己酸菌的篩選及其在濃香型白酒生產(chǎn)中應(yīng)用的研究進(jìn)展

殷想想，王欣蕊，馮文聰，李 良，陳 暉，董孝元，常 煦，方尚玲，陳茂彬*

（1.湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院 工業(yè)微生物湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 工業(yè)發(fā)酵省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430068；2.黃鶴樓酒業(yè)有限公司，湖北 武漢 430050；3.湖北安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443000）

白酒是中國(guó)特有的蒸餾酒，與白蘭地、伏特加、威士忌、朗姆酒、金酒并稱(chēng)為世界六大蒸餾酒[1-2]。白酒按照香型分為濃、清、米、醬四種基本香型[3]。其中，濃香型白酒以其“窖香優(yōu)雅、綿甜爽凈、酒體柔和協(xié)調(diào)”的特點(diǎn)深受消費(fèi)者喜愛(ài)[4]。濃香型白酒是以富含淀粉的谷物為原料如高粱、小麥、糯米、玉米和大米的混合物，以大曲為糖化發(fā)酵劑，在棲息于窖池中大量微生物的參與下，自然固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)[5]。

濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程是在封閉的窖池中進(jìn)行的，窖池是濃香型白酒形成獨(dú)特風(fēng)味的基礎(chǔ)。據(jù)了解，濃香型白酒的主體香味物質(zhì)-己酸乙酯，就是由窖池中己酸菌所產(chǎn)己酸和乙醇酯化形成的[6-7]。因此，己酸菌被普遍認(rèn)為是濃香型白酒釀造過(guò)程中最重要的一類(lèi)功能微生物之一[8]。優(yōu)良己酸菌有助于窖泥質(zhì)量和基酒品質(zhì)的提升。本文對(duì)己酸菌的篩選、己酸菌的產(chǎn)酸途徑、己酸菌與其他釀酒微生物之間的互作以及己酸菌在濃香型白酒生產(chǎn)中的應(yīng)用等方面進(jìn)行綜述，以期能夠以更加科學(xué)的方式將己酸菌應(yīng)用于生產(chǎn)，提高濃香型白酒的品質(zhì)。

1 己酸菌的研究情況

1.1 己酸菌篩選

己酸菌是一類(lèi)能夠以乙醇、乳酸、葡萄糖等為碳源，代謝合成己酸的一類(lèi)微生物的統(tǒng)稱(chēng)。目前，已經(jīng)從窖泥、牛胃、酒糟等篩選出的產(chǎn)己酸菌株主要包括梭菌屬（Clostridium）、瘤胃菌科（Ruminococcaceae）、巨球型菌屬（Megasphaera）、芽孢桿菌屬（Bacillus）等[9-12]，具體信息見(jiàn)表1。

表1 己酸菌的篩選Table 1 Screening of hexanoic acid bacteria

1.2 己酸菌的產(chǎn)酸途徑

研究表明，己酸菌主要以乙醇、乳酸、葡萄糖為電子供體通過(guò)逆β氧化途徑產(chǎn)生己酸[22-25]。己酸合成途徑如圖1所示。以乙醇為碳源合成己酸一般分為三步：乙醇的氧化、丁酸的形成、己酸的形成。在步驟1中6分子乙醇有1分子氧化為乙酸提供腺苷三磷酸（adenosine-triphosphate，ATP），另外5分子氧化為乙酰輔酶A通過(guò)逆β氧化途徑參與碳鏈的延伸，乙醇氧化也為逆β氧化途徑提供二氫煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（dihydronicotinamide adenine dinucleotide，NADH）。在步驟2中乙酰輔酶A經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)生成丁酰輔酶A，然后丁酰輔酶A和乙酸在?；o酶A轉(zhuǎn)移酶的作用下生成丁酸。在步驟3中乙酰輔酶A和丁酸結(jié)合，碳鏈進(jìn)一步延長(zhǎng)合成己酸[26]。以乳酸和葡萄糖為碳源合成己酸時(shí)，代謝途徑可能和以乙醇為底物時(shí)類(lèi)似[27]。

