基于GC-QTOF MS結合化學計量學的三種香型白酒鑒別方法研究

卓俊納，吳衛(wèi)宇，劉茗銘，王明昌，袁思棋，趙金松，*

（1.四川輕化工大學 生物工程學院，四川 自貢 643000；2.四川國檢檢測有限責任公司，四川 瀘州 646000；3.四川省酒業(yè)集團有限責任公司，四川 成都 610000）

白酒作為中國傳統(tǒng)的民族工業(yè)，具有悠久的歷史，它擁有獨特的釀造工藝和獨特的酒體風味，是世界六大蒸餾酒之一[1]。有關科學研究院以及生產(chǎn)企業(yè)通過科學的檢測研究，將白酒劃分為12種香型[2]，不同香型的白酒擁有不同的工藝特點及風味特征。在劃分的12種香型中，濃香、清香、醬香作為三大主體香型具有不可撼動的地位[3]。報告顯示，2020年濃香、清香、醬香三種香型白酒占市場比例高達93%，其余香型僅占7%[4]。清香型白酒又分為小曲清香、大曲清香和麩曲清香[5]，其中小曲清香酒質柔和、清香純正，深受當代年輕人喜愛[6]。

檢測白酒風味物質的方法有許多種，例如氣相色譜（gas chromatography，GC）法[7]、氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）法[7-8]、氣相色譜-離子遷移譜（gas chromatography-ion mobility spectroscopy，GC-IMS）[9]、氣相色譜-四極桿飛行時間質譜（gas chromatography-quadrupole time of flight mass spectrometry，GC-QTOF MS）[10]等，其中，GC-QTOF MS具有準確定量、快速篩查[11]，高靈敏度、高精確度[12]，數(shù)據(jù)采集簡單方便[13]等優(yōu)點，目前已廣泛應用于農藥殘留[11，13-14]、煙草[15]、蜂王漿[16]等領域。栗新峰等[10]對原酒進行感官定級以及通過氣相色譜-四極桿飛行時間質譜對樣品中的43種揮發(fā)性風味成分進行定性和定量分析，利用因子分析方法從43種揮發(fā)性風味物質成分中篩選出23種揮發(fā)性風味組分，并能夠將3個等級原酒進行有效分類。但利用氣相色譜-四極桿飛行時間質譜技術進行白酒風味物質檢測的運用范圍不廣。

本研究以3種不同香型（濃香、醬香、小曲清香）的24個白酒樣品為研究對象，采用氣相色譜-四極桿飛行時間質譜（GC-QTOF MS）檢測白酒中40種揮發(fā)性風味物質。對結果進行Z-score標準化后結合層次聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）以及偏最小二乘法-判別分析（partial least squaresdiscriminant analysis，PLS-DA）3種化學計量學方法，分析不同香型白酒中風味物質的差異，充分認識白酒香型的實質[17]，以期為白酒香型的鑒別與分類予以有效、合理、科學的技術方式，為白酒香型的快速鑒別提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒樣：3個香型共計24個原酒酒樣，包括濃香型（NX）原酒酒樣8個（N1～N8）；醬香型（JX）原酒酒樣8個（J1～J8）；小曲清香型（XQQX）原酒酒樣8個（Q1～Q8）；驗證原酒酒樣6個（Y1～Y6，其中Y1、Y2為濃香型，Y3、Y4為醬香型，Y5、Y6為小曲清香型）所有原酒酒樣均由相應酒廠提供。

甲酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯等標準品（純度均≥99.9%）：上海西格瑪奧德里奇公司；叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸（純度均≥99.9%）：天津市津科精細化工研究所。

1.2 儀器與設備

超純水處理系統(tǒng)：美國的密理博公司、VF-WAXms色譜柱CP9207（60 m×0.25 mm×0.25 μm）、7890B/7200Q-TOF氣相色譜-四級桿飛行時間質譜儀：美國安捷倫公司；Labserv-LS-0610干燥箱：梅特勒-托利多儀器（上海）公司；電子天平：賽多利斯科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準品溶液及供試品溶液的制備

