味精生產(chǎn)中有機(jī)酸含量的抑制型離子色譜測定及焦谷氨酸產(chǎn)生原因分析

王 睿，王 倩，趙 軒，林樟楠，叢 威*

（1.中國科學(xué)院 過程工程研究所 生化工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100190；2.中國科學(xué)院大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，北京 100049；3.北京電子科技職業(yè)學(xué)院 生物工程學(xué)院，北京 100176）

味精生產(chǎn)主要包括谷氨酸發(fā)酵、谷氨酸提取和味精精制三個(gè)部分。在谷氨酸發(fā)酵過程中，谷氨酸的生物合成包括酵解途徑（embden-meyerhof-parnas，EMP）、磷酸己糖途徑（hexose monophosphate pathway，HMP）、三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循環(huán)、乙醛酸循環(huán)、Wood-Werkman反應(yīng)（CO2固定反應(yīng)等）[1]。在微生物生長和谷氨酸的生物合成過程中有機(jī)酸隨之產(chǎn)生，有機(jī)酸的濃度變化反映工業(yè)菌株產(chǎn)生代謝情況，對于研究谷氨酸發(fā)酵代謝具有重要意義。同時(shí)，過高的有機(jī)酸濃度可能會降低谷氨酸提取后晶體的純度。此外，味精生產(chǎn)過程中，由于濃縮、結(jié)晶等操作使料液長時(shí)間處于高溫缺水條件，導(dǎo)致谷氨酸脫水環(huán)化成焦谷氨酸[2-4]。焦谷氨酸的產(chǎn)生不僅使谷氨酸收率降低，而且影響谷氨酸的結(jié)晶性能，影響味精的品質(zhì)[5-6]。因此，建立味精生產(chǎn)中快速準(zhǔn)確的有機(jī)酸檢測方法是必要的。

目前，同時(shí)檢測發(fā)酵液中多種有機(jī)酸有很多文獻(xiàn)報(bào)道，包括液相色譜（liquid chromatography，LC）法[7-12]、毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis，CE）法[13]和離子色譜（ion chromatography，IC）法[14-16]。高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法具有簡單、便捷、快速等優(yōu)點(diǎn)，劉志成等[9]采用HPLC法同時(shí)測量谷氨酸發(fā)酵液中的谷氨酸、丙酮酸、α-酮戊二酸、乳酸、檸檬酸和琥珀酸，避免了谷氨酸的衍生處理。但實(shí)際生產(chǎn)中谷氨酸發(fā)酵液的谷氨酸含量遠(yuǎn)大于其他有機(jī)酸，制備樣品時(shí)稀釋倍數(shù)大導(dǎo)致有機(jī)酸測量不準(zhǔn)確。此外，HPLC法還存在谷氨酸和谷氨酰胺與焦谷氨酸難分離的問題[17-18]。

離子色譜法近年來因其獨(dú)特的分離原理和高靈敏度、高選擇性而得到廣泛應(yīng)用[19]。離子色譜實(shí)現(xiàn)離子分離的依據(jù)是待測離子與分離柱功能基團(tuán)的親和力差異。進(jìn)樣后，待測離子首先被吸附在分離柱的功能基團(tuán)上，再與淋洗液中具有相同電荷的離子進(jìn)行可逆交換后洗脫。在某一淋洗液和操作條件下，不同待測離子的保留時(shí)間不同，在電導(dǎo)檢測器上的電導(dǎo)響應(yīng)值也不同，可通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算待測離子含量。淋洗液的組成和濃度、柱溫和流速等條件均會影響待測離子的分離性能。離子色譜法根據(jù)淋洗液條件下待檢測離子所帶電荷種類不同，可分為陽離子色譜和陰離子色譜。常規(guī)陰離子交換柱可檢測Cl-、NO3-、F-、SO42-等無機(jī)陰離子，目前文獻(xiàn)中多采用常規(guī)陰離子交換柱同時(shí)檢測多種有機(jī)酸，主要應(yīng)用于食醋、醬油、果汁、白酒等食品的檢測。在實(shí)際味精生產(chǎn)中，硫酸的加入導(dǎo)致谷氨酸提取后料液中存在大量SO42-，同時(shí)料液中存在大量氨基酸，對陰離子交換柱檢測有機(jī)酸均產(chǎn)生影響。離子色譜的有機(jī)酸柱是一種特殊的陰離子交換柱，相比于常規(guī)陰離子交換柱在弱酸分離上更具優(yōu)勢，且不易受陰離子或氨基酸離子的影響[20-22]。

