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    AB-8型大孔吸附樹脂分離純化了哥王總黃酮

    2012-12-03 05:44:44李姣姣李超王乃馨鄭義王衛(wèi)東
    食品研究與開發(fā) 2012年5期
    關(guān)鍵詞:樣液大孔黃酮

    李姣姣,李超,王乃馨,鄭義,王衛(wèi)東

    (徐州工程學(xué)院食品工程學(xué)院,江蘇 徐州 221008)

    了哥王[Wikstroemiaindica(L.)C.A.Mey.]始載于《嶺南采藥錄》,為瑞香料蕘花屬植物,苦寒、微辛、有毒,清熱解毒、化痰散結(jié)、通經(jīng)利水,可用于治療扁桃體炎、腮腺炎、淋巴結(jié)炎、支氣管炎、哮喘、肺炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、跌打損傷、麻風(fēng)、閉經(jīng)、水腫等疾病,其主要含有黃酮類化合物等有效成分[1-6]。大孔吸附樹脂是一類不溶于酸、堿及各種有機(jī)溶劑且有較好吸附性能的有機(jī)高聚物吸附劑,近年來(lái)廣泛被應(yīng)用于醫(yī)藥、環(huán)保和食品等領(lǐng)域[7],在中草藥研究方面也較廣泛,尤其在黃酮類化合物中:如紅樹莓總黃酮[8],銀杏葉總黃酮[9]和杭白菊總黃酮[10]等及其他各類成分均有采用大孔吸附樹脂法進(jìn)行分離純化的研究。而應(yīng)用于了哥王總黃酮分離純化方面鮮見報(bào)道,故本研究對(duì)AB-8型大孔吸附樹脂純化了哥王總黃酮的工藝進(jìn)行研究,為該資源的進(jìn)一步開發(fā)提供科學(xué)的理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 原料與試劑

    了哥王購(gòu)自安徽亳州藥材市場(chǎng),經(jīng)江南大學(xué)食品學(xué)院高獻(xiàn)禮博士鑒定;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品:南京替斯艾么中藥研究所,批號(hào):TCM027-090316;AB-8型大孔吸附樹脂:安徽三星樹脂有限公司;其他均為分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    CW-2000型超聲-微波協(xié)同萃取儀:上海新拓分析儀器科技有限公司;SBS數(shù)控記滴自動(dòng)部分收集器:上海滬西分析儀器廠;pHS-3C型酸度計(jì):上海雷磁儀器廠;7230G可見分光光度計(jì):上海精密科學(xué)儀器有限公司;LGJ-10冷凍干燥機(jī):北京四環(huán)科學(xué)儀器廠。

    1.3 方法

    1.3.1 樣品溶液的制備方法

    精確稱取1.4 g原料于100 mL特制三角瓶中,然后加入70%乙醇42 mL、在微波功率400 W的條件下提取時(shí)間120 s后,抽濾、定容于100 mL、測(cè)定。

    1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

    以蘆丁為對(duì)照品,采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法[11]。精確稱取蘆丁20 mg置于250 mL容量瓶中,加60%乙醇稀釋至刻度,搖勻,配成0.08 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精確量取對(duì)照品儲(chǔ)備液 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL,分別置于10 mL具塞刻度試管中,先依次分別加60%乙醇 5.0、4.0、3.0、2.0、1.0、0 mL,再加入 0.3 mL 5%NaNO2搖勻后靜置6 min,再加入0.3 mL 10%Al(NO3)3搖勻后靜置6 min,最后加入4 mL 1 mol/L NaOH后用60%乙醇定容至刻度,搖勻后靜置10 min,以60%乙醇為空白參比,于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo),得回歸方程:A=11.688C-0.0301,R2=0.9990,結(jié)果表明在 0.008 mg/mL~0.040 mg/mL之間線性良好。

    1.3.3 大孔吸附樹脂的預(yù)處理[12]

    按文獻(xiàn)[12]方法稍加修改:將準(zhǔn)備裝柱的新樹脂先用適量的乙醇浸泡充分溶脹,然后裝柱,以4 BV/h~5 BV/h的流速使5倍~8倍的乙醇通過(guò)樹脂層,洗至流出液加適量的水無(wú)白色渾濁現(xiàn)象,再以8 BV/h~10 BV/h的流速使雙蒸水通過(guò)樹脂層,洗盡醇,最后轉(zhuǎn)入酸堿處理,即用200 mL的5%HCl溶液,以5 BV/h的流速通過(guò)樹脂層,并浸泡3 h,而后用雙蒸水以同樣流速洗至出水pH為中性,再用200 mL的5%NaOH溶液,以5 BV/h的流速通過(guò)樹脂層,并浸泡3 h,而后用雙蒸水以同樣流速洗至出水pH中性。

    1.3.4 靜態(tài)吸附試驗(yàn)

