基于國(guó)家專利的中藥復(fù)方調(diào)治肝癌用藥規(guī)律及作用機(jī)制研究

黃錦楨，陳團(tuán)團(tuán)，張喚喚，賽俊婷，賴劍萍，童光東,2*

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 第四臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 深圳 518033；2.深圳市中醫(yī)院 肝病科，廣東 深圳 518033)

肝癌有原發(fā)性與繼發(fā)性之分，是一種常見的惡性腫瘤。其中，原發(fā)性肝癌的發(fā)病率及死亡率在我國(guó)分別位居惡性腫瘤的第五位與第二位，嚴(yán)重威脅著人民的生命健康[1-2]。目前早期肝癌的治療首選手術(shù)切除, 中晚期則以介入治療、放化療、系統(tǒng)療法為主，但這些往往會(huì)給病人帶來胃腸道反應(yīng)、皮疹、高血壓等毒副作用，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[3]。因此，在西醫(yī)常規(guī)治療方案外，尋找一種可與之結(jié)合，互為補(bǔ)充的治療方法十分必要。

中醫(yī)講究四診和參、辨證論治、整體調(diào)理。通過合理的藥味搭配，中藥復(fù)方在抑制肝癌的同時(shí)，往往可有效緩解乏力、呃逆、腹水等癥狀，顯著改善患者生存質(zhì)量。而國(guó)家專利中藥復(fù)方作為現(xiàn)代組方選藥、新藥上市的一個(gè)重要組成部分，多為醫(yī)生長(zhǎng)期用藥智慧的匯聚、臨床經(jīng)驗(yàn)的結(jié)晶，具備較強(qiáng)的可重復(fù)性和適用性[4]。本研究將挖掘國(guó)家專利數(shù)據(jù)庫(kù)中調(diào)治肝癌的中藥復(fù)方專利數(shù)據(jù)，分析其用藥配伍規(guī)律，并運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步研究其作用機(jī)制，為中醫(yī)藥治療肝癌及新藥開發(fā)提供參考。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

登錄“國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局-中國(guó)專利公布公告”網(wǎng)（http://epub.sipo.gov.cn），在高級(jí)查詢選項(xiàng)中同時(shí)勾選“發(fā)明授權(quán)”與“發(fā)明公布”，在“文本-名稱”項(xiàng)目中分別以“肝癌and中藥”“肝癌and草藥”“肝細(xì)胞癌and中藥”“肝細(xì)胞癌and草藥”“膽管細(xì)胞癌and中藥”“膽管細(xì)胞癌and草藥”進(jìn)行檢索，對(duì)結(jié)果進(jìn)行合并、篩選后得到最終結(jié)果。檢索時(shí)間范圍為建庫(kù)至2021年10 月10 日。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①國(guó)家專利數(shù)據(jù)庫(kù)中調(diào)治肝癌的口服中藥復(fù)方專利，劑型不限；②國(guó)家專利數(shù)據(jù)庫(kù)調(diào)治肝癌含中藥提取物的專利；③專利項(xiàng)目名稱未明確說明調(diào)治肝癌，但發(fā)明專利詳情頁(yè)中說明可調(diào)治肝癌。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①非調(diào)治肝癌的專利；②調(diào)治肝癌的外用專利復(fù)方(外敷、膏藥等)；③中西藥物混合應(yīng)用的專利復(fù)方；④食品、飲品、保健品類專利。

1.3 數(shù)據(jù)規(guī)范及錄入

藥物名稱規(guī)范參照2020年版《中國(guó)藥典》[5]和《中藥大辭典》[6]，如“雙花”更改為“金銀花”，“旱蓮草”更改為“墨旱蓮”。若復(fù)方專利中藥物組成相同但劑型、制備工藝相異，該藥物組合僅錄入1次。按照雙盲錄入原則展開數(shù)據(jù)錄入并校對(duì)，把控 2 次數(shù)據(jù)結(jié)果相異率在1% 以下。

1.4 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行藥物頻數(shù)統(tǒng)計(jì)和系統(tǒng)聚類分析，借助IBM SPSS Modeler 18.0 軟件建模后實(shí)施Apriori 關(guān)聯(lián)規(guī)則分析。