本研究采用離子色譜有機(jī)酸柱建立味精生產(chǎn)中同時(shí)檢測檸檬酸、酒石酸、丙二酸、蘋果酸、琥珀酸、乳酸、富馬酸、甲酸、乙酸和焦谷氨酸的方法，并且對味精生產(chǎn)各工段有機(jī)酸種類和含量進(jìn)行跟蹤測定，進(jìn)一步就味精生產(chǎn)中焦谷氨酸的產(chǎn)生原因進(jìn)行初步探討，以期為味精生產(chǎn)過程有機(jī)酸的監(jiān)控和產(chǎn)品質(zhì)量評價(jià)提供實(shí)用性的手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

味精生產(chǎn)各工段料液樣品：由某味精生產(chǎn)企業(yè)提供。

檸檬酸、L-蘋果酸、乳酸、琥珀酸（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；丙二酸、酒石酸（均為分析純）、乙酸（色譜純）：西隴化工股份有限公司；富馬酸、甲酸、焦谷氨酸（均為分析純）：阿拉丁控股集團(tuán)有限公司；乙腈（色譜純）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司。采用的高純水電阻率為18.2 MΩ·cm。

1.2 儀器與設(shè)備

940ProfessionalICVario離子色譜儀（配有電導(dǎo)檢測器、化學(xué)抑制器、二氧化碳抑制器、低脈沖串聯(lián)式雙活塞往復(fù)泵和MagICNet3.2色譜數(shù)據(jù)處理軟件）、MetrosepOrganicacids-250/7.8分析柱、Metrosep Organic Acids Guard/4.6保護(hù)柱：瑞士萬通中國有限公司；SQP電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；Spring-R3O純水機(jī)：廈門銳思捷水純化技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理及標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

稱取檸檬酸、酒石酸、丙二酸、蘋果酸、琥珀酸、富馬酸和焦谷氨酸的標(biāo)準(zhǔn)品和用酸堿滴定法標(biāo)定準(zhǔn)確濃度的乳酸、甲酸和乙酸的標(biāo)準(zhǔn)品，用高純水配制成各有機(jī)酸質(zhì)量濃度均為1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液。

1.3.2 色譜條件

采用Metrosep Organic acids-250/7.8分析柱；淋洗液：0.5 mmol/L的硫酸和丙酮添加比例為15%的混合溶液；最大流速為0.6 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；檢測器：電導(dǎo)檢測器；抑制液：50 mmol/L氯化鋰。根據(jù)文獻(xiàn)[23-24]報(bào)道的不同有機(jī)改進(jìn)劑對于多種離子分離效果的影響結(jié)果表明，乙腈相較于丙酮和甲醇等其他有機(jī)改進(jìn)劑具有洗脫能力強(qiáng)、靈敏度高和柱壓小的優(yōu)勢。本研究考察了淋洗液中硫酸濃度（0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、1.5 mmol/L和2.5 mmol/L）、柱溫（10 ℃、20 ℃和30 ℃）、流速（0.1 mL/min、0.3 mL/min和0.5 mL/min）、乙腈添加比例（0、5%、7%、10%和20%）對10種有機(jī)酸分離效果的影響。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別吸取一定量的1 000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)混合溶液于容量瓶中，用高純水配制成質(zhì)量濃度分別為1 mg/L、2 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L、100 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，有機(jī)酸的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸分析和樣品定量分析。

1.3.4 焦谷氨酸產(chǎn)生評價(jià)方法

用谷氨酸損失率表示轉(zhuǎn)化為焦谷氨酸的谷氨酸含量占初始谷氨酸含量的比值，如式（1）所示：

式中：Lg為谷氨酸損失率，%；mp為焦谷氨酸總量，kg；mp0為初始發(fā)酵液中焦谷氨酸總量，kg；mg0為初始谷氨酸總量，kg；147.13為谷氨酸的相對分子質(zhì)量；129.12為焦谷氨酸的相對分子質(zhì)量。

企業(yè)提供的初始谷氨酸發(fā)酵液中谷氨酸質(zhì)量濃度為187 g/L，體積為420 m3的發(fā)酵罐4個(gè)，計(jì)算得初始谷氨酸總量為314 950 kg。