    取大孔吸附樹脂6.0800 g(用濾紙吸干后稱重,干重1.3848 g),裝入250 mL具塞磨口三角瓶中,精密加入30 mL濃度為0.493 mg/mL的樣液,避光密封,并置恒溫振蕩器中,在30℃下,以120 r/min振蕩24 h(其中在前8小時(shí)內(nèi),每小時(shí)各取1mL;在第24小時(shí)取1mL,共9個(gè)1 mL),測(cè)定這9個(gè)1 mL的總黃酮濃度,繪制靜態(tài)吸附曲線。

    1.3.5 動(dòng)態(tài)吸附洗脫試驗(yàn)

    首先將預(yù)處理好的樹脂濕法裝入(1.6 cm×20 cm,1 BV為30 mL)玻璃層析柱中,然后將了哥王總黃酮提取液上柱,待樣品溶液全部通過(guò)樹脂柱后用去離子水洗至流出液無(wú)色,最后洗脫,收集洗脫液。通過(guò)測(cè)定總黃酮含量考察各因素對(duì)樹脂性能的影響,確定最佳工藝條件。

    1.3.6 吸附容量和吸附率的測(cè)定

    式中:R 為吸附容量,(mg/g);C0為吸附液初始濃度,(mg/mL);C1為吸附液平衡濃度,(mg/mL);V1為吸附液體積,mL;W為樹脂干重,g。

    假設(shè)吸附前后吸附液體積不變,可由下列公式計(jì)算吸附率。

    式中:S為吸附率;C0為吸附液初始濃度,(mg/mL);C1為吸附液平衡濃度,(mg/mL)。

    1.3.7 洗脫率的測(cè)定

    式中:T為洗脫率;C0為吸附液初始濃度,(mg/mL);C1為吸附液平衡濃度,(mg/mL);V1為吸附液體積,mL;C2為洗脫液濃度,(mg/mL);V2為洗脫液體積,mL。

    1.3.8 純度的測(cè)定

    分別將提取液和洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器回收乙醇后冷凍干燥,得到粉狀產(chǎn)品,再分別準(zhǔn)確稱取總黃酮提取物和純化物粉末0.02 g,70%乙醇定容,搖勻,測(cè)定,計(jì)算總黃酮純度。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 靜態(tài)吸附洗脫試驗(yàn)

    2.1.1 吸附容量、吸附率及洗脫率

    吸附容量、吸附率及洗脫率見表1。

    表1 吸附容量、吸附率及洗脫率Table 1 Adsorption capacity,adsorption rate and elution rate

    由表1可以看出,AB-8型大孔吸附樹脂不僅有較大的吸附率,還有較高的洗脫率。

    2.1.2 靜態(tài)吸附曲線

    僅僅以大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附率來(lái)評(píng)價(jià)其吸附性是不全面的,合適的吸附樹脂除了具有較大的吸附容量、吸附率和洗脫率外,同時(shí)還要有較快的吸附效果,故將AB-8大孔吸附樹脂進(jìn)行吸附動(dòng)力學(xué)試驗(yàn),結(jié)果如圖1所示。

    從圖1可知,AB-8型大孔吸附樹脂對(duì)了哥王總黃酮的吸附為快速平衡型,起始階段的總黃酮濃度較大,在1 h后基本達(dá)到平衡,AB-8型大孔吸附樹脂對(duì)了哥王總黃酮具有良好的吸附動(dòng)力學(xué)特性。綜上分析可知,該樹脂對(duì)了哥王總黃酮具有良好的吸附洗脫特性,適合了哥王總黃酮的分離純化。

    圖1 靜態(tài)吸附曲線Fig.1 Static absorption curve

    2.2 動(dòng)態(tài)吸附洗脫試驗(yàn)

    2.2.1 上樣液濃度對(duì)吸附效果的影響

    在上樣液流速2 BV/h和上樣液pH 5.4的條件下,考察不同上樣液濃度對(duì)樹脂吸附效果的影響,結(jié)果見圖2。

    圖2 上樣液濃度的影響Fig.2 Effects of concentrations of sample solution

    由圖2可知,低濃度不利于總黃酮的吸附,因?yàn)樯蠘右簼舛绕?,吸附不充分;高濃度? mg/mL)時(shí),了哥王水溶液易發(fā)生沉淀現(xiàn)象;當(dāng)以1.5 mg/mL上柱時(shí),吸附率較大,所以在此選擇上樣液濃度為1.5 mg/mL。

    2.2.2 上樣液流速對(duì)吸附效果的影響

    在上樣液濃度1.5 mg/mL和上樣液pH 5.4的條件下,通過(guò)調(diào)節(jié)恒流泵的轉(zhuǎn)速對(duì)上樣液進(jìn)行吸附流速的選擇,考察不同上樣液流速對(duì)樹脂吸附效果的影響,結(jié)果見圖3。