1.5 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

1.5.1 關(guān)鍵藥物活性成分及相關(guān)靶點(diǎn)篩選 結(jié)合高頻中藥、藥對(duì)、角藥等結(jié)果，選取共有且排名最靠前的5味藥物作為治療肝癌的關(guān)鍵藥物。并以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為篩選條件，在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）獲取關(guān)鍵化學(xué)成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。

1.5.2 疾病靶點(diǎn)篩選 使用關(guān)鍵詞“l(fā)iver cancer”分別在Genecards及Disgenet數(shù)據(jù)庫(kù)檢索疾病靶點(diǎn)，因Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)靶點(diǎn)過多，故以“Relevance score”的中位數(shù)為條件進(jìn)行篩選，將得到的靶點(diǎn)匯總并去重。

1.5.3 KEGG富集分析 對(duì)藥物與疾病的靶點(diǎn)取交集，將交集靶點(diǎn)上傳至DAVID 6.7數(shù)據(jù)庫(kù)（http://david. ncifcrf. gov/）進(jìn)行 KEGG富集分析，限定人類為物種，以P＜0.05為條件進(jìn)行篩選，結(jié)合文獻(xiàn)篩選相關(guān)通路。

1.5.4 “關(guān)鍵藥物-成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 挖掘前20條通路上各自富集的靶點(diǎn)，借助CytoScape 3.7.2軟件構(gòu)建 “關(guān)鍵藥物-成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，如：連接度、介度、緊密度等篩選核心靶點(diǎn)及活性成分。

2 結(jié)果與分析

2.1 中藥專利公布情況

初步檢索得到97項(xiàng)專利，篩選后得到91項(xiàng)，所納入專利公布時(shí)段為2003年10月至2021年10月。

2.2 藥物頻數(shù)

91項(xiàng)專利共涉及藥物348味，所納入單項(xiàng)專利藥味數(shù)最多為50味，最少為2味，平均（12 ± 8.46）味。高頻藥物有白花蛇舌草（31次，34.07%）、柴胡（31次，34.07%）、黃芪（25次，27.47%）、白術(shù)（24次，26.37%）、半枝蓮（21，23.08%）等，見表1。統(tǒng)計(jì)所納入中藥的四氣五味信息，結(jié)果表明復(fù)方專利干預(yù)肝癌的中藥多歸肝、肺、脾、胃經(jīng)，性味以寒、苦居多，見圖1。

表1 前30味高頻藥物Tab. 1 Top 30 high frequency drugs

圖1 中藥四氣五味及歸經(jīng)統(tǒng)計(jì)Fig. 1 Radar chart of four nature, five flavors and meridian attribution of TCM

2.3 中藥的關(guān)聯(lián)分析

運(yùn)用Apriori 模型分析91項(xiàng)專利的藥物組合，設(shè)置條件支持度≥10%，規(guī)則置信度≥50%，最大前項(xiàng)數(shù)設(shè)定為2，結(jié)果得出：最大支持度34.07%，最小支持度13.19%，支持度越高，對(duì)應(yīng)藥物出現(xiàn)頻率越高。支持度前10的藥對(duì)及角藥組合，見表2、表3。

表2 中藥二項(xiàng)關(guān)聯(lián)分析（支持度前10）Tab. 2 Second order analysis table of TCM （top 10 of support）

表3 中藥三項(xiàng)關(guān)聯(lián)分析（支持度前10）Tab. 3 Third order analysis table of TCM（top 10 of support）

2.4 聚類分析

對(duì)30味高頻中藥進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，分析結(jié)果及藥物組合見圖2。當(dāng)歐式距離平方為19時(shí)，可得到6項(xiàng)聚類結(jié)果，其中藥物大于2味的有5項(xiàng)，見表4。

圖2 藥物聚類分析樹狀圖Fig. 2 Dendrogram of drug cluster analysis

表4 高頻中藥聚類分析結(jié)果Tab. 4 Results of cluster analysis of high frequency TCM

2.5 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

2.5.1 活性成分及相關(guān)靶點(diǎn) 結(jié)果共篩選白花蛇舌草、柴胡、黃芪、白術(shù)、半枝蓮這5味中藥為關(guān)鍵藥物；在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)上檢索并匯總?cè)ブ睾?，最終得到活性成分共70種，相關(guān)靶點(diǎn)202個(gè)。