圖1 己酸的合成途徑Fig.1 Synthesis pathway of hexanoic acid

2 己酸菌與其他微生物間的相互作用

在濃香型白酒生態(tài)系統(tǒng)中，微生物種類(lèi)繁多，己酸菌在濃香型白酒生產(chǎn)中避免不了被其他微生物的生長(zhǎng)代謝所影響，因此除了需要研究溫度、pH、維生素C（vitamin C，VC）、碳酸鈣、乙醇等各種因素對(duì)己酸菌生長(zhǎng)代謝的影響外[28-29]，還需要探究己酸菌與其他釀酒微生物之間的生長(zhǎng)代謝關(guān)系，這對(duì)己酸菌在濃香型白酒生產(chǎn)中的應(yīng)用是非常有必要的。

2.1 己酸菌與其他微生物互作的分析方法

在濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中，參與發(fā)酵的微生物種類(lèi)繁多，己酸菌與其他釀酒微生物之間逐漸形成了競(jìng)爭(zhēng)或者互利共生關(guān)系，微生物之間的相互作用逐漸形成了一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的釀酒微生物群落，對(duì)提高白酒的品質(zhì)起著關(guān)鍵的作用。目前，關(guān)于濃香型白酒中釀酒微生物的相互作用的研究主要通過(guò)氣質(zhì)、氣相、高效液相色譜檢測(cè)發(fā)酵液中物質(zhì)的變化差異，來(lái)推測(cè)其之間的互作機(jī)理，如通過(guò)氣相色譜測(cè)定單菌和混菌發(fā)酵液中己酸含量變化，推測(cè)它們之間相互促進(jìn)或抑制。也可以通過(guò)高通量測(cè)序，分析它們之間的相關(guān)性，來(lái)確定它們之間是相互促進(jìn)還是相互抑制。如通過(guò)共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)梭菌綱（Clostridia）、擬桿菌綱（Bacteroidia）、甲烷桿菌綱（Methanobacteria）和甲烷微菌綱（Methanomicrobia）之間存在大量顯著的正相關(guān)或負(fù)相關(guān)。

2.2 己酸菌與其他釀酒微生物的共培養(yǎng)

2.2.1 己酸菌與酵母菌共培養(yǎng)

研究發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母與己酸菌共培養(yǎng)可有效促進(jìn)己酸生產(chǎn)。晉湘宜等[30]篩選了一株葡萄糖抑制性的己酸菌，將己酸菌與酵母菌混合培養(yǎng)時(shí)，有助于己酸菌的提前形成，這是因?yàn)獒劸平湍负图核峋炀囵B(yǎng)時(shí)，釀酒酵母可以?xún)?yōu)先利用氧氣為己酸菌提供一個(gè)厭氧環(huán)境，與此同時(shí)，酵母菌還可以?xún)?yōu)先利用葡萄糖，緩解葡萄糖對(duì)己酸菌的抑制作用。嵇翔等[31]同樣將克氏梭菌8022與釀酒酵母進(jìn)行了混合培養(yǎng)，不僅縮短了發(fā)酵周期而且己酸產(chǎn)量從6.35 g/L提高至7.09 g/L，分析是由于釀酒酵母的存在為己酸菌的生長(zhǎng)提供了厭氧環(huán)境，提高了己酸菌從乙酸到己酸的轉(zhuǎn)化速率。通過(guò)釀酒酵母與己酸菌的共培養(yǎng)初步探究出酵母菌促進(jìn)己酸菌生長(zhǎng)代謝可能是由于釀酒酵母對(duì)氧氣的消耗以及生長(zhǎng)代謝所產(chǎn)生的乙醇可以為己酸菌生長(zhǎng)代謝提供適量碳源造成的。

2.2.2 己酸菌與乳酸菌共培養(yǎng)

魏翠翠等[32]研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃菌（CPB6）能高效利用乳酸生產(chǎn)己酸，但其利用葡萄糖生產(chǎn)己酸能力較差，增加了發(fā)酵成本。采用CPB6與植物乳桿菌（RJ25）共培養(yǎng)，兩種菌共培養(yǎng)時(shí)利用葡萄糖生產(chǎn)己酸17.794 g/L，是CPB6單菌種利用葡萄糖生產(chǎn)己酸（7.726 g/L）的2.3倍，己酸生產(chǎn)效率由21.77%提升至48.37%。這是因?yàn)楫?dāng)以乳酸為碳源的產(chǎn)己菌與乳酸菌共培養(yǎng)時(shí)，乳桿菌（RJ25）可以以葡萄糖為碳源生成乳酸為瘤胃菌（CPB6）產(chǎn)己酸提供碳源。ZHU X Y等[17]從中國(guó)濃香型白酒生態(tài)系統(tǒng)中富集到了一種獨(dú)特的微生物組，該微生物組以乳酸為碳源生產(chǎn)己酸。該發(fā)酵微生物組可以利用乳酸生成高達(dá)23.41 g/L己酸，比目前任何單一純化己酸菌株產(chǎn)量都要高，這一結(jié)果再一次證明了多菌種混合發(fā)酵對(duì)己酸菌的產(chǎn)量是有益的。

