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    Box-Behnken Design-響應(yīng)面法優(yōu)化綠原酸轉(zhuǎn)化為新綠原酸的工藝研究*

    2017-10-26 08:25:26溫建輝倪付勇王雪晶宋亞玲王振中
    關(guān)鍵詞:原酸綠原反應(yīng)時間

    溫建輝,倪付勇,王雪晶,李 明,宋亞玲,王振中,蕭 偉

    (江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司 連云港 222000)

    Box-Behnken Design-響應(yīng)面法優(yōu)化綠原酸轉(zhuǎn)化為新綠原酸的工藝研究*

    溫建輝,倪付勇,王雪晶,李 明,宋亞玲,王振中,蕭 偉**

    (江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司 連云港 222000)

    利用Box-Behnken-響應(yīng)面法優(yōu)化綠原酸轉(zhuǎn)化為新綠原酸的工藝條件。在單因素實驗基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken Design實驗設(shè)計,考察反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間及pH值對新綠原酸產(chǎn)率的影響,優(yōu)化綠原酸轉(zhuǎn)化為新綠原酸的工藝參數(shù),得到模型預(yù)測公式。優(yōu)化條件為:反應(yīng)溫度107℃,反應(yīng)時間60 min,pH值為4.72時新綠原酸產(chǎn)率為64.20%,與模型預(yù)測值接近,方程擬合良好。采用優(yōu)選工藝制備新綠原酸并精制純化,分別運(yùn)用HPLC、1H-NMR、13C-NMR、ESI-MS等方法對其進(jìn)行含量測定和結(jié)構(gòu)表征,結(jié)果表明純化后純度達(dá)98.78%,收率為87.37%。

    綠原酸 新綠原酸 Box-Behnken Design響應(yīng)面法 結(jié)構(gòu)鑒定

    圖2 綠原酸轉(zhuǎn)化為新綠原酸反應(yīng)式

    1 儀器與材料

    1.1 儀器

    分析液相:Agilent 1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司,250 mm×4.6 mm,5 μm),配自動進(jìn)樣器、四元泵、MWD檢測器,制備液相:Agilent 1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司),四元泵、MWD檢測器,制備柱(美國Agilent公司,21.2 mm×250 mm);Bruker-AV-400型核磁共振光譜儀;AE240電子分析天平(瑞士Mettler公司),實驗室PH計FE20 Plus(梅特勒-托利多儀器上海有限公司),石英三口燒瓶(廣州市精科儀器有限公司)。

    1.2 實驗材料

    綠原酸(自制,批號:130809,純度為99.14%),新綠原酸(批號MUST-10091501,純度>98%,成都曼斯特生物科技有限公司提供),甲醇(色譜純,Oceanpak,瑞典),甲酸、濃鹽酸(分析純,南京化學(xué)試劑有限公司),雙蒸水(自制)。

    2 新綠原酸的測定方法

    2.1 對照品溶液的制備

    稱取新綠原酸對照品適量,精密稱定,置棕色容量瓶中,加50%甲醇定容制成新綠原酸濃度為0.2 mg·mL-1的對照品溶液。

    2.2 供試品溶液的制備

    分別精密稱取以下各工序制備的新綠原酸粗品5.0 mg,置于25 mL容量瓶中,用50%甲醇溶解,定容至刻度即得。

    2.3 色譜條件

    2.3.1 基本條件

    色譜柱為Acuity C18(250mm×4.6mm,5μm),流動相甲醇(A)-0.5%甲酸溶液(B),流速1.0 mL·min-1。梯度洗脫條件:0-40 min,15%-50%A;40-52 min,50%-100%A。進(jìn)樣體積10 μL,柱溫30℃,檢測波長326 nm[18-20]。

    2.3.2 線性關(guān)系考察

    取新綠原酸對照品適量,精密稱定,加50%甲醇制成所需濃度的對照品溶液,作為儲備液(2.6 mg·mL-1)。取儲備液0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mL,置10 mL量瓶中,分別用50%甲醇稀釋至刻度,搖勻,分別進(jìn)樣,測定,以峰面積為縱坐標(biāo)(Y),對照品濃度(mg·mL-1)為橫坐標(biāo)(X),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得回歸方程為:Y=26.306X+0.395 4(r=1.000 0),新綠原酸在0.065-2.08 mg·mL-1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

