紫色紅曲霉固態(tài)發(fā)酵三七渣生產(chǎn)紅色素的動力學(xué)研究

譚顯東，吉栗漫，黃 凡，陳 楠

（成都信息工程大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，四川 成都 610225）

隨著人們生活水平的不斷提高，健康飲食也越發(fā)受到關(guān)注。作為一種天然色素，紅色素具有抗炎、抗癌、預(yù)防和治療糖尿病、調(diào)節(jié)膽固醇等功效[1]，與人工合成的色素相比，紅色素具有“天然、營養(yǎng)、多功能”等優(yōu)點，符合人們對食品著色的健康環(huán)保要求，市場需求量較大。三七渣是傳統(tǒng)中藥三七經(jīng)提取皂苷等有效成分后的殘余物，富含淀粉、蛋白質(zhì)、多糖等營養(yǎng)元素，適合作為發(fā)酵基質(zhì)使用。采用紫色紅曲霉固態(tài)發(fā)酵三七渣生產(chǎn)紅色素，不僅可以實現(xiàn)三七渣的資源化利用、減少固體廢棄物污染，還能降低生產(chǎn)成本。發(fā)酵動力學(xué)的主要任務(wù)是研究微生物生長、基質(zhì)消耗以及產(chǎn)物生成之間的動態(tài)定量關(guān)系[2-3]，通過發(fā)酵動力學(xué)的研究，有助于深入了解微生物的生長代謝規(guī)律、建立合理的發(fā)酵工藝或?qū)σ延械陌l(fā)酵過程進(jìn)行優(yōu)化[4]。由于固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)成分不均勻且缺乏自由水，再加上固體顆粒傳導(dǎo)性較差，因此，對發(fā)酵過程的生物量、pH值、溫度等培養(yǎng)參數(shù)的控制難度較大[5]，相應(yīng)的微生物生長動力學(xué)及傳質(zhì)模型研究較少，制約了固態(tài)發(fā)酵生物反應(yīng)器的可控操作[6]。本研究通過分析紫色紅曲霉固態(tài)發(fā)酵三七渣生產(chǎn)紅色素過程中相關(guān)參數(shù)隨發(fā)酵時間的變化情況，考察了紫色紅曲霉新陳代謝活動的固有反應(yīng)速率，并建立了微生物生長動力學(xué)、基質(zhì)消耗動力學(xué)以及產(chǎn)物生成動力學(xué)模型，以期為反應(yīng)器放大設(shè)計和工業(yè)化應(yīng)用提供基礎(chǔ)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫色紅曲霉（Monascus purpureus）（SICC3.19）：四川省微生物資源平臺菌種保藏中心；三七渣：成都市某制藥廠，經(jīng)晾曬后置于熱風(fēng)循環(huán)烘箱中80 ℃干燥72 h后粉碎、過篩，置于干燥器中備用，該藥渣主要成分為粗淀粉33.13%，粗蛋白12.28%，真蛋白9.97%，還原糖1.37%[7]。

磷酸氫二鉀、三氯乙酸、羧甲基纖維素鈉、冰乙酸、乙酸鈉、蒽酮、高氯酸、無水乙醇、乙酸鉛、苯酚、亞硫酸氫鈉、石油醚、酒石酸鉀鈉、3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid,DNS）（均為分析純）：成都市科隆化學(xué)品有限公司。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：取20.0 g新鮮土豆、2.0 g葡萄糖、2.0 g瓊脂粉與100 mL蒸餾水混合制備PDA培養(yǎng)基，121 ℃滅菌30 min；種子液培養(yǎng)基：6.0 g葡萄糖、2.0 g蛋白胨、1.0 g硝酸鈉、0.5 g MgSO4·7H2O、1.0 g KH2PO4，蒸餾水100 mL，pH 自然，121 ℃滅菌30 min；三七渣固體培養(yǎng)基：取10.00 g三七渣，0.03 g蛋白胨、0.02 g KH2PO4，加入適量蒸餾水，調(diào)整培養(yǎng)基初始水含量為65.17%，pH值自然，121 ℃滅菌40 min。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2550紫外可見分光光度計：日本SHIMADZU公司；PYX-280H-C恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱：廣東韶關(guān)科力實驗儀器有限公司；LDZX-50KB高壓滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；SF-130中藥分析研磨機(jī)：長沙中南制藥機(jī)械廠；QYC-211水浴恒溫振蕩器：上海福瑪實驗設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子液的制備

用打孔器在PDA培養(yǎng)基的邊緣取0.5 cm2的紅曲霉菌絲塊，將其接入盛有100 mL種子液培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，置于恒溫振蕩器中，在150 r/min、30 ℃條件下培養(yǎng)5 d。