酯類標準品的配制：準確稱取甲酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸異戊酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、壬酸乙酯、亞油酸乙酯、棕櫚酸乙酯、油酸乙酯15種酯類物質于100 mL容量瓶中，用體積分數(shù)為60%的乙醇稀釋至刻度，搖勻，為混標1，備用?；鞓?中各組分的質量濃度分別為322.825 mg/L、2 697.23mg/L、997mg/L、128.3375mg/L、59.4mg/L、60.12mg/L、151.83 mg/L、3 265 mg/L、305 mg/L、3 511.512 5 mg/L、167.17 mg/L、116.062 5 mg/L、75.625 mg/L、127.45 mg/L、138.52 mg/L。

酸類標準品的配制：準確稱取乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸7種酸類物質于100 mL容量瓶中，用體積分數(shù)為60%的乙醇稀釋至刻度，搖勻，為混標2，備用?；鞓?中各組分的質量濃度分別為1 590.26 mg/L、166.925 mg/L、735.33 mg/L、78.4 mg/L、1 860 mg/L、120.825 mg/L、63.5 mg/L。

醛酮類標準品的配制：準確稱取乙醛、乙縮醛、異戊醛、糠醛、3-羥基-2-丁酮5種醛酮類物質于100 mL容量瓶中，用體積分數(shù)為60%的乙醇稀釋至刻度，搖勻，為混標3，備用?；鞓?中各組分的質量濃度分別為1 418.58 mg/L、668.8 mg/L、62 mg/L、662.86 mg/L、67.5 mg/L。

醇類標準品的配制：準確稱取甲醇、2-丁醇、正丙醇、異丁醇、正丁醇、2-甲基丁醇、異戊醇、正戊醇、己醇9種醇類物質于100 mL容量瓶中，用體積分數(shù)為60%的乙醇稀釋至刻度，搖勻，為混標4，備用?；鞓?中各組分的質量濃度分別為634.23 mg/L、610.5 mg/L、2 458.7 mg/L、579.1 mg/L、292.22mg/L、232.15mg/L、1438.35mg/L、80.7mg/L、152.08mg/L。

吡嗪類標準品的配制：準確稱取2,5-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、四甲基吡嗪4種吡嗪類物質于100 mL容量瓶中，用體積分數(shù)為60%的乙醇稀釋至刻度，搖勻，為混標5，備用?；鞓?中各組分的質量濃度分別為3.06 mg/L、2.32 mg/L、2.23 mg/L、5.27 mg/L。

內標溶液的配制：準確稱取叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸3種內標物于200 mL容量瓶中，用體積分數(shù)為60%的乙醇稀釋至刻度，搖勻，其質量濃度分別為158.746 8 mg/L、169.209 1 mg/L、158.899 5 mg/L。

供試品溶液：取酒樣5 mL，再將混合內標溶液100 μL加入其中，輕晃混合均勻。

1.3.2 GC-QTOF MS檢測條件

色譜條件：VF-WAXms色譜柱；進樣量1 μL；進樣口溫度245 ℃；分流比20∶1；升溫程序為以35 ℃的初始溫度持續(xù)10 min，以每分鐘3 ℃升溫至120 ℃，持續(xù)5 min，然后再以每分鐘8 ℃升溫至245 ℃，持續(xù)10 min；載氣為高純氦氣（He）；載氣流速為1 mL/min。

質譜條件：掃描質量范圍為29～500 m/z，接口溫度為280 ℃，電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量為70 eV，離子源溫度為230 ℃，四級桿溫度為150 ℃，質量掃描范圍29～500 m/z。

1.3.3 定量和定性分析

定性分析：全掃描和檢測自動進樣，可運用直接進樣法，而通過電腦檢索美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）2012圖譜庫，用以明確3種不同香型（濃香、醬香、小曲清香）的24個白酒樣品中所含有的40種風味物質中的特征離子碎片以及相對保留時間，為了定性分析的準確性，要選用豐度較高的碎片離子。

定量分析：通過各標準物質的含量和峰面積計算校正因子，以混合標準品中各組分與對應內標含量比值為橫坐標（x），各組分與對應內標的峰面積比值為縱坐標（y）計算獲得40種物質的標準曲線回歸方程進行定量分析。