    2.3.3 精密度試驗

    精密吸取對照品溶液10 μL,按“2.3.1”項下色譜條件,進(jìn)樣,測定,連續(xù)6次。以新綠原酸的峰面積計算,RSD為1.2%,結(jié)果表明,儀器精密度良好。

    2.3.4 穩(wěn)定性試驗

    精密吸取“2.2”項供試品溶液,分別于制備后0、2、4、6、8、10、12、24 h分別進(jìn)樣,按“2.3.1”項色譜條件測定,以新綠原酸峰面積計算,結(jié)果RSD為0.84%,結(jié)果表明供試品溶液放置24 h穩(wěn)定。

    3 單因素試驗

    新綠原酸轉(zhuǎn)化的影響因素主要有反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、pH值、溶劑濃度(甲醇)、綠原酸濃度等,通過預(yù)實驗,從轉(zhuǎn)化的角度出發(fā),將綠原酸濃度定為0.25 mg·mL-1,溶劑為50%甲醇溶液,結(jié)果顯示反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、pH值對新綠原酸含量影響較大。因此,對反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、pH值進(jìn)行設(shè)計單因素考察,每個單因素實驗平行考察三次,取含量均值作為測定結(jié)果。

    3.1 溫度對新綠原酸含量的影響

    取20 mg綠原酸用4倍量50%甲醇溶解,考察反應(yīng)時間為60 min,pH值為5.0條件下,不同的反應(yīng)溫度(90℃,100℃,110℃,120℃,130℃)對新綠原酸含量的影響。以“2.3.1”項下的條件測定當(dāng)中新綠原酸的含量,含量變化情況見圖3。結(jié)果表明,隨著溫度的升高,新綠原酸含量隨之增加,當(dāng)溫度超過110℃時,新綠原酸含量反而下降。因此,確定反應(yīng)溫度為110℃。

    圖3 反應(yīng)溫度單因素考察

    圖4 反應(yīng)時間單因素考察

    圖5 pH值單因素考察

    3.2 時間對新綠原酸含量的影響

    取20 mg綠原酸用4倍量50%甲醇溶解,考察反應(yīng)溫度為100℃,pH值為5.0條件下,不同反應(yīng)時間(30、60、90、120、150 min)對新綠原酸含量的影響。以“2.3.1”項下條件測定當(dāng)中新綠原酸的含量,含量變化情況見圖4。結(jié)果表明,隨著時間的增加,新綠原酸含量隨之增加,當(dāng)反應(yīng)時間超過60 min時,新綠原酸含量下降。因此,確定反應(yīng)時間為60 min。

    表1 響應(yīng)面實驗設(shè)計

    表2 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果

    3.3 PH值對新綠原酸含量的影響

    取20 mg綠原酸用4倍量50%甲醇溶解,考察反應(yīng)時間為60 min,反應(yīng)溫度110℃,不同的pH(3.0,4.0,5.0,6.0,7.0)對新綠原酸含量影響,以“2.3.1”項下條件測定當(dāng)中新綠原酸的含量,含量變化情況見圖5。結(jié)果表明,隨著pH值的增大,新綠原酸含量隨之增加,當(dāng)pH大值于5.0時,新綠原酸含量下降。因此,確定pH值為5.0。