2.5.2 疾病靶點(diǎn) 在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索并以Relevance score≥2.25篩選后得8 403個(gè)疾病靶點(diǎn)，Disgenet數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到靶點(diǎn)1 395個(gè)，兩者去重后共得到8 650個(gè)靶點(diǎn)。

2.5.3 KEGG通路分析 藥物與疾病的靶點(diǎn)取交集后共有184個(gè)靶點(diǎn)，見圖3。富集分析共得到KEGG通路126條，結(jié)合文獻(xiàn)對(duì)所得通路進(jìn)行篩選，見圖4。

圖3 高頻藥物及疾病靶點(diǎn)韋恩圖Fig. 3 Venn diagram of high frequency drugs and disease targets

圖4 前20條KEGG相關(guān)通路氣泡圖Fig. 4 Bubble diagram of the first 20 KEGG-related pathways

2.5.4 “關(guān)鍵藥物-成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 借助軟件構(gòu)建“關(guān)鍵藥物-成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖5。對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖節(jié)點(diǎn)的連接度、介度及緊密度等參數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果表示化學(xué)成分前四位是quercetin（槲皮素）、kaempferol（山柰酚）、luteolin（木犀草素）和wogonin（漢黃芩素），蛋白靶點(diǎn)前四個(gè)是PTGS2、PTGS1、NCOA2和PRSS1，將上述篩選為關(guān)鍵成分及靶點(diǎn)，見表5。

表5 核心成分及靶點(diǎn)相關(guān)參數(shù)Tab. 5 Core components and target related parameters

圖5 “關(guān)鍵藥物—成分—靶點(diǎn)—通路”網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 5 Network diagram of "key drug-component-target-pathway"

3 討論

近年來，數(shù)據(jù)挖掘與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在中醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用已成為中醫(yī)藥現(xiàn)代研究的一個(gè)新方法與新熱點(diǎn)。應(yīng)用大數(shù)據(jù)，可探討中醫(yī)藥處方規(guī)律、中醫(yī)藥治療疾病的多成分-多靶點(diǎn)-多通路等方面。大多數(shù)中醫(yī)藥處方用藥規(guī)律研究的數(shù)據(jù)庫(kù)來源是基于某位醫(yī)師對(duì)某疾病的處方收集或者是某醫(yī)書對(duì)某疾病的處方收集。與常規(guī)的數(shù)據(jù)庫(kù)來源不同，本研究的處方數(shù)據(jù)庫(kù)是來源于國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專利庫(kù)中的肝癌復(fù)方專利。中藥專利處方是醫(yī)生多年臨床經(jīng)驗(yàn)的結(jié)晶，是多數(shù)基礎(chǔ)研究的根基，是經(jīng)過專業(yè)機(jī)構(gòu)認(rèn)可的。因此，采用此數(shù)據(jù)庫(kù)研究中藥復(fù)方治療肝癌的用藥規(guī)律，既經(jīng)得起臨床的考驗(yàn)，又具有一定基礎(chǔ)研究的佐證。

