己酸菌培養(yǎng)條件和不同微生物對(duì)己酸菌生長代謝影響的研究

劉英杰，張志偉，韓墨，楊平平，王燕

(齊魯工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，濟(jì)南 250353)

在窖泥中己酸菌數(shù)量的多少?zèng)Q定了窖泥功能的強(qiáng)弱，直接影響濃香型大曲酒質(zhì)量的優(yōu)劣。由于己酸菌的生存、生長、繁殖、代謝都有其自身的規(guī)律，只有不斷地研究其規(guī)律，發(fā)現(xiàn)影響己酸菌生長繁殖代謝的主要因素，創(chuàng)造適宜己酸菌生長繁殖代謝的生態(tài)環(huán)境，才能提高窖泥中的己酸菌數(shù)量，從而為提高濃香型白酒質(zhì)量奠定基礎(chǔ)。

1 己酸菌的形態(tài)特征

1.1 己酸菌的菌落特征

筆者分離出1株己酸菌，菌落呈現(xiàn)乳白色圓形，周圍有透明圈，菌落邊緣不規(guī)則，見圖1。

圖1 己酸菌的形態(tài)特征

彭兵等[1]采用乙醇醋酸鈉培養(yǎng)基對(duì)分離出的高產(chǎn)己酸菌株進(jìn)行形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，菌落呈白色圓形、扁平、表面光滑，且菌落周圍有較為明顯的透明圈。侯小歌等[2]從白酒糟醅中分離出的己酸菌較大，圓形、透明、乳黃色。菌落呈現(xiàn)不同顏色可能是己酸菌來源不同，己酸菌的種群結(jié)構(gòu)存在差異。

1.2 己酸菌的個(gè)體特征

己酸菌是生活在土壤中的棒狀芽孢桿菌，長1.94～3.35 μm，寬0.51～0.75 μm，革蘭氏染色陽性，適宜生活在pH為4.0～6.5的中性偏酸的環(huán)境中，游離孢子呈圓形，長0.15～0.18 μm。徐軍等[3]從枝江老窖泥中分離出1株己酸菌，該菌體呈短桿狀(0.6～0.7) μm×(3.5～4.5) μm，兩頭膨大成鼓槌狀。與筆者從窖泥中分離出的己酸菌個(gè)體形態(tài)相同。

2 不同培養(yǎng)條件對(duì)己酸菌株數(shù)量、產(chǎn)酸的影響

2.1 碳源對(duì)己酸菌產(chǎn)酸的影響

己酸菌發(fā)酵所需的碳源主要來自于酵母發(fā)酵糖類產(chǎn)生的酒精和被其他微生物代謝生成的有機(jī)酸，所以維持酵母和霉菌等的適當(dāng)營養(yǎng)，使之為己酸菌提供適量的乙醇和酸類等，則可以有效地促進(jìn)己酸菌的生長代謝[4]。謝彪等[5]在乙酸鈉培養(yǎng)基中分別添加2.5%的乙酸、淀粉水解糖、葡萄糖、蔗糖、木糖、乳酸代替乙醇作為碳源，其他成分不變，相同條件下培養(yǎng)10天后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：用乙醇產(chǎn)己酸最多，可以達(dá)到20.3 g/L，葡萄糖產(chǎn)生的己酸量次之，為4.8 g/L。說明乙醇是己酸菌產(chǎn)己酸最好的碳源。

韓珍瓊等[6]探究了乙醇濃度對(duì)己酸菌生長情況的關(guān)系，只改變培養(yǎng)液中乙醇濃度，33 ℃培養(yǎng)6天，觀察己酸菌的個(gè)體形態(tài)發(fā)現(xiàn)：乙醇濃度在2%～3%范圍內(nèi)，菌數(shù)較多，生長良好；在其他范圍內(nèi)，己酸菌很少甚至沒有，而且菌體也很小。說明適宜的乙醇濃度對(duì)己酸菌正常的生長至關(guān)重要。

在實(shí)際生產(chǎn)中，根據(jù)各地域的不同，調(diào)整一個(gè)合適的糧糟比，使入窖淀粉含量維持在15%～17%之間，其滿足己酸菌和其他微生物所需的碳源[7]。