1.3.2 發(fā)酵動力學(xué)實驗

取120個250 mL錐形瓶，每個錐形瓶中分別裝入三七渣固體培養(yǎng)基，121 ℃滅菌30 min，冷卻后接入150 mL/kg的紫色紅曲霉種子液，30 ℃恒溫發(fā)酵培養(yǎng)20 d。發(fā)酵培養(yǎng)期間，每天取出6個錐形瓶，從其中3個錐形瓶中分別取1.0 g發(fā)酵培養(yǎng)物（濕物料）用于測定pH值，然后將這3個錐形瓶中剩余的發(fā)酵培養(yǎng)物在60 ℃條件下烘干至質(zhì)量恒定，粉碎過60目篩后用于淀粉含量、生物量的測試，將其余3個錐形瓶中的發(fā)酵培養(yǎng)物在60 ℃條件下烘干至質(zhì)量恒定，粉碎過60目篩后用于紅色素、還原糖和總糖含量的測試。每個實驗結(jié)果均為3個平行樣測定結(jié)果的均值。

1.3.3 測定方法

紅色素的測定：準(zhǔn)確稱取1.00 g發(fā)酵培養(yǎng)物置于250 mL帶塞錐形瓶中，加入50 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，60 ℃水浴提取60 min，于波長500 nm處測定其吸光度值[8]。

生物量的測定：按照參考文獻(xiàn)[9]的方法測定，通過測定的核酸量來反映生物量。

pH值的測定：稱取1.00 g發(fā)酵濕物料，加入50 mL蒸餾水，攪拌均勻后靜置20 min，用PHS-3C型精密pH計測定其pH值。

淀粉的測定：采用酸水解法[10]。

總糖和還原糖的測定：采用3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）法[11]。

1.3.4 菌體生長動力學(xué)模型建立

目前，固態(tài)發(fā)酵系統(tǒng)大多數(shù)采用線性、指數(shù)和對數(shù)方程研究其動力學(xué)，線性方程和指數(shù)方程是將微生物生長曲線分為不同階段，并針對不同的生長階段采用不同的方程進(jìn)行描述，而對數(shù)方程的數(shù)學(xué)表達(dá)式比較簡單，用一個方程式就可以近似表示包括適應(yīng)期、對數(shù)期和穩(wěn)定期在內(nèi)的生長曲線，所以使用也最廣[5，12-17]。本研究采用Origin9.0軟件內(nèi)置的非線性方程Slogistic 3（公式1）對發(fā)酵培養(yǎng)物中紫色紅曲霉生物量隨發(fā)酵時間變化的實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。紫色紅曲霉生物量計算公式如下：

式中：X為t時刻紫色紅曲霉生物量，g/g發(fā)酵培養(yǎng)物；X0為0時刻的生物量，g/g發(fā)酵培養(yǎng)物；Xm為最大生物量，g/g發(fā)酵培養(yǎng)物；t為發(fā)酵時間，d；α為比增長速率常數(shù)，d-1。

1.3.5 產(chǎn)物生成動力學(xué)模型

微生物產(chǎn)物形成的動力學(xué)模型一般可分為生長偶聯(lián)型（或稱伴隨生長的產(chǎn)物形成模型）、部分生長偶聯(lián)型（或稱不完全伴隨生長的產(chǎn)物形成模型）、非生長偶聯(lián)型（或稱不伴隨生長的產(chǎn)物形成模型）三種。以前文獻(xiàn)大多采用Luedeking-Piret方程研究真菌細(xì)胞生長和產(chǎn)物形成的過程[18-19]。由于紅色素的動態(tài)變化呈“S”形曲線，因此，本研究嘗試采用Origin 9.0軟件內(nèi)置的非線性方程Boltzmann（公式2）對發(fā)酵培養(yǎng)物中紅色素色價隨時間變化的實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。紅色素色價計算公式如下：

式中：t為發(fā)酵時間，d；B1為t=0時發(fā)酵培養(yǎng)物中紅色素色價，U/g；B2為發(fā)酵培養(yǎng)物中紅色素色價最大值，U/g；t0為發(fā)酵培養(yǎng)物中紅色素色價增加到最大值一半時所需要的時間，d；t為發(fā)酵時間，d；α為兩條漸近線的差值和拐點處“S”形曲線切線斜率比值的1/4，反映了紅色素的合成速率。

1.3.6 基質(zhì)降解動力學(xué)模型

本研究采用Origin 9.0軟件里的四參數(shù)對數(shù)模型對發(fā)酵培養(yǎng)物中總糖含量隨時間變化的實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合?？偺呛坑嬎愎饺缦拢?/p>