1.3.5 分離度的測定

分離度Rs是衡量相鄰洗脫組分的分離情況，分離度越大，相鄰兩組分分離越好，分離度計(jì)算公式如下[25]：

式中：t1和t2表示兩個(gè)洗脫峰的保留時(shí)間，min；W（1/2）1和W（1/2）2

表示兩個(gè)洗脫峰的半峰寬，min。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

采用MagIC Net 3.2色譜數(shù)據(jù)處理軟件，根據(jù)色譜圖中樣品的保留時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間比對進(jìn)行定性分析，根據(jù)各有機(jī)酸的峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣品中的有機(jī)酸進(jìn)行定量分析。用Microsoft Excel 2019、Origin 8.6軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 離子色譜法測定味精中有機(jī)酸條件優(yōu)化

本研究對淋洗液中硫酸濃度、柱溫、流速和淋洗液中乙腈添加比例進(jìn)行優(yōu)化，考察10種有機(jī)酸的分離效果。首先通過預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測了谷氨酸和谷氨酰胺在有機(jī)酸柱上的保留情況，結(jié)果顯示二者均不出峰，不影響焦谷氨酸檢測。

2.1.1 淋洗液中硫酸濃度的選擇

考察淋洗液硫酸濃度（0.5mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L和2.5 mmol/L）變化對10種有機(jī)酸的分離效果，結(jié)果見圖1。由圖1可知，硫酸濃度增加導(dǎo)致有機(jī)酸的保留時(shí)間增加，其中，硫酸濃度的改變對富馬酸和焦谷氨酸的影響較大。硫酸濃度＞1.0 mmol/L時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)焦谷氨酸與其他有機(jī)酸基線分離。在考察的硫酸濃度范圍內(nèi)不能分離琥珀酸和乳酸。選取硫酸濃度為1.0 mmol/L進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 10種有機(jī)酸在不同硫酸濃度下的離子色譜圖Fig.1 Ion chromatograms of 10 organic acids at different sulfuric acid concentration

2.1.2 柱溫的選擇

柱溫會影響有機(jī)酸的分離度和保留時(shí)間，考察柱溫分別為10 ℃、20 ℃和30 ℃條件下的有機(jī)酸分離情況，結(jié)果見圖2。由圖2可知，隨著柱溫增加，富馬酸和焦谷氨酸的保留時(shí)間縮短，其他有機(jī)酸的保留時(shí)間基本不變。琥珀酸和乳酸在考察的溫度范圍內(nèi)不能實(shí)現(xiàn)分離，富馬酸和乙酸在10 ℃時(shí)不能完全分離，30 ℃時(shí)富馬酸和甲酸的峰重疊。因此選擇柱溫為20 ℃進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 10種有機(jī)酸在不同柱溫下的離子色譜圖Fig.2 Ion chromatograms of 10 organic acids at different column temperature

2.1.3 流速的選擇

在離子色譜分離時(shí)，流速升高，柱壓增加；而流速過小，可能造成峰形變形和拖尾。降低流速會增加分離度、增加峰面積和峰寬，考察流速為0.1 mL/min、0.3 mL/min和0.5 mL/min時(shí)對有機(jī)酸分離的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知，有機(jī)酸的出峰順序不受流速影響，為評價(jià)流速對相鄰洗脫組分分離情況的影響，根據(jù)式（2）計(jì)算相鄰有機(jī)酸的分離度。隨著流速降低，相鄰有機(jī)酸的分離度略有增加，如丙二酸和蘋果酸的分離度在流速為0.5 mL/min、0.3 mL/min和0.1 mL/min時(shí)依次為0.81、0.94和1.05。但流速降低，有機(jī)酸保留時(shí)間大幅增加，靈敏度下降。綜合考慮，選擇流速0.3 mL/min進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 10種有機(jī)酸在不同流速下的離子色譜圖Fig.3 Ion chromatograms of 10 organic acids at different flow velocity