2.2 氮源對(duì)己酸菌株產(chǎn)己酸的影響

氮源是組成己酸菌細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸的重要元素，這2種物質(zhì)又是微生物生命活動(dòng)中不可缺少的物質(zhì)，因此氮源對(duì)維持己酸菌自身的生長增殖非常重要[8]。

利用乙酸鈉改良培養(yǎng)基，任靜等[9]探究了L-亮氨酸和L-賴氨酸作氮源對(duì)己酸菌產(chǎn)己酸能力的影響，數(shù)據(jù)顯示：上述2種氮源含量分別在0.2%和0.1%時(shí)產(chǎn)己酸最多；馬業(yè)準(zhǔn)[10]也探究了L-亮氨酸和L-賴氨酸作氮源對(duì)己酸菌產(chǎn)己酸能力的影響，結(jié)果顯示：培養(yǎng)基中添加0.2%的L-亮氨酸或L-賴氨酸，己酸量增多。推測(cè)上述2種氨基酸有可能是除了起到氮源作用外，同時(shí)作為己酸菌的生長因子，促進(jìn)了己酸菌產(chǎn)酸。

2.3 溫度對(duì)己酸菌發(fā)酵的影響

己酸菌的營養(yǎng)細(xì)胞最適宜的生長溫度在35 ℃左右。在適宜的溫度范圍內(nèi)己酸菌可以被快速地激活、繁殖及代謝。溫度過低會(huì)抑制生長代謝，過高則會(huì)導(dǎo)致早衰死亡。

謝彪等采用乙酸鈉培養(yǎng)基，研究發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酸的影響，控制溫度為25，27，30，33，35，40，45 ℃發(fā)酵9天后，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行己酸分析。結(jié)果表明：己酸產(chǎn)量隨著溫度的上升先增加后下降，發(fā)酵的最適溫度為35 ℃，己酸產(chǎn)量達(dá)到19 g/L。

在濃香型大曲酒的發(fā)酵過程中要根據(jù)當(dāng)?shù)氐臍夂?，通過控制糧糟比、糧水比、量水溫度、入池溫度等工藝參數(shù)來控制發(fā)酵溫度在29～36 ℃，為釀酒微生物提供一個(gè)適宜的生長代謝環(huán)境。

2.4 VC對(duì)己酸產(chǎn)量的影響

馬榮山等[11]探究了VC對(duì)發(fā)酵液中的己酸產(chǎn)量的影響，實(shí)驗(yàn)表明：發(fā)酵液中添加VC會(huì)增加己酸的含量，原因是己酸菌在培養(yǎng)液里生長一段時(shí)間后，產(chǎn)生一定量的己酸，加入醇會(huì)酯化生成己酸乙酯；這時(shí)由于己酸不斷產(chǎn)生，發(fā)酵液pH不斷下降，適宜生長的環(huán)境條件遭到破壞，己酸菌進(jìn)入了衰亡期。加入VC會(huì)抑制一部分己酸的酯化反應(yīng)，延長對(duì)數(shù)期，從而對(duì)己酸生成有促進(jìn)作用。

2.5 底鍋水對(duì)己酸菌產(chǎn)酸的影響

謝國排[12]研究了底鍋水對(duì)己酸菌產(chǎn)己酸的影響。當(dāng)?shù)族佀砑恿繌?～30%不斷增加時(shí)，己酸產(chǎn)量也依次增加，最高達(dá)380 mg/dL，說明底鍋水的加入確實(shí)促進(jìn)了己酸菌的生長代謝。究其原因，是因?yàn)榈族佀泻胁糠钟袡C(jī)質(zhì)，在己酸菌的生長過程中為其提供營養(yǎng)；此外，有一部分有機(jī)質(zhì)作為己酸菌生長代謝中的前驅(qū)物質(zhì)促進(jìn)了其代謝活動(dòng)。該實(shí)驗(yàn)的不足之處在于未探究底鍋水含量高于30%時(shí)對(duì)己酸菌產(chǎn)酸的影響，是否有可能己酸產(chǎn)量會(huì)更高。

2.6 CaCO3含量對(duì)己酸菌產(chǎn)酸的影響

謝彪等采用乙酸鈉培養(yǎng)基，CaCO3添加量分別為0，5，10，15，20，25，30 g/L，其他成分不變，發(fā)酵10天后，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行己酸含量測(cè)定。結(jié)果表明：CaCO3添加量在0～15 g/L范圍內(nèi)，己酸生成量逐步增加，在15～30 g/L范圍內(nèi)，己酸生成量逐步減少，比較得出培養(yǎng)基中CaCO3含量維持在15 g/L，己酸產(chǎn)量最高。