2.2.3 己酸菌與互營(yíng)球菌共培養(yǎng)

孫紅等[33]為了研究濃香型白酒生態(tài)系統(tǒng)中主要功能菌的相互作用，將互營(yíng)球菌（N.902）與梭菌（C.901）共培養(yǎng)，結(jié)果表明，互營(yíng)球菌（N.902）對(duì)梭菌（C.901）的生長(zhǎng)和代謝具有顯著促進(jìn)作用，共培養(yǎng)過(guò)程中除了葡萄糖的消耗量增加，生物量增加外，C.90l的丁酸和己酸積累量分別增加0.44和0.63倍左右。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)互營(yíng)球菌（N.902）的產(chǎn)物為乙酸和乙醇，乙酸和乙醇都可以作為梭菌（C.901）逆β逆氧化途徑的底物，這可能是互營(yíng)球菌（N.902）促進(jìn)梭菌（C.901）提高己酸的主要原因。

2.2.4 不同來(lái)源己酸菌的共培養(yǎng)

來(lái)源不同的濃香型白酒窖泥中己酸菌的種類(lèi)和特點(diǎn)各不相同，人們對(duì)它們之間的相互關(guān)系了解不多，因此對(duì)不同來(lái)源的己酸菌進(jìn)行互作探究對(duì)己酸菌產(chǎn)酸的提升是有意義的。趙德義等[34]將不同來(lái)源己酸菌分別進(jìn)行單獨(dú)和混菌培養(yǎng)，第10天測(cè)定己酸含量發(fā)現(xiàn)，己酸菌單獨(dú)發(fā)酵最高產(chǎn)量2 930.4 mg/L，比它們混合培養(yǎng)時(shí)己酸的產(chǎn)量3 365.6 mg/L要低。這表明將不同來(lái)源的己酸菌菌液混合培養(yǎng)可以促進(jìn)不同窖泥微生物之間相互作用從而促進(jìn)己酸菌的生長(zhǎng)和代謝。

2.2.5 己酸菌與放線(xiàn)菌的共培養(yǎng)

郭威等[35-36]通過(guò)篩選，從窖泥中篩選獲得一株優(yōu)良放線(xiàn)菌GW01，與己酸菌混合培養(yǎng)發(fā)酵比己酸菌純種發(fā)酵產(chǎn)酸量提高約31%。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，放線(xiàn)菌能夠提高己酸菌產(chǎn)酸量與放線(xiàn)菌所產(chǎn)黑色素有關(guān)，黑色素對(duì)己酸菌代謝的促進(jìn)機(jī)理，這一結(jié)果可能和馬榮山[37]研究發(fā)現(xiàn)，在白酒發(fā)酵過(guò)程中添加適量維生素C（vitamin C，VC）可以提高己酸產(chǎn)量的機(jī)理是相同的。欒興社等[38]同樣也發(fā)現(xiàn)了一種鏈霉菌與己酸菌共培養(yǎng)時(shí)，對(duì)己酸菌產(chǎn)己酸具有促進(jìn)作用，且該菌具有較強(qiáng)的利用硫和硫化物的能力，提高了酒品質(zhì)并為窖泥脫臭提供了新的生物技術(shù)。這表明，不同類(lèi)型的放線(xiàn)菌所產(chǎn)生的一些物質(zhì)可能對(duì)己酸菌產(chǎn)量的提高有不同的影響。因此，研究己酸菌與放線(xiàn)菌之間的相互關(guān)系，對(duì)提高濃香型白酒品質(zhì)具有一定的意義。

2.2.6 己酸菌與丁酸菌的共培養(yǎng)

