基于化學(xué)計(jì)量學(xué)結(jié)合UPLC評(píng)價(jià)白術(shù)藥材質(zhì)量

林 爽，王 杰，高珊珊，張志強(qiáng)，周永康，吉艷慧

（1. 北京康仁堂藥業(yè)有限公司，北京 101301；2. 中藥配方顆粒關(guān)鍵技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，北京 101301）

白術(shù)在我國(guó)具有悠久的應(yīng)用和栽培歷史，主要生長(zhǎng)分布于浙江、江西、安徽、河南等地[1]，其主要成分為揮發(fā)油[2-3]、多糖[4-6]、內(nèi)酯類[7-9]等，藥理學(xué)研究表明具有保肝、調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)、抗炎性反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、降血糖等作用[10-11]。白術(shù)作為我國(guó)的大宗藥材品種，在臨床上亦有廣泛應(yīng)用。

在白術(shù)藥材的質(zhì)量控制方面，有指紋圖譜研究[12-15]報(bào)道，提示白術(shù)質(zhì)量與產(chǎn)地、不同炮制規(guī)格存在一定的相關(guān)性。含量測(cè)定方面多集中在內(nèi)酯類[16-18]的成分，也有少部分有機(jī)酸類[19-20]成分研究，未見同時(shí)檢測(cè)兩大類成分含量的文獻(xiàn)報(bào)道。本次試驗(yàn)采用超高效液相色譜法建立指紋圖譜，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)，分析研究影響白術(shù)質(zhì)量的主要成分群，篩選出影響白術(shù)質(zhì)量的兩大類關(guān)鍵性成分，并對(duì)其中5種化合物定量分析，為白術(shù)的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

ACQUITY UPLC H-Class型超高效液相色譜儀（搭載PDA檢測(cè)器，配備Empower3工作站）、CORTECS UPLC Shield RP18色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.6μm）（美國(guó)Waters公司）；ML204T型分析天平 （d = 0.001 g）、MSA6.6S.0CE-DM型電子天平（d = 0.001mg）（德國(guó)Sartorius公司）。

1.2 試藥

乙腈（色譜純，德國(guó)Merck KGaA公司）；磷酸（色譜純，美國(guó)Fisher公司）；蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）；甲醇（分析純，國(guó)藥集團(tuán)有限公司）。

綠原酸（批號(hào)：110753-202119，純度：96.3%）、3, 5-O-二咖啡?；鼘幩幔ㄅ?hào)：111782-201807，純度：94.3%）、4, 5-O-二咖啡?；鼘幩幔ㄅ?hào)：111894-202104，純度：95.1%）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ（批號(hào)為111978-201501，純度：99.9%）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ（批號(hào)：111976-201501，純度：99.9%）以上5種對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；新綠原酸（批號(hào)：DSTDX001502，純度：99.68%）、隱綠原酸（批號(hào)：DSTDY003502，純度：98.77%）以上2種對(duì)照品購(gòu)于成都德思特生物技術(shù)有限公司。

1.3 藥材

收集的16批白術(shù)樣品為北京康仁堂定點(diǎn)采購(gòu)的菊科植物白術(shù)Atractylodis macrocephalaeKoidz一年至兩年生的干燥根莖，經(jīng)北京康仁堂藥業(yè)有限公司“中藥傳承工作室”工程師于立偉鑒定為正品白術(shù)。其中，S1 ～ S6產(chǎn)地為安徽、S7 ～ S12產(chǎn)地為河南、S13 ～ S16產(chǎn)地為浙江，樣品信息見表1。

表1 白術(shù)樣品信息表Tab. 1 Sample information table of AMR

2 方法與結(jié)果

2.1 指紋圖譜研究

2.1.1 色譜條件 色譜柱為CORTECS UPLC Shield RP18（2.1 mm×150 mm，1.6μm），流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫順序?yàn)? ～ 8 min，8% → 12%A；8 ～ 18 min，12% → 39%A；18 ～ 30 min，39% → 48%A；30 ～ 40 min，48% → 90%A。體積流量為0.3 mL/min，柱溫為30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為221 nm，采樣體積為3μL。

2.1.2 配制參照物對(duì)照品溶液 以50%甲醇為溶媒制成每1 mL含10μg的白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ溶液。