2.1.4 淋洗液中乙腈添加比例的選擇

淋洗液中乙腈的加入可以降低淋洗液的極性，縮短分析時(shí)間，對不同待測離子保留時(shí)間影響很大，同時(shí)改善離子的峰型[26]。考察淋洗液中乙腈添加比例為0～20%時(shí)的有機(jī)酸分離效果，結(jié)果見圖4。由圖4可知，隨著乙腈添加比例的增加，淋洗液電導(dǎo)率下降，有機(jī)酸的保留時(shí)間縮短。富馬酸和焦谷氨酸的保留時(shí)間受乙腈添加影響最大。添加乙腈比例在7%以上能夠有效的分離琥珀酸、乳酸，但添加比例過大時(shí)影響了酒石酸、丙二酸和蘋果酸的分離。乙腈添加比例為7%時(shí)分離效果最好。

圖4 10種有機(jī)酸在不同乙腈添加比例下的離子色譜圖Fig.4 Ion chromatograms of 10 organic acids at different acetonitrile addition ratio

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 10種有機(jī)酸線性關(guān)系

根據(jù)以上優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，采用淋洗液中硫酸濃度為1.0 mmol/L和乙腈添加比例為7%、柱溫為20 ℃、流速為0.3 mL/min的離子色譜條件進(jìn)行檢測，配制一系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以峰面積（y）和有機(jī)酸質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行線性擬合，其線性關(guān)系、線性范圍、檢出限、定量限和相關(guān)系數(shù)（r2）見表1。由表1可知，10種有機(jī)酸的線性相關(guān)系數(shù)均可達(dá)0.998以上，線性良好，以3倍信噪比計(jì)算10種有機(jī)酸的檢出限為0.028～0.971 mg/L，以10倍信噪比計(jì)算定量限為0.092～3.236 mg/L。

表1 10種有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、線性范圍、線性系數(shù)、檢出限和定量限Table 1 Standard curve regression equation,linear range,linear coefficient,detection limit and quantification limit of 10 organic acids

2.2.2 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

向谷氨酸發(fā)酵液中加入一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋250倍，用0.22 μm的濾膜過濾，平行測6次，根據(jù)加標(biāo)濃度和測定濃度計(jì)算有機(jī)酸的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果見表2。由表2可知，10 種有機(jī)酸的加標(biāo)回收率為92.1%～106.2%，RSD 為0.171%～0.938%，除丙二酸、琥珀酸和乙酸外，其余有機(jī)酸的回收率均在95%～106.2%范圍內(nèi)，10種有機(jī)酸回收率測定結(jié)果的RSD均＜1%，表明該方法準(zhǔn)確可靠，滿足實(shí)際樣品的分析。

表2 谷氨酸發(fā)酵液中6個(gè)水平下的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Standard recovery rate and relative standard deviation of 6 spiked samples in glutamic acid fermentation broth

2.3 味精生產(chǎn)各工段有機(jī)酸含量的測定

2.3.1 離子色譜法檢測味精生產(chǎn)各工段料液中有機(jī)酸濃度

一次母液為等電提取分離谷氨酸后得到的上清液，二次母液為洗滌谷氨酸結(jié)晶得到的洗水，其中洗滌谷氨酸結(jié)晶的用水包含轉(zhuǎn)晶過程和味精結(jié)晶過程帶來的料液。采用離子色譜在優(yōu)化條件下檢測了典型味精生產(chǎn)工藝各工段實(shí)際料液中的谷氨酸發(fā)酵液、一次母液、二次母液及其濃縮液的各有機(jī)酸含量，結(jié)果見表3。由表3可知，實(shí)際料液中檢測到酒石酸、丙二酸、蘋果酸、琥珀酸、乳酸、甲酸、乙酸和焦谷氨酸，檢測到的谷氨酸發(fā)酵液中有機(jī)酸的總量為谷氨酸總量（谷氨酸發(fā)酵液中谷氨酸的質(zhì)量濃度為187 g/L）的3.8%，其中乳酸、乙酸和焦谷氨酸的濃度較高。除焦谷氨酸外，其他有機(jī)酸在各個(gè)工段樣品中未見明顯變化，而焦谷氨酸質(zhì)量濃度在二次母液和二次母液濃縮液中分別高達(dá)40.20 g/L和84.28 g/L。除焦谷氨酸外檢測到的少量其他有機(jī)酸在谷氨酸發(fā)酵過程中產(chǎn)生，其含量在之后的工段中保持穩(wěn)定。而大量焦谷氨酸的產(chǎn)生表明在味精生產(chǎn)過程中有大量谷氨酸轉(zhuǎn)化，造成產(chǎn)品的損失，因此在味精生產(chǎn)過程中應(yīng)加強(qiáng)對焦谷氨酸含量的監(jiān)測，本研究進(jìn)一步對焦谷氨酸的產(chǎn)生原因進(jìn)行初步探討。

