HPLC法同時(shí)測(cè)定野馬追藥材中綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸的含量

楊 琴，包宜康，顧亞琴，郭 昀，吳小峰，酈紅巖

(1.江蘇中興藥業(yè)有限公司，江蘇鎮(zhèn)江，212009;2.江蘇吉貝爾藥業(yè)股份有限公司，江蘇鎮(zhèn)江，212009)

野馬追為菊科植物輪葉澤蘭Eupatorium lindleyanum DC.的干燥地上部分，味苦，性平，歸肺經(jīng)，具有化痰止咳平喘之功效，常用于治療痰多咳嗽氣喘等癥［1］?，F(xiàn)代研究表明野馬追中主要含有黃酮類、生物堿類、揮發(fā)油類、香豆類素、有機(jī)酸類及多種微量元素等化學(xué)成分［2－4］。目前對(duì)野馬追的研究主要集中在黃酮、生物堿等大類［5－6］，而對(duì)有機(jī)酸類成分的研究較少，文章在前期研究的基礎(chǔ)上，參考相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)野馬追藥材中綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸三種有機(jī)酸類成分進(jìn)行了定量檢測(cè)，為野馬追的質(zhì)量控制及后續(xù)研究開發(fā)等奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HPLC(LC－20A系統(tǒng)、SPD－20A檢測(cè)器，島津株式會(huì)社);N2000色譜工作站(浙大智達(dá));BAS124S電子天平(德國(guó)Satorius);HH恒溫水浴鍋(金壇中大儀器廠)。

1.2 材料

綠原酸對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，供含量測(cè)定用，批號(hào):110753－201415)、新綠原酸、隱綠原酸對(duì)照品(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào):PA0819RA13、2F0226BA14)，色譜級(jí)乙腈(德國(guó)MERCK)，水為公司自制注射用水，其余試劑均為分析純。

野馬追藥材原產(chǎn)地江蘇盱眙，由亳州吉貝爾現(xiàn)代中藥飲片科技有限公司提供，經(jīng)江蘇吉貝爾藥業(yè)股份有限公司魏福榮高級(jí)工程師鑒定為野馬追。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Phenomenex C18(250×4.6mm，5μm);流動(dòng)相:乙腈—0.2%醋酸水溶液(11 ∶89);檢測(cè)波長(zhǎng):327nm;柱溫:30℃;流速:1.0mL/min;進(jìn)樣 20μL，理論板數(shù)按綠原酸峰計(jì)算應(yīng)不低于2500。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

稱取三種對(duì)照品適量，精密稱定，加流動(dòng)相制成每1mL分別含新綠原酸0.82mg、綠原酸0.68mg、隱綠原酸 0.58mg 的混合溶液，作儲(chǔ)備液備用。

2.2.2 供試品溶液的制備

將野馬追藥材粉碎，過篩，精密稱取1.0g，加50mL石油醚提取以除色素或一些小分子化合物，揮干石油醚，藥渣加純化水20mL，水浴回流2次，每次0.5小時(shí)，濾過，合并兩次濾液，置50mL量瓶中，加流動(dòng)相定容至刻度，搖勻即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 方法專屬性

按“2.1色譜條件”下進(jìn)樣分析，得對(duì)照品溶液與供試品溶液的色譜圖如圖1所示，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸在此條件下分離度良好。

圖1 對(duì)照品及供試品溶液色譜圖(A－對(duì)照品溶液;B－供試品溶液;1.新綠原酸2.綠原酸3.隱綠原酸)Fig.1 The chromatogram of the reference solution and the test solution(A－Reference solution;B－Test solution;1.Neochlorogenic acid 2.Chlorogenic acid 3.Cryptochlorogenic acid)

2.3.2 線性關(guān)系的考察

分別精密吸取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的儲(chǔ)備對(duì)照品溶液0.25、0.5、1、3、5mL至10mL量瓶中，制成新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸濃度分級(jí)為0.0205、0.041、0.082、0.246、0.41mg/mL，0.017、0.034、0.068、0.204、0.34mg/mL 及 0.0145、0.029、0.058、0.174、0.29mg/mL的系列對(duì)照品溶液，按“2.1色譜條件”操作進(jìn)樣分析，以峰面積(Y)對(duì)進(jìn)樣量(μg)(X)進(jìn)行線性回歸，得三種成分的回歸方程依次分別為 Y=13821X+18.17(r=0.9999)，Y=17675X+10.914(r=0.9993)，Y=15157X+13.241(r=0.9999)，且新綠原酸、綠原酸及隱綠原酸分別在 0.41～8.2μg、0.34～6.8μg、0.29～5.8μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度試驗(yàn)