原因是碳酸鈣中的鈣離子不僅為己酸菌的代謝發(fā)酵提供了無機(jī)營養(yǎng)，調(diào)節(jié)和緩沖培養(yǎng)基的pH，而且對(duì)己酸合成有關(guān)的酶活性有一定促進(jìn)作用。

3 其他微生物對(duì)己酸菌生長代謝的影響

3.1 乙酸菌對(duì)己酸菌生長代謝的影響

乙酸菌的主要功能是產(chǎn)生乙酸。由于乙酸是酸性較強(qiáng)的有機(jī)酸，在糟醅中會(huì)使環(huán)境的pH值降低，如果產(chǎn)生過量的乙酸，會(huì)對(duì)己酸菌的生長代謝環(huán)境造成影響，會(huì)抑制己酸菌的生長代謝過程，嚴(yán)重會(huì)造成濃香型白酒的酒質(zhì)微量成分比例失調(diào)，質(zhì)量下降。因此，在實(shí)際操作中一定要把糟醅的pH值控制在合適的范圍內(nèi)，并注意場地衛(wèi)生，預(yù)防乙酸菌的過量繁殖，這對(duì)于乙醇的生成和己酸菌的生長都是有利的。

3.2 乳酸菌對(duì)己酸菌生長代謝的影響

乳酸菌是一個(gè)粗放型菌種，對(duì)環(huán)境要求不高，生長繁殖能力特別強(qiáng)，繁殖代謝速度快，世代生長周期比己酸菌短，因此，在白酒生產(chǎn)過程中稍有不慎，糟醅就會(huì)感染大量的乳酸菌，其發(fā)酵糖類產(chǎn)生大量乳酸，一方面使糟醅的pH值下降，阻止己酸菌的生長代謝，導(dǎo)致己酸菌和己酸乙酯的含量下降；另一方面，乳酸長期積累會(huì)與窖泥中的鈣、鐵離子結(jié)合生成乳酸鈣、乳酸鐵，己酸菌的生長繁殖受到抑制[13]。所以，在濃香型白酒生產(chǎn)過程中都要采取“增己降乳”的技術(shù)措施來提高濃香型白酒的質(zhì)量。

3.3 甲烷菌對(duì)己酸菌的影響

己酸菌在生長和代謝中會(huì)產(chǎn)生對(duì)自身有毒害作用的H2和CO2，甲烷菌則利用氫作能源，CO2作碳源，消除己酸菌代謝的反饋抑制作用[14]。因此甲烷菌是己酸菌生活的合格環(huán)境清潔工，它的存在使窖內(nèi)各種產(chǎn) H2型發(fā)酵得以有效進(jìn)行。實(shí)踐證明：在人工老窖泥中，可以添加一定量的并具有良好共生作用的甲烷菌，使之成為窖泥中有益的功能菌，促進(jìn)己酸菌的生長繁殖。

3.4 放線菌對(duì)己酸菌的影響

放線菌是一種固氮微生物，可以將分子氮轉(zhuǎn)變?yōu)榘睉B(tài)氮，為己酸菌等微生物提供一定的氮源，實(shí)驗(yàn)表明：在己酸菌培養(yǎng)時(shí)，添加適量的放線菌對(duì)促進(jìn)己酸菌活菌數(shù)的增長有顯著的作用[15]。

4 結(jié)論與展望

己酸菌適宜培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度35 ℃，乙醇作碳源產(chǎn)己酸最多，pH值為5～7，酒精濃度2%～3%，CaCO3添加量15 g/L；培養(yǎng)基中添加VC、底鍋水可以有效提高己酸產(chǎn)量；過量乳酸菌對(duì)己酸菌有抑制作用，濃香型白酒的生產(chǎn)中強(qiáng)調(diào)“增己降乳”，放線菌可為己酸菌生長提供氮源。掌握己酸菌適宜的生長環(huán)境，供給豐富、適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)，創(chuàng)造對(duì)己酸菌有益的微生物菌群，對(duì)己酸和己酸乙酯的形成大有裨益，進(jìn)而為科研和生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)，促進(jìn)己酸菌的科學(xué)應(yīng)用。

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