    3.4 新綠原酸轉(zhuǎn)化工藝優(yōu)選

    在單因素實驗的基礎(chǔ)上應(yīng)用響應(yīng)面法對新綠原酸的轉(zhuǎn)化工藝進(jìn)行優(yōu)化,以反應(yīng)溫度(A)、反應(yīng)時間(B)、pH值(C)為考察因素,根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理,每因素設(shè)3個水平,用代碼值-1,0,1表示,因素水平見表1,實驗設(shè)計及結(jié)果見表2。以粗品中新綠原酸的含量為評價指標(biāo),采用Design-Exoect V8.0.5軟件對綜合評分結(jié)果進(jìn)行多元線性回歸和二項式方程擬合,得回歸方程:含量=62.17-4.54A-1.44B-2.51C+0.27AB+3.80AC-1.82BC-11.26A2-3.57B2-5.76C2,相關(guān)系數(shù)R2=0.969 6,說明建立的二次項模型與實驗擬合較好。由表3響應(yīng)面二次回歸方程方差分析結(jié)果所示,模型P<0.01,效應(yīng)面模型達(dá)到極顯著水平,影響新綠原酸轉(zhuǎn)化因素的主次順序為A>C>B,其中因素A反應(yīng)溫度影響極顯著(P<0.001),因素C(pH)影響顯著(P<0.05),失擬項不顯著(P>0.05),因素A和C的交互作用對新綠原酸的轉(zhuǎn)化是顯著的,表明二次方程預(yù)測值與實際值吻合度較高。方程對應(yīng)的等高線、三維效應(yīng)圖見圖6。

    表3 Box-Behnken實驗方差分析

    3.5 新綠原酸轉(zhuǎn)化工藝驗證試驗

    通過求解回歸方程得到最佳轉(zhuǎn)化工藝參數(shù)為:反應(yīng)溫度107.49℃,反應(yīng)時間58.60 min,pH值為4.72,新綠原酸含量預(yù)測值為63.19%。結(jié)合實際試實際操作,確定反應(yīng)溫度為107℃,反應(yīng)時間60 min,pH值為4.72,以該參數(shù)進(jìn)行3次驗證試驗,結(jié)果顯示,采用該工藝參數(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化,新綠原酸的含量均值為64.20%,RSD值<2%,與預(yù)測值的相對偏差為1.56%,基本與模型預(yù)測值一致,適合新綠原酸粗品的制備。新綠原酸粗品A(峰1為新綠原酸)和新綠原酸對照品B色譜圖(圖7)。

    4 新綠原酸的制備

    取綠原酸10.0g,以“3.5”項下的優(yōu)選條件進(jìn)行反應(yīng),最終得到新綠原酸粗品9.12 g,用50%的甲醇溶解,離心取上清液進(jìn)樣,以10%乙腈為流動相,流速20 mL·min-1,進(jìn)樣量 800 μL,柱溫為室溫,檢測波長326 nm,多次進(jìn)樣制備,收集液濃縮、干燥后得到新綠原酸的量為5.12 g,收率為87.37%。

    5 新綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定

    取“4”項下制備的新綠原酸樣品,按“2.3.1”項下色譜方法測定,用面積歸一化法計算,確定新綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.78%,新綠原酸樣品經(jīng)ESI-MS分析,m/z:353.090 4[M-H]-,計算相對分子量為354。

    6 結(jié)構(gòu)鑒定

    新綠原酸,白色粉末,ESI-MSm/z:353[M-H]-。1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:1.86-2.01(4H,m,H-2,H-6),3.78(1H,m,H-4),4.12(1H,m,H-3),5.21(1H,m,H-5),6.26(1H,d,J=16.0 Hz,H-8′),6.77(1H,d,J=8.0 Hz,H-5′),6.95(1H,dd,J=2.0,8.0 Hz,H-6′),7.05(1H,d,J=2.0 Hz,H-2′),7.50(1H,d,J=16.0 Hz,H-7′);13C-NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:35.1(C-2),38.6(C-6),70.3(C-3),70.6(C-4),67.3(C-5),72.6(C-1),114.5(C-2′),114.9(C-8′),115.8(C-5′),121.1(C-6′),125.7(C-1′),144.3(C-3′),144.7(C-7′),145.7(C-4′),166.3(C-9′),175.4(COOH)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報道的新綠原酸一致。

    7 總結(jié)與討論

    新綠原酸為熱毒寧注射液中有效活性成分之一,是一種咖啡酰奎寧酸類化合物,現(xiàn)代研究表明咖啡酰奎寧酸類化合物在藥物、食品、飼料添加劑以及化妝品中具有較高的潛在價值[14]。藥理實驗也表明它具有抗氧化活性、治療炎癥、抑制微生物和病毒活性、酶抑制作用等多種生物活性[21]。鑒于新綠原酸較好的藥理活性,對該化合物研究具有較大的實用價值,因此,本實驗采用Box-Behnken Design-響應(yīng)面法建立一種快速大量制備高純度的新綠原酸的方法,且通過實驗方法驗證該工藝穩(wěn)定可行,為新綠原酸的制備及其下一步藥理藥效的深入研究提供保障。