1.3.4 原始數(shù)據(jù)標準化

對原始數(shù)據(jù)進行Z-score標準化處理。將原始數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)減去這一變量的平均數(shù)，再除以這一變量的標準差，有效消除原始信息數(shù)據(jù)之間存在的量綱差異和影響，使信息數(shù)據(jù)的可比性更高。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

分別采用軟件SIMCA 14.1和SPSS 24.0對數(shù)據(jù)進行化學計量學分析，采用Excel2013軟件對數(shù)據(jù)進行整理統(tǒng)計，采用Origin2021進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 白酒樣品風味物質的測定

采用GC-QTOF MS對白酒樣品中揮發(fā)性風味物質進行檢測，結果見表1。由表1可知，白酒樣品中共檢出風味物質40種，其中酯類15種，酸類7種，醛酮類5種，醇類9種，吡嗪類4種。酯類是白酒中主要的呈香呈味物質，具有令人愉悅的水果香氣[18]，但在不同香型的酒樣中酯類物質的含量差異較大。NX酒樣中乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯的含量較高；JX酒樣中除乙酸乙酯和乳酸乙酯外，其余酯類物質含量相差較小，且乙酸乙酯和乳酸乙酯含量高于NX和XQQX酒樣；XQQX酒樣中僅測得10種酯類，其中乙酸乙酯含量最高，但其質量濃度也低于NX酒樣與JX酒樣。酸類[18]作為糖類發(fā)酵之后的一種產(chǎn)物，在其濃度較低時，可以加深白酒香氣的層次感和復雜性，但若是存在較高濃度時，則會產(chǎn)生酸敗感。NX酒樣的酸類物質均以乙酸和己酸為主，JX和XQQX酒樣的酸類物質均以乙酸為主，其余酸類物質在含量上相差不大。醛酮類化合物與白酒的香氣也息息相關，其很大程度上影響著白酒香味物質的構成[19-20]。NX和XQQX酒樣的醛酮類物質以乙醛和乙縮醛為主，而JX酒樣則以乙醛和糠醛為主。醇類由發(fā)酵過程中氨基酸脫氨或糖脫羧產(chǎn)生[21]，適量的醇類物質能與酸酯化形成酯類物質，使酒體更加豐滿[22]。在3個香型中，NX酒樣的醇類物質含量相較于其余2個香型稍低；JX酒樣中的各醇類物質含量較高且較為均勻；XQQX酒樣中異戊醇的含量明顯高于其他2個香型，其余醇類物質含量相差不大。吡嗪類物質閾值低，氣味強度高，對焦香的形成發(fā)揮著很重要的作用，是白酒中重要的風味物質[23]。在本次實驗的樣品中，僅在JX酒樣中檢測到4種吡嗪類物質，且含量較小。結果表明，香型不同的白酒也有著不同種類和含量的風味物質，因此，為了保證數(shù)據(jù)的準確性以及科學合理性，對數(shù)據(jù)進行標準化處理。

表1 不同香型白酒風味物質質量濃度范圍Table 1 Mass concentration range of flavor substances in different flavor Baijiu

續(xù)表

2.2 層次聚類分析

對不同香型的24個白酒樣品進行層次聚類分析（HCA），通過使用SPSS 24.0軟件，根據(jù)白酒樣品相關特征的相似度進行歸類，檢測標準為歐氏距離平方，并以此為基礎，獲得詳細的聚類分析結果見圖1。

圖1 不同香型白酒中風味物質含量的層次聚類分析Fig.1 Hierarchical cluster analysis of flavor substance contents in different flavor Baijiu

由圖1可知，24個酒樣分為3大類，表明不同香型白酒之間風味物質的含量存在較大差異。其中8種醬香型（JX）白酒很好地歸為一類，8種小曲清香型（XQQX）白酒歸為一類，8種濃香型（NX）白酒歸為一類，表明以40種風味物質為原始變量可以將不同香型白酒進行正確歸類。

