SFOD-LPME-HPLC法測定白酒中甘草酸、甘草次酸

黃 媛，洪 麗，黃何何，潘 城，胡朝陽，蔡小明*

（福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院 國家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，福建 福州 350001）

白酒被譽(yù)為世界六大蒸餾酒之一[1]，源自我國傳統(tǒng)的釀造工藝，具有醇香甜美的獨(dú)特口感。而現(xiàn)代生產(chǎn)工藝追求效益，大多發(fā)酵時(shí)間短，在白酒制作過程中產(chǎn)生多元醇或酮等天然甜味物質(zhì)一般都達(dá)不到理想的效果，部分不良商家為了以次充好，在白酒中添加甜味劑來掩蓋苦味[2]。我國標(biāo)準(zhǔn)GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中明確規(guī)定，白酒中不得添加任何甜味劑[3]。關(guān)于白酒中檢出甜蜜素、糖精鈉、安賽蜜等常見甜味劑的報(bào)道屢見不鮮[4-6]，隨著近幾年監(jiān)管的加強(qiáng)，對于白酒中違規(guī)添加人工甜味劑的現(xiàn)象已經(jīng)越來越受到重視，為了逃避監(jiān)管，商家極可能選擇新型的不在監(jiān)測范圍內(nèi)的甜味劑進(jìn)行使用[7]。因此對于能夠應(yīng)用于白酒中的天然甜味劑也應(yīng)當(dāng)引起相關(guān)部門的關(guān)注與重視。

甘草酸（glycyrrhizin，GA）、甘草次酸（glycyrrhetinic acid，GTA）屬于三萜類化合物，甜度約為蔗糖的80～300倍[8]。因其高甜、低熱、安全的特點(diǎn)，在食品工業(yè)中作為甜味劑得到了廣泛的應(yīng)用[9-10]。鑒于其優(yōu)越的甜度，在食品中添加少量即可達(dá)到口感需求。目前，食品中甘草酸、甘草次酸檢測參考依據(jù)是SN/T 3854—2014《出口食品中天然甜味劑甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、甘草酸、甘草次酸的測定》[11]，該方法前處理繁雜，且檢出限高。報(bào)道顯示，白酒中檢出的甜味劑往往是少量，甚至微量，使用現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法難以滿足行業(yè)的檢測需求。目前關(guān)于甘草酸、甘草次酸的研究大多在其藥理學(xué)及臨床學(xué)等領(lǐng)域，有關(guān)含量檢測的相關(guān)報(bào)道較少。而白酒中甜味劑檢測方法的研究大多集中于高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[12-14]，該方法能夠?qū)崿F(xiàn)多種甜味劑的聯(lián)測，可達(dá)到較低的檢出限，但天然甜味劑的檢出限也通常高于人工甜味劑[1]，與市場實(shí)際添加情況相悖。液質(zhì)聯(lián)用法具有強(qiáng)大的定性功能，但由于樣品前處理多采用樣液直接或稀釋后上機(jī)，不可避免產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)，因此在定量上不如高效液相色譜準(zhǔn)確，同時(shí)，液質(zhì)聯(lián)用法對操作人員要求較高，不利于方法的推廣。因此，開發(fā)一種簡單、快速、準(zhǔn)確的方法測定白酒中天然甜味劑成為目前重要的一個研究方向。

漂浮有機(jī)液滴凝固液相微萃取（liquid phase microextraction based on solidification of floating organic drop，SFODLPME）是近幾年液相微萃取技術(shù)中發(fā)展的比較好的一個分支[15-16]，該方法采用小體積有機(jī)試劑作為萃取劑，對萃取供相中的分析物進(jìn)行富集，而后利用萃取劑密度比水小且溶點(diǎn)接近室溫的特性達(dá)到相分離。方法綠色環(huán)保，方便快捷，具有卓越的富集能力，特別適用于痕量物質(zhì)的提取分離，目前已在食品安全檢測領(lǐng)域得到應(yīng)用研究[17-20]。本研究將SFOD-LPME應(yīng)用于白酒中甘草酸、甘草次酸的富集，并聯(lián)合高效液相色譜（HPLC）技術(shù)進(jìn)行測定，為白酒中甜味劑檢測方法的建立及優(yōu)化提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘草酸（純度98%）：成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司；甘草次酸（純度97%）：百靈威科技有限公司；正十一醇（純度＞99%）、正十二醇（純度＞98%）、1,10-二氯葵烷（純度≥99.5%）：上海皓鴻生物醫(yī)藥科技有限公司；丙酮、四氫呋喃、甲醇、乙腈（均為色譜純）、乙醇、鹽酸（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；除特殊說明外，實(shí)驗(yàn)用水均為超純水；白酒樣品：隨機(jī)采購于各大商超及零售店。