2.1.3 配制樣品溶液 精密稱取白術(shù)粉末1 g，于100 mL具塞錐形瓶中，精密加50%甲醇25 mL，密塞，稱重，80℃加熱回流提取30 min，冷卻后補(bǔ)足失重，離心，過濾。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 按“2.1.3”項(xiàng)配制白術(shù)樣品（S1）溶液后，按“2.1.1”項(xiàng)連續(xù)進(jìn)樣檢測(cè)6次，參考峰設(shè)定為白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ，并計(jì)算出21個(gè)共有峰與參考峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，RSD分別為0.01% ～ 0.04%、0.17% ～ 2.56%，表明儀器具有良好的精密度。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.1.3”項(xiàng)配制白術(shù)樣品（S1）溶液后，按“2.1.1”項(xiàng)下分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣檢測(cè)，參考峰設(shè)定為白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ，并計(jì)算出21個(gè)共有峰與參考峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，RSD分別為0.01% ～ 0.06%、0.17% ～ 1.98%，表明在24 h內(nèi)樣品溶液具有良好的穩(wěn)定性。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.1.3”項(xiàng)配制6份白術(shù)樣品（S1）溶液后，按“2.1.1”項(xiàng)進(jìn)樣檢測(cè)，參考峰設(shè)定為白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ，并計(jì)算出21個(gè)共有峰與參考峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，RSD分別為0.01% ～0.08%、0.17% ～ 2.89%，表明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.1.7 多批次樣品色譜圖 按“2.1.3”項(xiàng)配制16批白術(shù)樣品溶液后，按“2.1.1”項(xiàng)進(jìn)樣檢測(cè)，將色譜圖導(dǎo)入“指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”，設(shè)置S1為參照?qǐng)D譜、時(shí)間窗寬度為0.1，采用中位數(shù)法結(jié)合全譜峰匹配方式，得到16批白術(shù)指紋圖譜疊加圖及對(duì)照指紋圖譜，見圖1，其相似度在0.972 ～0.995，表明各批次之間相似度良好。

圖1 16批白術(shù)藥材的UPLC疊加圖譜（S1 ～ S16）及對(duì)照?qǐng)D譜（R）Fig. 1 UPLC fingerprints of 16 batches of AMR（S1 ～ S16）and reference fingerprints（R）

2.1.8 共有峰的指認(rèn) 經(jīng)匹配后標(biāo)定了16批白術(shù)中的21個(gè)共有峰，通過對(duì)照品比對(duì)，指認(rèn)出7個(gè)色譜峰，分別為新綠原酸、隱綠原酸、綠原酸、3，5-O-二咖啡?；鼘幩?、4, 5-O-二咖啡?；鼘幩帷仔g(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ，見圖2。9號(hào)色譜峰（白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ）保留時(shí)間和峰面積適中，故以峰9為參照峰。

圖2 7個(gè)共有峰在白術(shù)中的指認(rèn)Fig. 2 Identification of seven common peaks in AMR referenc

2.2 化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

2.2.1 聚類分析（CA） 以16批白術(shù)指紋圖譜21個(gè)共有峰的峰面積為變量，應(yīng)用SPSS 25.0軟件進(jìn)行CA分析，聚類方法為組間聯(lián)接，應(yīng)用平方歐式距離、標(biāo)準(zhǔn)化采用Z得分方法，聚類分析結(jié)果見圖3，當(dāng)類間距為15 ～ 20時(shí)，16批白術(shù)藥材可以被分為3類，分別為S7 ～ S12、S13 ～ S16、S1 ～ S6，這三類白術(shù)樣品的產(chǎn)地分別為安徽、河南和浙江，提示白術(shù)的質(zhì)量與產(chǎn)地具有一定的相關(guān)性。

圖 3 16批白術(shù)藥材聚類分析樹狀圖Fig. 3 Cluster analysis of 16 batches of AMR

2.2.2 主成分分析（PCA） 以16批白術(shù)指紋圖譜21個(gè)共有峰的峰面積為變量，應(yīng)用SPSS 25.0軟件進(jìn)PCA分析，特征值和方差貢獻(xiàn)率結(jié)果見表2。提取出主成分特征值大于1的共有5個(gè)，累積貢獻(xiàn)率為88.32%，大于50%，能夠表征16批白術(shù)的質(zhì)量特點(diǎn)。初始因子載荷矩陣結(jié)果見表3，其中，第1主成分包含的信息量最大，峰9、峰12、峰11（均大于0.9）有明顯的載荷值；峰14、峰20、峰15（均大于0.8）在第2主成分中有明顯的載荷值；峰7、峰5、峰6（均大于0.85）在第3主成分中有明顯的載荷值，表明影響白術(shù)藥材質(zhì)量差異性的是多個(gè)成分。鑒于主成分1的貢獻(xiàn)值最大，因此篩選峰9（白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ）、峰12（白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ）作為含量測(cè)定的指標(biāo)性成分。用SIMCA 14.1繪圖軟件，對(duì)21個(gè)共有峰的峰面積進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見圖4，其結(jié)果與聚類分析結(jié)果一致。