本研究共納入專利91項(xiàng)，涉及藥物348味。通過頻次及關(guān)聯(lián)分析，得到高頻藥物有白花蛇舌草、柴胡、黃芪、白術(shù)、半枝蓮等。中醫(yī)講究辨證論治，處方用藥與病因病機(jī)息息相關(guān)。肝癌的核心病機(jī)之一為毒熱，熱毒貫穿疾病始終，故臨床上多用清熱解毒類治療肝癌[7]。正如《素問·至真要大論》云：“治熱以寒，熱者寒之”，高頻藥物白花蛇舌草和半枝蓮正是清熱解毒類藥物，二藥相須配伍，協(xié)同增效，發(fā)揮清熱解毒、化瘀抗癌之效。同時(shí)，現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)研究表明白花蛇舌草可通過增強(qiáng)小鼠機(jī)體的細(xì)胞免疫及體液免疫能力，使機(jī)體可有效的識(shí)別并清除肝癌細(xì)胞，從而抑制腫瘤血管生成[8]；半枝蓮β-谷甾醇能增加荷瘤小鼠機(jī)體抗腫瘤細(xì)胞因子的分泌，減少免疫抑制因子的分泌，從而抑制肝瘤的進(jìn)展[9]。正是基于上述功效，這二味常以藥對(duì)形式出現(xiàn)在各類抗腫瘤的方劑中[10]，此藥對(duì)也是本研究中頻率最高的藥對(duì)。肝癌起病隱匿，病程較長(zhǎng)，久病必虛，耗傷正氣；肝病日久，肝木克土，橫逆犯脾，如《金匱要略》言：“見肝之病，知肝傳脾，當(dāng)先實(shí)脾”。高頻藥物黃芪、白術(shù)可健脾益氣，如《本草求真》稱黃芪為“補(bǔ)氣諸藥之最”，《醫(yī)學(xué)啟源》言白術(shù)可: “除濕益燥，和中益氣，溫中等”。此二藥相配，可健全后天脾胃之本，恢復(fù)人體正氣以驅(qū)邪外出。同時(shí)，現(xiàn)代研究闡釋了黃芪具有抗腫瘤、提高機(jī)體免疫力的作用[11]；白術(shù)可通過抑制細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及抑制腫瘤新生血管生成等作用[12]。肝為剛臟，以血為體，以氣為用，體陰而用陽(yáng)。肝臟疾病常影響到肝臟疏泄功能，導(dǎo)致機(jī)體氣機(jī)不暢，故常需配伍行氣疏肝的中藥，如高頻藥物柴胡。

從藥物性味歸經(jīng)而言，復(fù)方專利的中藥以苦寒為主，主入肝、肺、脾、胃經(jīng)，這亦體現(xiàn)中醫(yī)處方用藥特色。苦寒以清熱解毒，高頻藥物白花蛇舌草、半枝蓮均為苦寒之品。肝氣升發(fā)，肺氣肅降，肝癌病位在肝，易致肝肺氣機(jī)失衡，藥物入肝肺經(jīng)，可協(xié)調(diào)肝肺之氣，維持人體氣機(jī)之圓運(yùn)動(dòng)。肝屬木，脾屬土，肝臟受邪，肝木克土，多見脾胃癥狀，故臨床治療肝病需顧及脾胃，高頻藥物黃芪、白術(shù)均歸脾胃經(jīng)。

通過關(guān)聯(lián)規(guī)則可知，復(fù)方專利常用的藥對(duì)有半枝蓮-白花蛇舌草、白術(shù)-黃芪、柴胡-黃芪等，置信度較高的角藥組合有：白術(shù)-黃芪-白花蛇舌草、白術(shù)-黃芪-柴胡、黃芪-柴胡-白術(shù)等。這些藥對(duì)、角藥基本是臨床常用的藥味搭配，其功用多為清熱解毒、健脾益氣，與肝癌的虛、瘀的病機(jī)一一對(duì)應(yīng)，適用于肝癌各種證型。如:“半枝蓮-白花蛇舌草”組合清熱解毒，適用于濕熱毒結(jié)證型肝癌?！鞍仔g(shù)-黃芪”藥對(duì)益氣健脾，可用于脾虛濕困證型肝癌。

