(xiàng)下繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果顯示,綠原酸對(duì)照品溶液濃度(X,mg/mL)和峰面積(Y)呈線性關(guān)系,回歸方程為Y= 8×106X+ 152 965,R2= 0.999 6,表明綠原酸對(duì)照品在0.031 15 ~ 0.995 68 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

    3.1.3 方法學(xué)考察 (1)精密度試驗(yàn) 取綠原酸對(duì)照品,連續(xù)進(jìn)樣6次,得峰面積,計(jì)算RSD = 0.21%,表明儀器精密度良好。

    (2) 重復(fù)性試驗(yàn) 取6份制備的同一批供試品溶液,按色譜條件進(jìn)樣,得峰面積,計(jì)算綠原酸含量,RSD = 1.4%,表明該方法重復(fù)性良好。

    (3) 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液,于0、2、4、6、8、10、12 h按“2.5.2(1)”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,測(cè)得2種溶液中綠原酸峰面積RSD分別為0.58%、1.7%,表明溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    (4) 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取125 mL濃度為0.154 5 mg/mL樣品溶液于250 mL容量瓶中,定容至刻度作為供試品溶液。精密吸取6份 25 mL供試品,精密稱取對(duì)照品2.00 mg,制備供試品溶液,按“2.5.2(1)”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,測(cè)得平均回收率為101.82%,RSD為0.31%。

    3.1.4 正交試驗(yàn)結(jié)果 由表3可知,溶劑量的均方值最大,即溶劑量對(duì)五加皮水提液中浸出物含量和綠原酸含量影響最大,其次為浸泡時(shí)間,最后為煎煮時(shí)間,即B>A>C。由表4分析可知,因素B具有顯著影響(P<0.05),而A、C不具有顯著影響(P>0.05)。最終確定五加皮最佳水提工藝為A2B3C2,即浸泡時(shí)間為40 min、溶劑量為12倍、煎煮時(shí)間為90 min。

    表3 五加皮水提工藝正交試驗(yàn)結(jié)果表Tab. 3 Orthogonal test results table of water extraction of Acanthopanacis Cortex

    表4 五加皮水提工藝正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析表Tab. 4 Orthogonal test results analysis of variance table of Acanthopanacis Cortex

    3.1.5 正交試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證 按“3.1.3”項(xiàng)下優(yōu)化工藝進(jìn)行 3 批驗(yàn)證試驗(yàn),結(jié)果見表5,浸出物含量、綠原酸含量及綜合評(píng)分RSD均小于3%,表明該工藝穩(wěn)定可行。

    表5 五加皮水提工藝驗(yàn)證(n = 3)Tab. 5 Process validation of Acanthopanacis Cortex (n = 3)

    3.2 糖化工藝研究

    3.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 按“2.5.3(3)”項(xiàng)下繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果顯示,葡萄糖對(duì)照品溶液濃度(X,mg/mL)和吸光度(Y)呈線性關(guān)系,回歸方程為Y= 0.014 4X- 0.047 6,R2= 0.999 9,表明葡萄糖對(duì)照品溶液在10 ~ 70 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

    3.2.2 方法學(xué)考察 (1) 精密度試驗(yàn) 取濃度為70 μg/mL的無(wú)水葡萄糖對(duì)照品溶液,連續(xù)測(cè)定6次,得吸光度,RSD = 0.12%,表明儀器精密度良好。

    (2) 重復(fù)性試驗(yàn) 取6份同一批供試品溶液,測(cè)定其吸光度,計(jì)算還原糖含量,RSD = 3.4%,表明該方法重復(fù)性良好。

    (3) 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液,分別在0、10、20、30、40、50、60 min測(cè)定吸光度,RSD =0.39%,表明溶液在60 min內(nèi)穩(wěn)定。

    (4) 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取0.5 mL濃度 為69.49 μg/mL供 試 品 溶 液6份 于10 mL試 管中,分別加入0.5 mL濃度為70.8 μg/mL的對(duì)照品溶液,按方法顯色,測(cè)定吸光度,測(cè)得平均回收率為97.77%,RSD為0.87%。