丁酸菌和己酸菌是提供濃香型白酒主要風(fēng)味物質(zhì)的兩種功能微生物，對(duì)濃香型白酒品質(zhì)起著關(guān)鍵的作用，因此，探究丁酸菌與己酸菌的相互作用及機(jī)理是非常有必要的。萬(wàn)朕等[39]研究發(fā)現(xiàn)，將己酸菌與丁酸菌以1∶1的配比共培養(yǎng)時(shí)，己酸菌的己酸產(chǎn)量提高50%左右。丁酸是己酸菌合成己酸的前體物質(zhì)，己酸菌發(fā)酵時(shí)添加適當(dāng)?shù)亩∷峋?，可以為己酸菌提供一定量的丁酸作為合成己酸的前體物質(zhì)，從而使己酸菌的代謝產(chǎn)量提高。

3 己酸菌在濃香型白酒生產(chǎn)中的應(yīng)用

3.1 在窖泥中的應(yīng)用

窖泥質(zhì)量關(guān)系著濃香型白酒的質(zhì)量，窖泥中的微生物是產(chǎn)生白酒中風(fēng)味酯的關(guān)鍵前體物質(zhì)。天然窖泥的成熟時(shí)間超過(guò)20年，而且窖池在生產(chǎn)發(fā)酵過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致窖池中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸減少，微生物代謝所產(chǎn)生的有害物質(zhì)逐漸增加，使窖池中的有益微生物數(shù)量減少，從而導(dǎo)致釀造出來(lái)的濃香型白酒風(fēng)味不夠、口感欠佳。隨著人們對(duì)窖泥中微生物群落變化的研究，分析并篩選出了窖泥中優(yōu)勢(shì)菌屬-己酸菌，促使人們將己酸菌應(yīng)用于人工窖泥的構(gòu)建、窖池的養(yǎng)護(hù)等方面[40-42]。

3.1.1 在人工窖泥中的應(yīng)用

人工窖泥的構(gòu)建大部分是將分離出的己酸菌菌液加入窖泥、黃土、老窖泥、曲粉等中，并按照一定配比混合[43]。魯少文等[44]將以乳酸為碳源的瘤胃科梭菌（CPC-11）制作人工窖泥，并投入生產(chǎn)發(fā)酵35 d，在21 d時(shí)己酸含量達(dá)到最高，比初始含量提高了1.2倍，在35 d時(shí)己酸乙酯含量比初始含量提高了2.74倍。馬玉磊等[45]通過(guò)向人工窖泥中添加己酸菌液，使人工窖泥中己酸乙酯的含量最終為0.5 mg/g干土，有效的提高了窖泥的品質(zhì)。路振華[43]將己酸菌培養(yǎng)液和酯化紅曲加入人工窖泥中，用以提高濃香型白酒品質(zhì)。綜上所述，在人工窖泥制作中加入己酸菌，可以使己酸菌快速形成優(yōu)勢(shì)菌群，加速人工窖池老熟，從而提高濃香型白酒中己酸乙酯含量。人工窖泥構(gòu)建工藝流程如下：

3.1.2 在養(yǎng)窖護(hù)窖中的應(yīng)用

張家慶[46]將實(shí)驗(yàn)室制備的己酸菌液、酯化液黃水等按照一定比例配制窖池養(yǎng)護(hù)液，密封培養(yǎng)5 d后應(yīng)用于退化窖池，酒質(zhì)分析結(jié)果表明，養(yǎng)護(hù)后的退化窖池所產(chǎn)酒質(zhì)的己酸乙酯、總酸、總酯相對(duì)養(yǎng)護(hù)前提升比例分別為42.7%、16.2%、37.5%。王鑫[47]通過(guò)前期恢復(fù)生產(chǎn)的窖池及新啟用的窖池兩方面分析，用己酸菌液潑灑窖池，對(duì)窖池窖泥進(jìn)行養(yǎng)護(hù)，且得到較好成效。在保證出酒率正常，優(yōu)級(jí)酒率提高的同時(shí)，該廠(chǎng)全年特級(jí)酒產(chǎn)率平均達(dá)10%以上（己酸乙酯350 mg/mL），研究獲得圓滿(mǎn)成功。楊月輪[48]將菌株SLXJNR3-1制備成菌液后，在窖池中應(yīng)用，可以有效地提高窖泥中產(chǎn)己酸菌的數(shù)量水平，促進(jìn)釀造過(guò)程中己酸、丁酸等的生成。徐敬征等[49]確定了最佳比例為己酸菌液30%，丙酸菌液30%，丁酸菌液20%，優(yōu)質(zhì)窖泥培菌液20%。實(shí)踐證明，通過(guò)向退化窖池中加入功能己酸菌液對(duì)窖泥進(jìn)行微生態(tài)的養(yǎng)護(hù)效果是可行的。