    由圖3可知,隨著上樣液流速的增加,吸附量先稍微增加而后降低。上樣液流速低,較利于總黃酮的吸附,但循環(huán)周期長(zhǎng);當(dāng)以2 BV/h上柱時(shí),吸附量最大;上樣液流速大于2 BV/h時(shí),由于流速過(guò)快,樹脂還未來(lái)得及吸附,樣液就已流出。所以在此選擇上樣液流速為2 BV/h。

    圖3 上樣液流速的影響Fig.3 Effects of velocity of sample solution

    2.2.3 上樣液pH對(duì)吸附效果的影響

    上樣液pH對(duì)吸附、分離效果的影響是十分重要的。根據(jù)化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)調(diào)整上樣液pH,可達(dá)到較好的吸附效果。在上樣液濃度1.5 mg/mL和上樣液流速2 BV/h的條件下,考察不同上樣液pH對(duì)樹脂吸附效果的影響,結(jié)果見圖4。

    圖4 上樣液pH的影響Fig.4 Effects of pH values of sample solution

    由圖4可知,從吸附量上考慮,pH 5.4的條件進(jìn)行吸附比較合適。這是因?yàn)辄S酮類化合物含多羥基,呈弱酸性。故要達(dá)到較好的吸附效果,吸附需在pH 5.4條件下進(jìn)行。

    2.2.4 動(dòng)態(tài)吸附曲線

    在上樣液濃度為1.5 mg/mL、上樣液流速2 BV/h和上樣液pH 5.4的條件下通過(guò)已處理好的樹脂柱,進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附,結(jié)果見圖5。

    圖5 動(dòng)態(tài)吸附曲線Fig.5 Dynamic absorption curve

    從圖5可知,上樣液體積達(dá)到32 mL時(shí)樹脂基本不再吸附總黃酮(此時(shí)吸附量為30.234 mg/g,吸附率為89.62%)。動(dòng)態(tài)吸附曲線進(jìn)一步說(shuō)明AB-8型大孔吸附樹脂對(duì)總黃酮有較大的吸附量,適用于純化了哥王總黃酮。

    2.2.5 洗脫液濃度對(duì)洗脫效果的影響

    洗脫流速過(guò)快,洗脫性能差,洗脫帶寬,而且脫尾嚴(yán)重,洗脫不完全;但是流速過(guò)慢,則會(huì)延長(zhǎng)生產(chǎn)周期,通常情況下控制洗脫流速為吸附流速的1/3~1/2[13]。本實(shí)驗(yàn)固定洗脫流速為吸附流速的1/2來(lái)考察不同洗脫液濃度對(duì)洗脫效果的影響(其他條件為上樣液濃度為1.5 mg/mL、上樣液流速 2 BV/h、上樣液 pH5.4),結(jié)果見圖6。

    圖6 洗脫液濃度的影響Fig.6 Effects of concentrations of desorption solution

    由圖6可知,70%乙醇的洗脫率和90%乙醇的洗脫率差不多,考慮到成本問(wèn)題,所以選擇洗脫液濃度為70%。

    2.2.6 動(dòng)態(tài)洗脫曲線

    在上樣液濃度為1.5mg/mL、上樣液流速2BV/h、上樣液pH5.4、洗脫液濃度為70%和洗脫液流速1 BV/h的條件下,進(jìn)行動(dòng)態(tài)洗脫,結(jié)果見圖7。

    圖7 動(dòng)態(tài)洗脫曲線Fig.7 Dynamic elution curve

    由圖7可知,70%乙醇通過(guò)約30 mL時(shí)總黃酮開始被洗脫下來(lái),之后在40 mL附近時(shí)迅速達(dá)到高峰,通過(guò)80 mL后,吸附在樹脂上的總黃酮基本被洗脫下來(lái),洗脫曲線出峰快,僅稍有拖尾現(xiàn)象。

    2.3 純度測(cè)定結(jié)果

    純度測(cè)定結(jié)果見表2。

    表2 總黃酮的純度Table 2 Purity of total flavonoids %

    由表2可知,經(jīng)純化后,純度由原來(lái)的8.05%提高到了20.60%,提高了1.56倍。

    3 結(jié)論

    1)AB-8型大孔吸附樹脂為理想的了哥王總黃酮分離純化的樹脂,它的吸附率為74.84%,洗脫率為79.68%。

    2)AB-8型大孔吸附樹脂分離純化了哥王總黃酮的吸附的最佳工藝參數(shù)為上樣液濃度1.5 mg/mL、上樣液流速2 BV/h和上樣液pH 5.4,洗脫的最佳工藝參數(shù)為洗脫液濃度70%乙醇、洗脫液流速1 BV/h和洗脫劑用量為80 mL;在最佳工藝參數(shù)條件下了哥王純化產(chǎn)品中總黃酮的純度由8.05%提高到20.60%,提高了1.56倍,由此可以看出AB-8型大孔吸附樹脂可以有效地分離純化了哥王總黃酮。

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