2.3 主成分分析

通過系數(shù)矩陣適應性檢驗相關數(shù)據(jù)的結果表明，白酒樣品中40種風味物質之間的關系為顯著正相關，充分反映出白酒樣品中所含的風味物質有著較強的相關性，可進行主成分分析（PCA）。使用SPSS 24.0軟件對3種香型的白酒進行PCA，特征值及累計方差貢獻率見表2，主成分載荷系數(shù)矩陣表3。由表2可知，前兩個主成分的累計方差貢獻率為91.464%（≥85%），說明這兩個主成分反映了原始數(shù)據(jù)的大部分信息。由表2和表3可知，主成分1（principal component，PC1）方差貢獻率為56.074%，其代表物質主要包括：丙酸乙酯、乙酸乙酯以及甲酸乙酯等酯類物質和酸類、吡嗪類物質；主成分2（PC2）方差貢獻率為35.390%，其代表物質主要為丁酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯等酯類物質和部分酸類、醇類物質。

表2 不同香型白酒風味物質主成分分析特征值及累計方差貢獻率Table 2 Characteristic value of principal component analysis and contribution rate of cumulative variance of flavor substance of different flavor Baijiu

續(xù)表

表3 各風味物質主成分系數(shù)載荷矩陣Table 3 Loading matrix of principal component coefficient of each flavor compound

續(xù)表

以主成分PC1為X軸，PC2為Y軸，建立不同香型白酒樣品前2個主成分分布的二維散點圖，結果見圖2。由圖2可知，NX酒樣分布在第二象限，JX酒樣的分布集中在第一象限，XQQX酒樣分布在第三象限。結果表明，PCA能高效區(qū)分3種不同香型的白酒，而且分類的各白酒樣品相關的情況，基本與獲得的HCA結果相同，充分反映出HCA與PCA在鑒別和分類白酒香型的過程中是能互相驗證的。

圖2 不同香型白酒樣品前2個主成分分布的二維散點圖Fig.2 Two-dimensional scatter plot of distribution of the first 2 principal components in different flavor Baijiu samples

2.4 偏最小二乘法-判別分析

對3個香型的白酒樣品進行偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA），結果見圖3。由圖3可知，PLS-DA能夠有效區(qū)分不同香型酒樣，X軸的負半軸皆為XQQX酒樣，第一象限分布NX酒樣，第四象限集中JX酒樣，NX酒樣分布的散點距離相對較遠，而JX酒樣分布的散點較為集中。最終結果表明，PLS-DA散點圖區(qū)分不同香型白酒酒樣會更為精準、科學、直觀，而且其最終分類的相關結果類似于PCA和HCA相關的結果，均能高效分類與鑒別白酒樣品。

圖3 不同香型白酒樣品偏最小二乘法-判別分析散點圖Fig.3 Scatter plot of partial least squares-discrimination analysis of different flavor Baijiu samples

2.5 不同香型白酒風味物質差異及其原因

通過各風味物質的含量差異有效結合化學計量學（HCA、PCA及PLS-DA）可以根據(jù)不同的白酒樣品香型對24個酒樣進行有效分類和鑒別，其原因主要在于：①曲藥各不相同[24]。濃香型白酒所使用的酒曲一般是采用小麥或添加大麥、豌豆、高粱等制成的中高溫大曲，醬香型白酒所使用的是小麥制成的高溫大曲，而小曲清香型白酒所使用的是以米粉或米糠為原料，加入適當輔料，接入一定量的種曲，在人工控濕控溫下培養(yǎng)而成的小曲。因為曲藥的生產(chǎn)原料不同、制作溫度不同，導致了不同香型白酒中的風味物質含量差異。②發(fā)酵工藝不同[24]。不同的發(fā)酵工藝會導致發(fā)酵時間不同、發(fā)酵溫度不同，從而使酒中的酯類、高級脂肪醇等物質的類型與含量的不同。濃香型白酒工藝特點為“續(xù)糟配料，混蒸混燒”，醬香型白酒則擁有“2次投糧，9次蒸煮，8次發(fā)酵，7次取酒”的特殊釀造工藝[25]，小曲清香型白酒的主要工藝特點為“培菌糖化、清蒸清燒”。③窖池不同[26-28]。不同香型白酒發(fā)酵所使用的窖池不同，濃香型白酒使用的是泥窖，醬香型白酒所使用的是泥底石窖，而小曲清香型白酒發(fā)酵多采用水泥窖。窖池材料的不同會造成微生物群落的差異，從而導致不同香型白酒中的風味物質含量差異。④地理位置、土壤類型、釀造環(huán)境等差異[24]。不同環(huán)境差異會對白酒中風味物質的形成造成影響。