圖4 白術(shù)PCA 圖Fig. 4 PCA plots of 16 batches of AMR

表2 特征值與方差貢獻(xiàn)率Tab. 2 Eigenvalue and contribution rate

表 3 初始因子載荷矩陣Tab. 3 Initial factors loading matrix

2.2.3 偏最小二乘法判別分析（PLS-DA） 以16批白術(shù)的共有峰的峰面積為變量，使用SIMCA 14.1軟件進(jìn)行PLS-DA分析。建立的PLS-DA模型中，累積解釋能力參數(shù)R2X和R2Y分別為0.659和0.841，預(yù)測(cè)能力參數(shù)Q2為0.774，均大于0.5，說明模型可靠。由PLS-DA得分圖（圖5）可知，16批白術(shù)樣品被分為3類，根據(jù)模型中變量權(quán)重要性排序（VIP）預(yù)測(cè)值（見圖6），篩選出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（VIP＞1）的差異標(biāo)志物，分別為峰13（VIP = 1.32）、峰4（VIP =1.27）、峰3 （VIP = 1.25）、峰1（VIP = 1.23）、峰8 （VIP =1.22）、峰2（VIP = 1.21）、峰16（VIP = 1.01）。因此，篩選峰4（綠原酸）、峰3（隱綠原酸）、峰2（新綠原酸）可作為鑒別和區(qū)分白術(shù)質(zhì)量的標(biāo)志物，選擇為含量測(cè)定指標(biāo)成分。

圖 5 白術(shù)的 PLS-DA 得分圖Fig. 5 PLS-DA scores plots of 16 batches of AMR

圖6 VIP 值Fig. 6 VIP plot

2.3 含量測(cè)定

2.3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 在白術(shù)指紋圖譜中，新綠原酸、隱綠原酸和綠原酸3種有機(jī)酸類的響應(yīng)值和分離度不佳，不能達(dá)到含量測(cè)定的檢測(cè)要求，因此選擇其它檢測(cè)波長(zhǎng)。提取三者的PDA光譜圖，發(fā)現(xiàn)均在324 nm左右處有最大吸收，且基線平穩(wěn)，分離度大于1.5，因此選擇324 nm檢測(cè)有機(jī)酸類成分。提取白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ的PDA光譜圖，發(fā)現(xiàn)在紫外吸收末端處有最大吸收，因此選擇221 nm檢測(cè)內(nèi)酯類成分?；旌蠈?duì)照品和樣品在324 nm和221 nm波長(zhǎng)下的色譜圖見圖7。

圖7 混合對(duì)照品溶液（A、C）和供試品溶液（B、D）的UPLC色譜圖Fig. 7 UPLC chromatograms of mixed control（A/C）and sample（B/D）

2.3.2 色譜條件 在324 nm測(cè)定新綠原酸、隱綠原酸和綠原酸；在221 nm測(cè)定白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ，余同“2.1.1”項(xiàng)指紋圖譜色譜條件。

2.3.3 配制對(duì)照品溶液 以50%甲醇為溶媒制成每1 mL含3、6、10、10、8μg的新綠原酸、隱綠原酸、綠原酸、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ的溶液。

2.3.4 配制樣品溶液 同“2.1.3”項(xiàng)樣品溶液配制方法。

2.3.5 線性關(guān)系考察 以50%甲醇為溶媒配制成每1 mL含14.562、2.602、30.153、32.012、25.392μg的新綠原酸、隱綠原酸、綠原酸、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ的儲(chǔ)備液。精密量取儲(chǔ)備液15.0、10.0、5.0和1.0 mL，分別置20 mL容量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，得系列濃度培養(yǎng)液后，按“2.3.2”項(xiàng)進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)（X，μg/mL），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，考察結(jié)果見表4。

表4 白術(shù)中5種化學(xué)成分線性關(guān)系考察結(jié)果Tab. 4 Results of linear relation of constents of AMR