1.2 儀器與設(shè)備

WatersARCHPLC超高效液相色譜儀（配備二極管陣列檢測器）：美國Waters公司；RD-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：中譜科技有限公司；HWS-26電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HJ-6A多頭恒溫磁力攪拌器：國華（常州）儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取10 mg甘草酸、甘草次酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于容量瓶中，用甲醇稀釋定容至10 mL，得甘草酸、甘草次酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-18 ℃冷凍保存；根據(jù)需要將標(biāo)準(zhǔn)儲備液用水稀釋至一定濃度作為標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2 樣品處理

準(zhǔn)確移取2 mL白酒置于50 mL玻璃比色管中，于95 ℃水浴10 min，加水溶液20 mL至比色管中進(jìn)行復(fù)溶，渦旋混勻，作為待萃取樣品工作液（即萃取供相）。

SFOD-LPME條件：依次在樣品工作液加入100 μL 1∶1鹽酸溶液（供相溶液pH值約為3）、1.0 g氯化鈉、50 μL四氫呋喃以及40 μL正十二醇，將比色管置于多頭恒溫磁力攪拌器中，在40 ℃攪拌萃取15 min，后停止攪拌，待萃取劑在液面上匯聚成滴，將比色管轉(zhuǎn)移置于冰浴中，待正十二醇凝固后取出，室溫下融化，準(zhǔn)確吸取30 μL萃取劑加入30 μL甲醇混勻后注入色譜系統(tǒng)。

另取20 mL標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行相同的SFOD-LPME萃取過程。

1.3.3 色譜條件

流動相：A相為0.02 mol/L磷酸水溶液，B相為乙腈；梯度洗脫程序見表1；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL，柱溫：35 ℃，檢測波長：254 nm。

表1 液相色譜梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program of liquid chromatography

1.3.4 萃取條件優(yōu)化

取20 mL水溶液作為萃取供相，采用單因素控制變量法，分別考察萃取劑（正十二醇、正十一醇以及1,10-二氯癸烷）、萃取劑體積（30～80 μL）、分散劑（四氫呋喃、乙腈、甲醇、丙酮）、分散劑體積（0～600 μL）、供相溶液中鹽酸添加量（0～250 μL）、氯化鈉添加量（0～2.0 g）、萃取溫度（26～60 ℃）、萃取時(shí)間（5～30 min）對萃取效率的影響，萃取完成后注入色譜系統(tǒng)進(jìn)行測定，記錄峰面積，以峰面積大小作為萃取效率高低的判斷標(biāo)準(zhǔn)，用來確定最佳SFODLPME萃取條件。

1.3.5 方法學(xué)評價(jià)

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、檢出限及定量限

分別取適量甘草酸、甘草次酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用水配制成系列質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液，而后使用最佳的SFOD-LPME條件進(jìn)行萃取，注入色譜系統(tǒng)進(jìn)行分析，得到甘草酸、甘草次酸色譜圖及峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；注入樣品萃取空白，計(jì)算信噪比，分別以3倍信噪比及10倍信噪比對應(yīng)的被測物的濃度值，計(jì)算得該方法的檢出限及定量限。

（2）方法精密度及回收率考察

選取4種不同香型的白酒樣品作為加標(biāo)基質(zhì)，進(jìn)行低、中、高3水平加標(biāo)試驗(yàn)，采用本方法萃取后進(jìn)行測定，計(jì)算精密度試驗(yàn)結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）及平均回收率，進(jìn)而完成該方法精密度及準(zhǔn)確度考察。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

采用Empower色譜工作站進(jìn)行定量分析，Microsoft Excel 2016 統(tǒng)計(jì)分析處理數(shù)據(jù)，Origin 9.5進(jìn)行圖譜處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取條件優(yōu)化

2.1.1 萃取劑的選擇

SFOD-LPME要求萃取劑密度小于水，并且溶點(diǎn)接近室溫，實(shí)驗(yàn)考察了滿足條件的正十二醇、正十一醇以及1,10-二氯癸烷三種試劑對萃取效率的影響。萃取過程顯示，冰浴后，在萃取劑凝固狀態(tài)的完整性上，正十二醇優(yōu)于正十一醇及1,10-二氯癸烷，冰浴凝固速度快，操作方便；而1,10-二氯癸烷萃取完成后，液體略呈白色渾濁狀態(tài)，萃取劑回收較差，可能由于其密度與水最為接近，導(dǎo)致部分滯留于樣品溶液中，與水相分離不完全；且色譜圖結(jié)果顯示，使用正十一醇萃取后，目標(biāo)峰型展寬較大，疑存在萃取干擾。因此選擇最佳萃取劑為正十二醇。