精密吸取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸濃度分別為 0.082 mg/mL、0.068 mg/mL、0.058mg/mL的混合對(duì)照品溶液20μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的RSD分別為0.87%、1.15%、1.04%，表明精密度良好。

2.3.4穩(wěn)定性試驗(yàn)

稱取野馬追藥材適量，按“2.2.2供試品溶液的制備”下制備供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12、24小時(shí)測(cè)定峰面積，記錄峰面積，得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的峰面積RSD分別為1.36%、0.93%、1.25%，表明供試品在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取野馬追藥材6份，精密稱定，按“2.2.2供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，結(jié)果得供試品中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸平均含量分別為2.815mg/g、3.381mg/g、2.972mg/g，含量RSD分別為1.21%、1.06%、1.18%。

2.3.6 加樣回收率測(cè)定

取已知含量的野馬追藥材6份，每份約0.5g，精密稱定，加入2mL重新配制新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸對(duì)照品溶液的濃度分別為0.7113mg/mL、0.8476mg/mL、0.7511mg/mL的混合對(duì)照品溶液，按“2.2.2供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.1色譜條件”下方法進(jìn)樣分析，得供試品溶液中各成分的回收率如表2所示。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 2 Results of recovery test(n=6)

2.4 樣品測(cè)定

分別稱取不同批次的野馬追藥材1g，精密稱定，按“2.2.2供試品溶液的制備”項(xiàng)下操作，并按“2.1色譜條件”下方法進(jìn)樣分析，得不同批次的野馬追藥材中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的含量數(shù)據(jù)見表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination results of contents in samples

3 討論

在前期的實(shí)驗(yàn)考察中，將綠原酸、新綠原酸和隱綠原酸分別配制一定濃度的對(duì)照品溶液進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)綠原酸、新綠原酸和隱綠原酸均在208nm和327nm左右處有最大吸收峰，而后分別選擇208nm和327nm進(jìn)行綠原酸、新綠原酸和隱綠原酸混合對(duì)照品的HPLC檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在208nm波長(zhǎng)處檢測(cè)時(shí)，雜峰較多，綠原酸、新綠原酸和隱綠原酸分離度較差，干擾其含量的測(cè)定，而在327nm處綠原酸、新綠原酸和隱綠原酸分離度良好，測(cè)定無其他成分干擾，故最終選擇327nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

中藥材及中藥制劑中同時(shí)測(cè)定的新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸含量的報(bào)道相對(duì)較多［7－10］，但大多采用的洗脫方法較為復(fù)雜(梯度或分段變波長(zhǎng))，筆者通過前期方法考察，篩選乙腈－水系統(tǒng)等度洗脫來進(jìn)行含量測(cè)定，方法具有良好的精密度與穩(wěn)定性，能夠較好地滿足實(shí)驗(yàn)測(cè)定要求。

本研究工作中，初步選擇甲醇－水系統(tǒng)和乙腈－水系統(tǒng)分別對(duì)野馬追供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)采用乙腈－水系統(tǒng)各成分的分離度及基線的平穩(wěn)性均優(yōu)于甲醇－水系統(tǒng)，故初步選擇乙腈－水系統(tǒng)作為流動(dòng)相，同時(shí)加入了醋酸進(jìn)一步調(diào)整峰型，最終在乙腈－0.2%醋酸水(11:89)的條件下，各成分分離度、出峰時(shí)間及峰型均較好。

筆者在研究過程中分別進(jìn)行了水、甲醇、乙醇、50%乙醇等不同提取溶劑，加熱回流和超聲提取等不同的提取方法，以及在0.5、1、1.5h的不同提取時(shí)間對(duì)提取成分的影響，由于綠原酸類成分的特殊結(jié)構(gòu)，使用甲醇、乙醇、50%乙醇等溶劑提取時(shí)，提取出得成分較多，各目標(biāo)峰之間很難達(dá)到基線分離，且相互間有干擾。由于其在熱水中的溶解度大于甲醇、乙醇中的溶解度，因此確定先用石油醚脫脂處理，再用純化水回流提取2次，每次0.5小時(shí)，以保證有效成分能提取完全，且避免長(zhǎng)時(shí)間的高溫?fù)p壞。

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