式中：D為t時刻發(fā)酵培養(yǎng)物中總糖含量，%；t為發(fā)酵時間，d；D2為發(fā)酵末期（t=20 d）發(fā)酵培養(yǎng)物中總糖含量，%；D1為發(fā)酵初期（t=0 d）發(fā)酵培養(yǎng)物中總糖含量，%；t50%表示以D2為基準(zhǔn)的總糖消耗半衰期，d；q為無量綱常數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫色紅曲霉生物量、紅色素色價、發(fā)酵培養(yǎng)物pH值的動態(tài)變化

發(fā)酵過程中紫色紅曲霉生物量、紅色素色價、發(fā)酵培養(yǎng)物pH值的動態(tài)變化見圖1。

圖1 發(fā)酵過程中生物量、紅色素色價、發(fā)酵培養(yǎng)物pH值的動態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes of biomass,color value of red pigments and pH of fermentation culture during fermentation

由圖1可以看出，發(fā)酵過程中生物量、紅色素色價、發(fā)酵培養(yǎng)物的pH值的動態(tài)變化趨勢整體相似，都是在發(fā)酵初期變化平緩，幾天以后快速增長，在到達(dá)峰值后又基本維持穩(wěn)定，呈“S”型曲線：發(fā)酵前2 d是適應(yīng)期，然后是對數(shù)生長期，第6天開始進(jìn)入了穩(wěn)定期，這與普通微生物生長周期的變化規(guī)律一致，而且生物量與紅色素色價基本上同時到達(dá)峰值，可以認(rèn)為菌體生長與代謝產(chǎn)物生成具有偶聯(lián)性，馬超[20]采用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建立紅曲霉固態(tài)發(fā)酵過程中生物量、總糖含量、紅曲色素含量的發(fā)酵動力學(xué)模型，與本研究結(jié)果基本一致。顧玉梅等[21]以玉米淀粉和谷氨酸單鈉鹽為主要成分通過紅曲霉9903進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)紅色素及桔霉素，發(fā)現(xiàn)色素的生產(chǎn)與菌體生長有一定的偶聯(lián)關(guān)系。但其他一些研究結(jié)果卻有所不同：如程新等[14]在采用紅曲霉JR搖瓶分批補(bǔ)料發(fā)酵動力學(xué)模型的研究中發(fā)現(xiàn)，紅曲色素發(fā)酵屬于部分生長偶聯(lián)型。邵偉等[18]在紅曲霉分批發(fā)酵生產(chǎn)紅色素的研究中，發(fā)現(xiàn)該發(fā)酵過程屬于非生長偶聯(lián)型。信亞文等[19]采用連續(xù)補(bǔ)料的Fed-Batch培養(yǎng)技術(shù)用于紅曲霉菌的液相培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)紅曲色素合成與紅曲霉菌生長的關(guān)系也屬于非生長偶聯(lián)型。衣珊珊[22]在采用紫甘薯淀粉液態(tài)發(fā)酵制備紅曲色素的研究中發(fā)現(xiàn)，紅曲霉菌體干質(zhì)量只與胞內(nèi)色素產(chǎn)量之間呈高度正相關(guān)（r=0.984 4），與胞外色素間不存在這種相關(guān)性。由圖1可以看出，與生物量、紅色素色價相比，發(fā)酵培養(yǎng)物的pH值延遲2 d左右到達(dá)峰值，且一直保持穩(wěn)定，但在液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)紅色素的研究中卻發(fā)現(xiàn)，pH值先下降后上升[22]。

2.2 總糖、淀粉和還原糖含量的動態(tài)變化

發(fā)酵過程中總糖、淀粉與還原糖含量的動態(tài)變化見圖2。

由圖2可以看出，發(fā)酵前2 d，紫色紅曲霉處于適應(yīng)期，對營養(yǎng)物質(zhì)消耗很少，總糖含量基本保持不變，隨后總糖含量迅速降低，這是由于在對數(shù)生長期大量總糖用于合成紫色紅曲霉細(xì)胞生長、紅色素合成以及為其生長代謝提供能量；到第6天后總糖含量基本保持穩(wěn)定，這與圖1中菌體生長規(guī)律完全吻合；淀粉含量的變化趨勢與總糖含量變化趨勢總體相似，但是淀粉含量在發(fā)酵前4 d基本保持不變，可能原因在于三七渣中存在比淀粉更容易利用的碳源，比如小分子的單糖和雙糖，優(yōu)先被紫色紅曲霉利用，發(fā)酵第3～4.5天淀粉含量下降最快，隨后降速變緩直到發(fā)酵第8天后趨于穩(wěn)定。還原糖含量在發(fā)酵第4天達(dá)到峰值，然后快速下降，4.5 d以后降速放緩，6.5 d以后趨于穩(wěn)定；結(jié)合淀粉含量的變化趨勢，可以認(rèn)為，發(fā)酵前3 d還原糖的積累主要來自于其他比淀粉更容易水解利用的碳源，隨后1.5 d淀粉大量水解產(chǎn)生還原糖供給菌體對數(shù)生長期所需。在固態(tài)發(fā)酵三七渣生產(chǎn)蛋白飼料時，總糖、還原糖、淀粉含量的變化規(guī)律與本研究結(jié)果相似[23-24]。利用鼠李糖乳桿菌生產(chǎn)L-乳酸時，在發(fā)酵過程中也觀察到了類似的還原糖變化趨勢[25]。發(fā)酵初期三七渣中總糖含量與淀粉含量相差3%，但在發(fā)酵后期這一差值擴(kuò)大到了8%左右，說明淀粉是發(fā)酵過程中被主要利用的碳源。