    圖6 自變量A,B,C之間交互作用與應(yīng)變量R1含量等高線、響應(yīng)面圖

    圖7 新綠原酸粗品(A)和新綠原酸對照品(B)的HPLC圖

    1 柴興云,竇靜,賀清輝,等.山銀花中酚酸類成分研究.中國天然藥物,2004,2(6):339-340.

    2 唐陸平,何蓉蓉,李怡芳,等.熱毒寧注射液對細(xì)菌內(nèi)毒素性脂多糖致熱大鼠的解熱作用研究.中國中藥雜志,2013,38(14):2374-2377.

    3 樊宏偉,李英斌,孫敏,等.金銀花中有機(jī)酸類成分抗血栓作用研究.中藥藥理與臨床,2007,23(3):34-36.

    4 邱葵,劉宇紅,孔繁翠,等.金銀花體外抗結(jié)核活性研究.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2009,11(6):876-879.

    5 湯喜蘭,劉建勛,李磊.中藥有機(jī)酸類成分的藥理作用及在心血管疾病的應(yīng)用.中國實驗方劑學(xué),2012,18(5):243-246.

    6 李石平,王志鑫,顧睿,等.金銀花中抗手足口病HEV71活性成分的虛擬篩選.中藥藥理與臨床,2015,31(3):67-70.

    7 宋亞玲,王紅梅,倪付勇,等.金銀花中酚酸類成分及其抗炎活性研究.中草藥,2015,46(4):490-495.

    8 倪付勇,劉露,宋亞玲,等.金銀花中抗補(bǔ)體活性酚酸類成分的研究.中國中藥雜志,2015,40(2):269-274.

    9 孫蘭,劉艾林,王振中,等.熱毒寧注射液及其組分對流感病毒神經(jīng)氨酶的抑制作用研究.現(xiàn)代藥物與臨床,2014,29(1):27-31.

    10張露,陳豆弟.綠原酸提取工藝研究進(jìn)展.杭州化工,2012,43(4):4-6.

    11閆巧娟,韓魯佳,江正強(qiáng),等.金銀花中綠原酸提取純化工藝的優(yōu)化.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2002,7(2):22-26.

    12張運(yùn)典,陳玉海.金銀花中綠原酸取工藝研究.中成藥,2013,35(7):1564-4566.

    13高紅宇,金萬勤,郭立瑋.不同精致工藝對金銀花水提液中綠原酸含量的影響.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2010,12(2):241-244.

    14 Dawidowicz A L,Typek R.Thermal stability of 5-O-caffeoylquinic acid in aqueous solutions at different heating conditions.J Agric Food Chem,2010,58(24):12578-12584.

    15 Dawidowicz A L,Typek R.The influence of PH on the thermal stability of 5-O-caffeoylquinic acid in aqueous solutions.Eur Food Res Technol,2011,233(2):223-232.

    16 Dawidowicz A L,Typek R.Formation of ester and amine derivatives of 5-O-caffeoylquinic acid in the process of its simulated extraction.J Agric Food Chem,2012,60(50):12289-12295.

    17 Dawidowicz A L,Typek R.Thermal transformation oftrans-5-O-caffeoylquinic acid(trans-5-CQA)in alcoholic solutions.Food Chem,2015,167:52-60.

    18朱粉霞,賈曉斌,李秀峰,等.UPLC法同時測定膽木注射液中原兒茶酸、新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸.中草藥,2013,44(5):571-573.

    19畢宇安,王振中,宋愛華,等.熱毒寧注射液高效液相色譜指紋圖譜研究及多成分定量分析.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2010,12(2):298-303.

    20倪付勇,宋亞玲,劉露,等.中低壓制備色譜制備新綠原酸對照品的研究.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2015,17(9):1818-1822.

