一測(cè)多評(píng)法在肺寧口服液品質(zhì)評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

徐 云 ，于艷輝 ，牟 榮 ，王寶成 ，蘇小紅，肖俊美 ，徐 建

（1.吉林修正藥業(yè)新藥開發(fā)有限公司，吉林省中藥標(biāo)準(zhǔn)化關(guān)鍵工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春130103；2.吉林省藥品審評(píng)中心，長(zhǎng)春130000;3.通藥制藥集團(tuán)股份有限公司，通化134000）

肺寧口服液由返魂草的單方制劑。其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn) WS3-083-（Z-017）2005Z，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅包含薄層鑒別及高效液相色譜法綠原酸含量測(cè)定，檢測(cè)成分單一。尚未有關(guān)于肺寧口服液綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸含量測(cè)定的方法報(bào)道，故建立高效液相色譜法對(duì)此3種成分同時(shí)測(cè)定的方法。并采用一測(cè)多評(píng)法（QAMS）與外標(biāo)法同時(shí)測(cè)定11批樣品進(jìn)行對(duì)比研究。將一測(cè)多評(píng)法應(yīng)用于產(chǎn)品的品質(zhì)評(píng)價(jià)中，方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可行，也為其他肺寧制劑的品質(zhì)評(píng)價(jià)方法建立提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Angilent 1200高效液相色譜儀；Ultimate 3000高效液相色譜儀；梅特勒MS205DU型分析天平；梅特勒TOLEDO XPR2型百萬(wàn)分之一分析天平；SB25-12DT型超聲波清洗器。

1.2 試劑與試藥

乙腈為色譜純；甲醇、甲酸、磷酸等均為分析純；水為純化水。

1.3 對(duì)照品與樣品

綠原酸（110753-201817，純度：96.8%）從中國(guó)食品藥品檢定研究院購(gòu)入；新綠原酸（HNO21137198，純度 98%）、隱綠原酸（HCO2134198，純度 98%）、均從Herbest購(gòu)入；肺寧口服液 （190309批、191202批、191203批、191204批、191205批、191206批、191207批、191208批、191209批、191210批、191211批），均由通藥制藥集團(tuán)股份有限公司提供。

2 方法[1～3]

2.1 色譜條件

采用Agilent ZORBAX SB C18色譜柱 （柱長(zhǎng)為250 mm，內(nèi)徑為4.6 mm粒徑5μm)；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.2%甲酸溶液為流動(dòng)相B，按下表中規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為325 nm；柱溫為35℃，流速0.8 ml/min。理論板數(shù)按綠原酸峰計(jì)算應(yīng)不低于5000，詳見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相洗脫條件

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱定綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸適量，加甲醇制成濃度分別為含新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的混合溶液，作為儲(chǔ)備液。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液1 ml，置于10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液制備

精密量取本品2ml，置于25 ml容量瓶中，加70%甲醇20ml，超聲20分鐘，放冷，加70%甲醇定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)

2.4.1 專屬性試驗(yàn)

2.4.1.1空白輔料溶液的制備

按處方制備輔料及用量，制備輔料空白樣品，再按照2.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法，制備空白輔料溶液。

2.4.1.2分別精密吸取空白輔料溶液、空白溶劑（70%甲醇）、供試品溶液、混合對(duì)照品溶液（2.2項(xiàng)下）各10 μl，注入液相色譜儀，對(duì)比HPLC圖?？疾旆椒▽傩浴？瞻纵o料及空白溶劑均無(wú)干擾，結(jié)果表明專屬性良好。詳見(jiàn)圖1。

圖1 專屬性HPLC圖

2.4.2 線性與范圍

取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸混合對(duì)照品（濃度依 次為 0.2915 mg/ml、0.2896 mg/ml、0.2645 mg/ml），分別稀釋 2、5、10、20、50 倍。作為對(duì)照品溶液，精密吸取上述對(duì)照品溶液各5μl，注入液相色譜儀測(cè)定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別求出新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的回歸方程和r值。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 HPLC線性回歸方程及線性范圍的測(cè)定結(jié)果

2.4.3 精密度試驗(yàn)

取2.4.2項(xiàng)下稀釋10倍的對(duì)照品溶液，在2.1項(xiàng)下色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣體積5μl，測(cè)定新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的峰面積，計(jì)算RSD值。RSD值分別為0.94%、1.09%、1.07%。表明儀器精密度良好。

2.4.4穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液（批號(hào)：190309批），按照2.1項(xiàng)下色譜條件分別在 0、5、10、15、20、25 小時(shí)進(jìn)樣，記錄新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸峰面積，分別考察其在溶液中的穩(wěn)定性。計(jì)算新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的RSD分別為0.21%、0.29%、0.34%。表明供試品溶液在25小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn)