表3 味精生產(chǎn)不同工段料液中有機(jī)酸含量測定結(jié)果Table 3 Determination results of organic acid contents in the broth of different section of monosodium glutamate production g/L

2.3.2 焦谷氨酸產(chǎn)生原因探討

焦谷氨酸是由于料液長時(shí)間高溫缺水導(dǎo)致谷氨酸脫水環(huán)化而產(chǎn)生的。在連續(xù)濃縮等電法中，可能產(chǎn)生焦谷氨酸的工段主要有料液濃縮過程、轉(zhuǎn)晶過程和結(jié)晶過程。料液濃縮過程包括發(fā)酵液濃縮、一次母液濃縮和二次母液濃縮過程。其中，影響谷氨酸收率的過程為發(fā)酵液濃縮和二次母液濃縮。根據(jù)表3中各工段料液中焦谷氨酸濃度測定結(jié)果，結(jié)合企業(yè)提供的各工段料液體積信息，計(jì)算得到各工段焦谷氨酸總量和相應(yīng)的谷氨酸損失率，結(jié)果見表4。

表4 味精生產(chǎn)各工段料液焦谷氨酸含量及谷氨酸損失率Table 4 Pyroglutamate content and glutamic acid loss rate of broth of different section of monosodium glutamate production

由表4可知，對比三段濃縮過程可以看出，與濃縮前相比，濃縮后的料液中焦谷氨酸的量未見增加，因此，濃縮過程對焦谷氨酸的產(chǎn)生影響不大。轉(zhuǎn)晶過程和味精結(jié)晶過程產(chǎn)生的焦谷氨酸體現(xiàn)在二次母液中，焦谷氨酸總量是初始發(fā)酵液的5.8倍，若不進(jìn)行回收會損失7.6%的谷氨酸。實(shí)際生產(chǎn)過程中，二次母液濃縮后用硫酸水解使焦谷氨酸開環(huán)生成谷氨酸，水解液回到等電罐中調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH，通過這一操作可對該部分谷氨酸進(jìn)行回收[27]。一次母液與初始谷氨酸發(fā)酵液相比焦谷氨酸總量提高了51%，說明在等電過程引入了焦谷氨酸，二次母液濃縮液焦谷氨酸水解不完全，相當(dāng)于有0.8%的谷氨酸在一次母液中未被回收。因此在典型味精生產(chǎn)工藝中轉(zhuǎn)晶過程和味精結(jié)晶過程有大量焦谷氨酸產(chǎn)生，通過酸解可回收大部分谷氨酸，但仍有少量損失進(jìn)入一次母液中。為減少產(chǎn)品損失和水解焦谷氨酸的酸用量，應(yīng)進(jìn)一步研究具體操作條件對焦谷氨酸產(chǎn)生的影響，在此基礎(chǔ)上改進(jìn)轉(zhuǎn)晶過程和味精結(jié)晶過程的工藝條件。上述結(jié)果表明經(jīng)優(yōu)化后的抑制型離子色譜法適用于監(jiān)測味精生產(chǎn)中的有機(jī)酸含量，為產(chǎn)品質(zhì)量評估提供了有效的檢測手段。

3 結(jié)論

測定味精生產(chǎn)中有機(jī)酸的含量對味精生產(chǎn)工藝評價(jià)和產(chǎn)品質(zhì)量提升意義重大。本研究建立了抑制型離子色譜法測定味精生產(chǎn)中有機(jī)酸，采用有機(jī)酸柱對檸檬酸、酒石酸、丙二酸、蘋果酸、琥珀酸、乳酸、富馬酸、甲酸、乙酸和焦谷氨酸10種有機(jī)酸進(jìn)行分離。該方法具有線性范圍廣、結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，樣品過濾后即可直接進(jìn)樣檢測，與液相色譜相比發(fā)酵液中谷氨酸和谷氨酰胺不影響焦谷氨酸的檢測，適用于在高氨基酸和高無機(jī)離子濃度下有機(jī)酸的檢測，為其他類似的有機(jī)酸的定性和定量檢測提供借鑒。