3.2 己酸菌在新型白酒中的應(yīng)用

“千年老窖萬(wàn)年糟，好酒全憑窖池老”，這句話(huà)充分體現(xiàn)了窖池在濃香型白酒中的重要性。老窖雖好，但是也存在著一定缺陷，就是窖池的成熟期太長(zhǎng)，這嚴(yán)重影響力濃香型白酒的發(fā)展?，F(xiàn)如今，隨著科技的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)己酸菌是窖池中主要的微生物，是生成己酸乙酯的主體微生物。

研究發(fā)現(xiàn)己酸乙酯是濃香型白酒中的主體香味物質(zhì)，以己酸菌發(fā)酵液和乙醇為底物，在酯化酶的作用下生成己酸乙酯發(fā)酵液[50]，將其運(yùn)用到無(wú)窖泥濃香型曲酒生產(chǎn)中，對(duì)提高白酒品質(zhì)，降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率，具有一定的生產(chǎn)和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。任靜[51]通過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn)確立了己酸菌酯化條件，得到效果與優(yōu)質(zhì)濃香型白酒的四大酯比例相仿的酯化液。四大酯比例為已酸乙酯∶乳酸乙酯∶乙酸乙酯∶丁酸乙酯=1∶0.78∶0.63∶0.08，將酯化液應(yīng)用于新型白酒的生產(chǎn)，代替勾兌白酒的香精香料成分，改善和提高曲酒的品質(zhì)，降低生產(chǎn)成本，有較強(qiáng)的生產(chǎn)實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié)論與展望

己酸菌是濃香型白酒中最重要的功能微生物之一，對(duì)提高濃香型白酒的品質(zhì)起著至關(guān)重要的作用。目前將篩選到的己酸菌主要用于人工窖泥的生產(chǎn)、窖池的養(yǎng)護(hù)、己酸菌發(fā)酵液的酯化等方面提高濃香型白酒品質(zhì)。但是也存在己酸乙酯提高不足，白酒品質(zhì)改善不明顯的問(wèn)題，主要原因可能在于所篩選己酸菌產(chǎn)酸性不高、對(duì)氧氣的耐受性不好、易被其他微生物生長(zhǎng)代謝所影響等。

在濃香型白酒生產(chǎn)過(guò)程中微生物種類(lèi)繁多，己酸菌不可避免會(huì)被其他微生物的生長(zhǎng)代謝所影響，研究己酸菌與其他釀酒微生物之間的生長(zhǎng)代謝關(guān)系，是提高己酸產(chǎn)量的關(guān)鍵。

綜上所述，為了提升濃香型白酒品質(zhì)、提高生產(chǎn)效率、降低生產(chǎn)成本，可采取以下措施：①利用微生物之間的相互作用，篩選厭氧性較好的高產(chǎn)己酸菌。②將篩選到產(chǎn)己酸較高的厭氧菌株與窖泥中其他對(duì)濃香型白酒的功能微生物共培養(yǎng)，探究出它們之間相互促進(jìn)或抑制的機(jī)理，用于提高己酸產(chǎn)量。③將與己酸菌互作促進(jìn)產(chǎn)己酸的復(fù)合己酸菌液應(yīng)用到濃香型白酒人工窖池的構(gòu)建、窖池的養(yǎng)窖護(hù)窖中以期在短時(shí)間內(nèi)改善窖泥質(zhì)量，以期在短時(shí)間內(nèi)提高濃香型白酒品質(zhì)，降低生產(chǎn)成本。④將高產(chǎn)己酸菌復(fù)合菌液或復(fù)合己酸菌發(fā)酵液酯化后應(yīng)用到新型無(wú)窖泥生產(chǎn)濃香型白酒中，用以提升己酸乙酯含量和白酒品質(zhì)，降低生產(chǎn)成本，提高白酒產(chǎn)量。