高頻藥物聚類分析共得出6項(xiàng)結(jié)果，以每類中多數(shù)藥物的功效再劃分，將此 6類分為清熱解毒類（①、②）、疏肝健脾類（③）和活血化瘀類（④、⑤、⑥）。類①為以角藥“白花蛇舌草、半枝蓮、黃芩”以清熱解毒；肝癌患者正氣虧虛，氣血津液不通，痰瘀稽留而成“癌毒”，藥對(duì)“虎杖、桃仁”可活血祛瘀、潤(rùn)下通便，女貞子則以滋先天而養(yǎng)后天。類③為四君子湯和逍遙散合方化裁，該組合均出自《太平惠民和劑局方》，是指南[1]中“肝郁脾虛型”的推薦方。四君子湯具有補(bǔ)氣，益氣健脾之功效；逍遙散可調(diào)和肝脾，疏肝健脾。后天之本得固，氣血生化有源，方能有正氣存內(nèi)、持久抗癌。類④為名方鱉甲湯加減，原方出自《圣濟(jì)總錄》，由鱉甲、桃仁、虎杖、大黃四味組成，功效化瘀下積，主治癖塊腹?jié)M寒熱。原方以鱉甲軟堅(jiān)散結(jié)，桃仁、虎杖、大黃三味活血化瘀、通下瀉邪。臨床上切忌通下過妄，類④在保留鱉甲湯的核心藥物基礎(chǔ)上，以藥對(duì)“三棱-莪術(shù)”代替桃仁以活血化瘀，去虎杖減緩潤(rùn)下之效，增牡蠣軟堅(jiān)散結(jié)，加山慈菇清熱散結(jié)。

在用藥規(guī)律分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對(duì)關(guān)鍵藥物治療肝癌的作用機(jī)制進(jìn)行探討，并初步篩選出槲皮素、山柰酚、木犀草素和漢黃芩素為核心活性成分。有研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可以下調(diào)肝癌細(xì)胞中MCL-1的表達(dá)來增強(qiáng)γδ T細(xì)胞對(duì)Huh7細(xì)胞的殺傷活性[13]；山柰酚能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞DNA損傷，而后者是腫瘤細(xì)胞化療凋亡的主要機(jī)制[14]。孟欣等[15]研究發(fā)現(xiàn)木犀草素能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞促增殖、促凋亡基因及新生血管因子的表達(dá)；李美德等[16]研究發(fā)現(xiàn)黃芩素可下調(diào)癌癥基因JUN、EGFR的表達(dá)及上調(diào)細(xì)胞周期調(diào)控因子的表達(dá)。因此推斷高頻藥物可能是通過下調(diào)癌細(xì)胞中MCL-1、抑制癌細(xì)胞的基因、促癌基因的表達(dá)等發(fā)揮抑制癌細(xì)胞增殖與血管新生活力，從而起到抗肝癌作用。靶點(diǎn)方面，研究顯示PTGS1的基礎(chǔ)表達(dá)是可維持肝臟內(nèi)環(huán)境所必須的，也可保護(hù)肝臟免受化學(xué)性肝毒性的損傷[17]；PTGS2可刺激癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)血管生成，PTGS2抑制劑可抑制人肝細(xì)胞癌的生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18-19]。研究表明絲氨酸蛋白1（PRSS1）在多種消化腫瘤中高表達(dá)，其可能參與了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[20]；核受體輔激活因子 NCOA2（又稱Src-2），在肝腫瘤發(fā)生過程中，可發(fā)揮細(xì)胞自主腫瘤抑制作用[21]。故高頻藥物可能通過促進(jìn)PTGS1 、NCOA2的表達(dá)與抑制PTGS2、PRSS1的表達(dá)起到抗癌作用。通路方面，篩選后相關(guān)的有Hepatitis B、TNF、HIF-1、T cell receptor 等通路。慢性病毒性肝炎是為肝癌最主要的原因，中國(guó)約有54%的肝癌是由HBV引起的[22]。相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)TNF、HIF-1、T cell receptor 通路與細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答密切相關(guān)，這些與肝癌疾病的進(jìn)展密不可分[23-25]。

4 結(jié)論

本研究揭曉了復(fù)方專利調(diào)治肝癌有規(guī)可循，其基本大法以清熱解毒、益氣健脾、活血化瘀為主，輔以通下、疏肝、滋陰等，這契合肝癌的病機(jī)。在用藥規(guī)律基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)作用機(jī)制初步探討。不足之處為部分專利僅說明用藥區(qū)間或未闡明復(fù)方的適用證型，故未能分析量效關(guān)系及對(duì)證型統(tǒng)計(jì)分析。后續(xù)將對(duì)名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行深入研究及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的結(jié)果，以冀為治療肝癌的臨床用藥提供參考，為臨床研發(fā)治療肝癌的新藥奠定前期基礎(chǔ)。