圖2 發(fā)酵過程中總糖、淀粉與還原糖含量的動態(tài)變化Fig.2 Dynamic changes of total sugar,starch and reducing sugar contents during fermentation

2.3 菌體生長動力學(xué)模型

紫色紅曲霉生物量隨發(fā)酵時間變化的擬合曲線見圖3，相關(guān)模型參數(shù)及統(tǒng)計參數(shù)見表1。

圖3 菌體生長擬合曲線Fig.3 Fitting curve of cell growth

由表1和圖3可以看出，實驗數(shù)據(jù)和擬合曲線的相關(guān)性較好，符合統(tǒng)計檢驗要求，菌體生長動力學(xué)模型如下：由此可以得出，比生長速率常數(shù)μ=0.457 4 d-1，最大菌體生物量Xm=0.241 6 g/g發(fā)酵培養(yǎng)物（干基）。

表1 菌體生長動力學(xué)模型參數(shù)Table 1 Parameters of cell growth kinetics model

2.4 產(chǎn)物生成動力學(xué)模型

紅色素色價隨發(fā)酵時間變化的擬合曲線如圖4所示，相關(guān)模型參數(shù)及統(tǒng)計參數(shù)見表2。

圖4 產(chǎn)物生成擬合曲線Fig.4 Fitting curve of product generation

由表2可知，用Boltzmann模型可以很好地擬合產(chǎn)物生成過程，符合統(tǒng)計檢驗要求，產(chǎn)物生成動力學(xué)模型如下：

表2 產(chǎn)物生成動力學(xué)模型參數(shù)Table 2 parameters of product generation kinetic model

由圖4可知，紅色素色價達(dá)到最大值一半時需要的發(fā)酵時間t0=4.21 d，最大紅色素色價B2=14.63 U/g發(fā)酵培養(yǎng)物（干基）。

2.5 基質(zhì)降解動力學(xué)模型

總糖含量隨發(fā)酵時間變化的擬合曲線如圖5所示，以總糖表示的基質(zhì)降解動力學(xué)模型參數(shù)及統(tǒng)計參數(shù)見表3。

由表3和圖5可以看出，用四參數(shù)對數(shù)模型可很好地擬合基質(zhì)降解過程，符合統(tǒng)計檢驗要求，基質(zhì)降解動力學(xué)模型如下：

表3 基質(zhì)降解動力學(xué)模型參數(shù)Table 3 Parameters of substrate degradation kinetics model

圖5 總糖降解擬合曲線Fig.5 Fitting curve of total sugar degradation

由此可以看出，發(fā)酵末期發(fā)酵培養(yǎng)物（干基）中總糖含量D2=28.84%，總糖消耗的半衰期t50%=3.536 d。

3 結(jié)論

本研究對紫色紅曲霉固態(tài)發(fā)酵三七渣生產(chǎn)紅色素的動力學(xué)進(jìn)行了研究，建立了菌體生長、產(chǎn)物生成以及基質(zhì)降解動力學(xué)模型。研究結(jié)果表明：采用對數(shù)模型對菌體生長動力學(xué)進(jìn)行描述，每克發(fā)酵培養(yǎng)物（干基）中最大菌體生物量Xm=0.241 6 g，比生長速率常數(shù)μ=0.457 4 d-1；產(chǎn)物生成動力學(xué)適合采用Boltzmann模型進(jìn)行描述，發(fā)酵培養(yǎng)物（干基）中最大紅色素色價B2=14.63 U/g，紅色素色價達(dá)到最大值一半時需要的發(fā)酵時間t0=4.21 d；基質(zhì)降解動力學(xué)適合采用四參數(shù)對數(shù)模型進(jìn)行描述，發(fā)酵末期發(fā)酵培養(yǎng)物（干基）中總糖含量D2=28.84%，總糖消耗的半衰期t50%=3.536 d。