精密量取本品（批號(hào)：190309）2ml，共 6 份，按 2.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，按2.1色譜條件測(cè)定其含量，計(jì)算新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的平均含量分別為 0.47 mg/ml、0.30 mg/ml、0.33 mg/ml及 RSD 分別為0.19%、0.18%、0.18%。結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.4.6 回收率試驗(yàn)

精密量取已知含量樣品（批號(hào)：190309批，含新綠原酸0.47 mg/ml、綠原酸0.37 mg/ml、隱綠原酸0.33 mg/ml）1ml，共 6 份，分別置于 25 ml量瓶中，精密加入混合對(duì)照品溶液 （濃度為新綠原酸0.4869 mg/ml、綠原酸 0.3489 mg/ml、隱綠原酸 0.3352 mg/ml）1ml，精密加入20 ml 70%甲醇溶液，超聲10分鐘，放冷，加70%甲醇溶液至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液測(cè)定含量，計(jì)算新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸回收率，結(jié)果分別為 100.7%～104.6%、95.0%～100.8%、95.7%～101.1%。RSD均小于3%，方法準(zhǔn)確度良好。

2.5 相對(duì)校正因子的重現(xiàn)性考察[4～6]

取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸混合對(duì)照品（濃度依次為 0.2915 mg/ml、0.2896 mg/ml、0.2645 mg/ml），分別稀釋5倍（對(duì)照溶液1）、10倍（對(duì)照溶液2）、20倍（對(duì)照溶液3）、50倍（對(duì)照溶液4）。按照2.1項(xiàng)下色譜條件，依法測(cè)定。分別考察在不同儀器 （戴安U-3000高效液相色譜儀器、安捷倫1200高效液相色譜儀） 不同色譜柱 （Aglient ZORBAX SB-C18（4.6 mm*250 mm，5 μm）、Kromasil 100-5-C18（4.6 mm*250 mm，5 μm）)的峰面積，并計(jì)算新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的相對(duì)校正因子。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 相對(duì)校正因子重現(xiàn)性

結(jié)果f綠/新平均值=1.268 f綠/隱平均值=1.220

2.6 新綠原酸與隱綠原酸的定位

根據(jù)重復(fù)性試驗(yàn)及校正因子重現(xiàn)性考察試驗(yàn)結(jié)果，記錄其新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的保留時(shí)間，計(jì)算新綠原酸、隱綠原酸與綠原酸的相對(duì)保留時(shí)間分別為0.64、1.084。不同儀器及色譜柱之間相對(duì)保留時(shí)間波動(dòng)較小，RSD值分別為0.34%、0.21%?？刹捎孟鄬?duì)保留時(shí)間法對(duì)新綠原酸及隱綠原酸進(jìn)行定位。

2.7 一測(cè)多評(píng)測(cè)法與外標(biāo)法比較[7～10]

取11批肺寧口服液及10批中間體，按2.3項(xiàng)下制備供試品溶液，以一測(cè)多評(píng)法和常規(guī)外標(biāo)法進(jìn)行新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸含量測(cè)定比較，并將含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行T檢驗(yàn)分析。外標(biāo)法與一測(cè)多評(píng)法測(cè)得的新綠原酸P值為0.893，隱綠原酸的P值為0.926，P＞0.05，說(shuō)明兩種方法之間無(wú)顯著性差異。進(jìn)一步驗(yàn)證一測(cè)多評(píng)法用于新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

色譜條件篩選時(shí)，分別考察不同濃度的磷酸、甲酸，結(jié)果0.2%的甲酸峰型最好。且對(duì)不同儀器及不同色譜柱進(jìn)行重現(xiàn)性考察。分別考察在不同儀器 （戴安U-3000高效液相色譜儀器、安捷倫1200高效液相色譜儀）不同色譜柱 （Aglient ZORBAX SB-C18（4.6 mm*250 mm，5 μm）、Kromasil 100-5-C18（4.6 mm*250 mm，5μm）)相對(duì)校正因子具有較好的重現(xiàn)性。根據(jù)后續(xù)試驗(yàn)相對(duì)保留時(shí)間數(shù)據(jù)積累，待進(jìn)一步規(guī)定其相對(duì)保留時(shí)間及SD值，更加準(zhǔn)確的測(cè)定其含量。

通過(guò)前期對(duì)返魂草藥材的指紋圖譜研究，其新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸3中酚酸類成分含量較高，且通過(guò)前期對(duì)返魂草藥材及肺寧制劑的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究，綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸是止咳、抗炎作用的主要藥效成分，綠原酸對(duì)照品易得，采用一個(gè)對(duì)照品來(lái)評(píng)價(jià)多個(gè)成分，節(jié)約成本，對(duì)返魂草及返魂草制劑的品質(zhì)評(píng)價(jià)及標(biāo)準(zhǔn)提升提供參考。