    3.2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果 由表6可知,加曲量的均方值最大,即加曲量對(duì)糖化液中還原糖含量影響最大,其次為糖化溫度,最后為糖化時(shí)間,即A>C>B。由表7分析可知,因素A具有顯著影響(P<0.05),而B、C不具有顯著影響(P>0.05)。最終確定最佳糖化工藝為A3B3C2,即加曲量為14%、糖化時(shí)間為50 min、糖化溫度為65 ℃。

    表6 糖化工藝正交試驗(yàn)結(jié)果表Tab. 6 Table of orthogonal test results of saccharification process

    3.2.4 正交試驗(yàn)驗(yàn)證 按“3.2.3”項(xiàng)下最佳工藝進(jìn)行 3 批驗(yàn)證試驗(yàn),結(jié)果見表8,還原糖含量RSD<3%,表明該工藝穩(wěn)定可行。

    表 7 糖化工藝正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析表Tab. 7 Orthogonal test results ANOVA table of saccharification process

    表8 糖化工藝驗(yàn)證(n = 3)Tab. 8 Process validation of saccharification process(n = 3)

    4 討論

    中藥酒劑,也稱藥酒,屬于中藥的傳統(tǒng)劑型,使用歷史悠久?!吨袊?guó)藥典》規(guī)定藥酒為蒸餾酒提取制成的澄清液體制劑。蒸餾酒古稱“燒酒”,《本草綱目》載“燒酒,味辛、甘,性大熱,有大毒”[25]。而高度蒸餾酒導(dǎo)致的安全性問題正是制約其臨床應(yīng)用的關(guān)鍵因素。臧貴勇等[26]研究了水族抗痹癥藥酒的急性毒性,結(jié)果顯示抗痹癥藥酒小鼠一次經(jīng)口給藥 LD50=29. 664 mL/kg,白酒對(duì)照組小鼠一次經(jīng)口給藥 LD50=27. 222 mL/kg,說明白酒是導(dǎo)致藥酒毒性的關(guān)鍵因素。現(xiàn)代藥酒的生產(chǎn)多是以糧食白酒為酒基,配以多種藥材經(jīng)過浸泡、勾兌而成。以傳統(tǒng)釀造法制備的藥酒不僅酒精度低,對(duì)人體危害小,而且在釀造過程中引入原料米的活性物質(zhì),具有安全、健康、口感豐富的特點(diǎn),符合現(xiàn)代人追求的養(yǎng)生保健生活方式。

    釀造法制備藥酒是我國(guó)傳統(tǒng)藥酒制備方法,《本草綱目》中記載的68個(gè)藥酒均是以釀造法制備?;仡櫵幘频钠鹪春桶l(fā)展,得到兩點(diǎn)認(rèn)識(shí):一是在古代至少清代以前“酒”指的是釀造法制備而來的低度酒,藥酒的溶劑也是釀造法制備而來的低度酒;二是釀制法工藝是古代藥酒生產(chǎn)的主要工藝。進(jìn)入現(xiàn)代,工業(yè)化規(guī)模化生產(chǎn)的藥酒已經(jīng)取代了小作坊生產(chǎn),滅菌工藝成熟,制約釀制法工藝的技術(shù)因素已經(jīng)不復(fù)存在,可以考慮將釀制法工藝重新引入藥酒的生產(chǎn)。

    5 結(jié)論

    本研究以古籍《外臺(tái)秘要》中記載的五加皮酒方為基礎(chǔ),從處方沿革、藥材基原、藥材炮制及計(jì)量考證對(duì)傳統(tǒng)五加皮酒進(jìn)行處方考證,對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵型五加皮酒制備工藝中的五加皮水提工藝和糖化工藝進(jìn)行了優(yōu)化,并驗(yàn)證了這兩個(gè)工藝的可行性,為傳統(tǒng)發(fā)酵型五加皮酒的制備研究提供了初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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