2.6 方法驗證

作為PLS-DA模型變量的變量權重值，變量重要性投影（variable importance for the projection，VIP）值通常用于代謝物積累差異分類，判別每組樣本影響強度以及解釋能力的衡量，而在實際生活中，運用較為普遍的差異代謝物篩選標準為VIP值≥1[29]。為了對不同香型白酒中存在的風味物質差異進行深入分析，通過VIP值將酒樣分類的風味物質貢獻進行量化，從而將特征風味物質篩選出來。VIP值和分類貢獻度（變量的）呈正相關，VIP值越大，該風味物質對不同香型白酒差異貢獻越大。不同香型白酒樣品的風味物質VIP值見圖4。

圖4 不同香型白酒風味物質的變量重要性投影值Fig.4 Variable importance projection values of flavor substances in different flavor Baijiu

為了篩選不同香型和風味物質的分類酒樣，研究分析9種VIP值≥1的風味物質，由圖4可知，存在較大貢獻度的風味物質（VIP值≥1）包括：糠醛、己酸乙酯、乙酸、乳酸乙酯、正丙醇、異戊醇、己酸、乙酸乙酯和異丁醇，其VIP值分別為：1.098 30、3.165 99、1.125 42、2.714 01、1.126 21、2.222 47、1.159 19、1.938 26和1.384 49。

基于GC-QTOF MS結合化學計量學建立的不同香型白酒的區(qū)分模型，將Y1～Y6的白酒樣品作為驗證酒樣，測定驗證酒樣中VIP值≥1的9種風味物質（己酸乙酯、乳酸乙酯、異戊醇、乙酸乙酯、異丁醇、己酸、正丙醇、乙酸、糠醛）的含量，結果見表4。

表4 驗證酒樣中風味物質的含量Table 4 Content of flavor substances in validated Baijiu samples mg/L

對驗證酒樣風味物質的信息數(shù)據(jù)進行分析，獲得驗證酒樣偏最小二乘法-判別分析PLS-DA散點圖見圖5。由圖5可知，酒樣Y1、Y2與NX歸為一類，酒樣Y3、Y4與JX歸為一類，酒樣Y5，Y6與XQQX歸為一類。結果表明，可根據(jù)9種風味成分對不同香型白酒進行正確歸類。這一方式可以準確、高效的鑒別3種香型的白酒，而且該方式還能有效識別不同香型白酒中含有的風味物質及其分布的相關規(guī)律。

圖5 驗證酒樣偏最小二乘法-判別分析散點圖Fig.5 Scatter plot of partial least squares-discrimination analysis of validated Baijiu samples

3 結論

本研究采用GC-QTOF MS技術將3種不同香型（濃香、醬香、小曲清香）的24個白酒樣品中揮發(fā)性風味成分進行檢測，對結果進行Z-score標準化后，對全部的白酒樣品進行HCA、PCA以及PLS-DA分析。結果表明，以24個酒樣風味物質的數(shù)據(jù)建立的PLS-DA模型也能有效地識別出3種不同香型的酒樣。通過VIP值（≥1）確定構成不同香型白酒差異的9種風味物質為：己酸乙酯、乳酸乙酯、異戊醇、乙酸乙酯、異丁醇、己酸、正丙醇、乙酸、糠醛，而且在方法驗證的過程中發(fā)現(xiàn)，實驗酒樣以及驗證酒樣均能通過不同的香型歸類白酒樣品，這也充分體現(xiàn)出不同香型的白酒所存在的風味物質差異。因此，GC-QTOF MS結合各化學計量學為白酒香型的快速鑒別分類提供科學有效的技術手段。