2.3.6 精密度試驗(yàn) 按“2.1.3”項(xiàng)配制白術(shù)樣品（S1）溶液后，按“2.3.2”項(xiàng)連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，計(jì)算新綠原酸、隱綠原酸、綠原酸、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ含量，RSD分別為0.59%、0.62%、0.48%、0.89%和0.57%，表明儀器具有良好的精密度。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.1.3”項(xiàng)配制白術(shù)樣品（S1）溶液后，按“2.3.2”項(xiàng)在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算新綠原酸、隱綠原酸、綠原酸、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ的含量，RSD分別為0.89%、0.76%、0.59%、0.63%和0.84%，表明在24 h內(nèi)供試品溶液具有良好的穩(wěn)定性。

2.3.8 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.1.3”項(xiàng)配制白術(shù)樣品（S1）溶液后6份，按“2.3.2”項(xiàng)進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算新綠原酸、隱綠原酸、綠原酸、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ的含量，RSD分別為1.58%、1.89%、1.26%、1.67%和1.98%，表明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.3.9 加樣回收率試驗(yàn) 取白術(shù)樣品（S1）粉末6份，每份0.5 g，加入混合對(duì)照品溶液（以50%甲醇為溶媒制成每1 mL含1.728 μg、3.648 μg、7.009 μg、5.682 μg和4.082 μg的新綠原酸、隱綠原酸、綠原酸、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ的溶液）25 mL，余同按“2.1.3”項(xiàng)配制回收率樣品溶液，按“2.3.2”項(xiàng)進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各成分的回收率和RSD，見表5，回收率平均值均大于90%，RSD均小于3%，說明該方法測(cè)得的結(jié)果準(zhǔn)確。

表5 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n = 6）Tab. 5 Results of recovery standard addition（n = 6）

2.3.10 樣品測(cè)定 按“2.1.3”項(xiàng)配制16批白術(shù)樣品溶液后，按“2.3.2”項(xiàng)測(cè)定，計(jì)算其含量，見表6。

表6 16批白術(shù)中5種化學(xué)成分含量測(cè)定結(jié)果（mg/g，n = 2）Tab. 6 Determination of five chemicals of 16 batches of AMR（mg/g，n = 2）

3 討論

本試驗(yàn)考察了不同提取溶劑、提取方式、提取時(shí)間和料液比對(duì)各成分提取效率的影響，最終確定供試品溶液的制備方法為以50%甲醇按料液比1.0 g∶25 mL回流提取30 min。在指紋圖譜研究中，通過與對(duì)照品的保留時(shí)間及PDA光譜圖對(duì)比，指認(rèn)出新綠原酸、隱綠原酸、綠原酸、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸、4,5-O-二咖啡酰基奎寧酸、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ共7個(gè)成分。通過比較不同波長(zhǎng)條件下各峰的響應(yīng)值、分離度、對(duì)稱性及拖尾因子等參數(shù)，最終選擇221 nm作為指紋圖譜的檢測(cè)波長(zhǎng)。

采用UPLC法對(duì)16批白術(shù)進(jìn)行分析檢測(cè)后，通過SPSS 25.0聚類分析，結(jié)合SIMCA14.1繪圖軟件，對(duì)21個(gè)共有峰的峰面積進(jìn)行主成分分析，結(jié)果均將16批白術(shù)聚為3類，分類符合產(chǎn)地規(guī)律。主成分分析提取得到的前5個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)到88.32%，其中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ在主成分1中有明顯貢獻(xiàn)值，鑒于白術(shù)內(nèi)酯類成分為白術(shù)的主要活性成分，因此將其納入含量測(cè)定指標(biāo)中。偏最小二乘判別分析以VIP值為篩選標(biāo)準(zhǔn)得到5個(gè)差異性標(biāo)志成分，其中有3個(gè)峰被指認(rèn)出，分別為綠原酸、隱綠原酸和新綠原酸，為含量測(cè)定指標(biāo)的選擇提供參考。

4 結(jié)論

本研究通過化學(xué)計(jì)量學(xué)結(jié)合超高效液相色譜法的分析方式，對(duì)白術(shù)的質(zhì)量控制提供了一種評(píng)價(jià)思路，該方法表明白術(shù)質(zhì)量與產(chǎn)地之間具有一定的相關(guān)性。本次研究收集的白術(shù)藥材有一年生和兩年生區(qū)別，但通過以上試驗(yàn)分析并未發(fā)現(xiàn)不同生長(zhǎng)年限的白術(shù)質(zhì)量存在差異，對(duì)于白術(shù)生長(zhǎng)年限的研究或可以通過增大樣本量、收集更長(zhǎng)生長(zhǎng)時(shí)間的白術(shù)藥材加以研究，以期為白術(shù)質(zhì)量控制和臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。