    21趙昱,趙軍,李湘萍,等.咖啡奎尼酸類化合物研究進(jìn)展.中國中藥雜志,2006,31(11):869-874.

    Optimization on Transformation from ChlorogenicAcid to NeochlorogenicAcid by Box-Behnken Design-response Surface Methodology

    Wen Jianhui,Ni Fuyong,Wang Xuejing,Li Ming,Song Yaling,Wang Zhenzhong,Xiao Wei
    (Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co.Ltd.,Lianyungang 222000,China)

    Box-Behnken design-response surface methodology was used to optimize the transformation from chlorogenic acid to neochlorogenic acid.Based on single factor experiments,the experiment design were developed by box-benhnhen central composite design with causal factors of the reaction temperature,time and PH to neochlorogenic acid.The optimum transformation conditions were as follow:reaction temperature at 107°C,reaction time of 60 min,the PH of 4.72.Under the optimum extraction technology conditions,the productivity of neochlorogenic acid was 64.20%.Neochlorogenic acid was isolated and purified.The determination and characterization of neochlorogenic acid was detected by HPLC,1H-NMR,13C-NMR and ESI-MS.The results showed that the content of neochlorogenic acid reached to 98.78%and the yield of 87.37%.

    Chlorogenic acid,neochlorogenic acid,Box-Behnken design-response surface methodology,structural identification

    10.11842/wst.2017.07.026

    R284.1

    A

    新綠原酸為單咖啡酰奎寧酸類化合物,是由咖啡酸的1位和奎寧酸的5位通過酯化反應(yīng)而形成的天然化合物(結(jié)構(gòu)式見圖1),在植物界中分布廣泛,為最常見的單咖啡??鼘幩犷惢衔镏?。具有抗菌解熱[1-2]、抗血栓[3]、體外抗結(jié)核活性[4],抗炎、抗氧化、對心血管疾病的作用、抑制血小板聚集[5]等藥理作用。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),新綠原酸在活性虛擬篩選中與靶蛋白HEV71的結(jié)合能為-9.2kcal/mol,具有一定的抑制手足口HEV71病毒活性[6];在抗炎作用方面,新綠原酸對LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞炎癥因子具有一定的抑制作用[7];在抗補(bǔ)體經(jīng)典途徑試驗中,新綠原酸的活性要優(yōu)于陽性藥肝素[8];另外,新綠原酸作為熱毒寧注射液有機(jī)酸的活性成分之一,對H1N1、H3N2、B流感病毒神經(jīng)氨酸酶表現(xiàn)出良好的抑制作用[9]。

    目前,新綠原酸尚無化學(xué)合成方法,均從植物中分離純化得到,但是由于其含量在植物中較低,若要獲得大量的高純度的新綠原酸單體,需要提取大量的藥材后利用不同的分離材料對該化合物富集、分離和純化,工序繁瑣,且藥材和試劑消耗量大。綠原酸為新綠原酸的同分異構(gòu)體,在植物中含量高且制備工藝非常成熟[10-13],有研究發(fā)現(xiàn)綠原酸在一定條件下可以轉(zhuǎn)化為新綠原酸及其它綠原酸類衍生物[14-17],影響其轉(zhuǎn)化的主要因素有:反應(yīng)時間、pH值、反應(yīng)溫度。鑒于此,本文擬通過Box-Behnken-響應(yīng)面法優(yōu)化綠原酸轉(zhuǎn)化為新綠原酸的最佳條件,為新綠原酸的規(guī)模制備提供參考(圖2)。

    圖1 新綠原酸結(jié)構(gòu)式

    2015-11-05

    修回日期:2016-03-22

    * 科學(xué)技術(shù)部國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(2013ZX09402203):現(xiàn)代中藥創(chuàng)新集群與數(shù)字制藥技術(shù)平臺,負(fù)責(zé)人:王振中。

    ** 通訊作者:蕭偉,本刊編委,博士,研究員級高級工程師,主要研究方向:中藥新藥的研究與開發(fā)。

    (責(zé)任編輯:馬雅靜,責(zé)任譯審:王 晶)

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