在液相微萃取中，兩相間的傳質(zhì)系數(shù)隨著樣品溶液體積和萃取劑體積的減少而增大[21]，本研究在操作可行的條件下控制樣品溶液體積即萃取供相體積為20 mL，并在此體積下進(jìn)行萃取劑體積的優(yōu)化，取30～80 μL萃取劑進(jìn)行萃取效率的考察，考察萃取劑對富集效果的影響。試驗(yàn)結(jié)果顯示，萃取劑體積越大，相應(yīng)富集倍數(shù)越小，當(dāng)體積為30 μL時(shí)，萃取結(jié)果的平行性較差，萃取劑回收重復(fù)性低，當(dāng)體積達(dá)到40 μL時(shí)，萃取劑回收情況開始呈現(xiàn)穩(wěn)定狀態(tài)，綜合考慮，確定40 μL正十二醇作為萃取劑。

2.1.2 分散劑的選擇

分散劑一般選擇既溶于供相，又溶于萃取相的試劑，可以很好的將互不相溶的兩相進(jìn)行充分的混合，在液相微萃取中起著至關(guān)重要的作用。該研究選取了四氫呋喃、乙腈、甲醇、丙酮四種溶劑為分散劑，以相同的添加量（100 μL）進(jìn)行測試，并以不加分散劑為空白試驗(yàn)，結(jié)果見圖1。選出最佳分散劑后，考察分散劑體積對萃取效果的影響，結(jié)果見圖2。

圖1 分散劑種類對萃取效果的影響Fig.1 Effect of dispersant varieties on extraction efficiency

圖2 分散劑體積對萃取效果的影響Fig.2 Effect of dispersant volume on extraction efficiency

由圖1可知，在不加分散劑的情況下，目標(biāo)物萃取效果明顯很差；而四種溶劑對甘草酸的萃取影響無明顯差異，對甘草次酸的影響較大，其中四氫呋喃對該方法體現(xiàn)出較好的適配性。因此選擇最佳分散劑為四氫呋喃。由圖2可知，隨著四氫呋喃添加量的增大，萃取效率逐漸增大，在分散劑體積為50 μL時(shí)，萃取效果最佳，隨之下降，繼續(xù)增加四氫呋喃添加量，萃取效果稍有增加但整體趨勢趨于平緩。綜合考慮，最終確定最佳分散劑為50 μL四氫呋喃。

2.1.3 鹽酸添加量的選擇

甘草酸由兩分子葡萄糖醛酸和一分子甘草次酸組成，和甘草次酸一樣，水溶液均呈弱酸性。因此，方法保持供相溶液為酸性體系，使目標(biāo)化合物呈分子狀態(tài)，得以快速轉(zhuǎn)移進(jìn)入萃取相中。該研究以20 mL水溶液為供相體系，考察了1∶1鹽酸水溶液的添加量（0～250 μL）對萃取效率的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知，不進(jìn)行供相溶液酸度控制時(shí)，萃取后甘草酸幾乎無響應(yīng)，說明甘草酸完全沒有被富集；隨著鹽酸添加量的增加，萃取效率逐漸增大，到一定程度時(shí)，則呈下降趨勢。當(dāng)添加量為100 μL時(shí)，目標(biāo)化合物富集效果最好，此后隨鹽酸添加量增大而降低，其中甘草次酸降低幅度較大。故確定鹽酸添加量為100 μL。

吉林省、四川省、浙江省等出臺的孤兒救助的社會政策也對孤兒教育做了較為明確的規(guī)定。通過梳理相關(guān)政策可以發(fā)現(xiàn)，對處于義務(wù)教育階段的孤兒，中央及各地方的教育保障政策都很明確，即實(shí)施免費(fèi)義務(wù)教育。而對在普通高中、中等職業(yè)學(xué)校、高等職業(yè)學(xué)校和普通本科高校就讀的孤兒，除了北京提出免收學(xué)費(fèi)、住宿費(fèi)、服務(wù)性費(fèi)用，天津提出免收學(xué)雜費(fèi)外，中央和其他地方只是提出將這部分孤兒優(yōu)先納入資助政策體系。對于成年孤兒在校就讀的，中央和地方文件都只有原則性的規(guī)定，即“孤兒成年后仍在校就讀的，繼續(xù)享有相應(yīng)政策”。由此可見，對于大齡孤兒或者成年孤兒的教育救助或保障政策還需要進(jìn)一步細(xì)化。

圖3 鹽酸添加量對萃取效果的影響Fig.3 Effect of hydrochloric acid addition on extraction efficiency

2.1.4 氯化鈉添加量的選擇

在供相溶液中加入一定量的鹽，可有效抑制目標(biāo)化合物的離子化過程，從而增大富集效應(yīng)。該研究比較了20 mL水溶液為供相體系下氯化鈉添加量為0～2.0 g情況下的萃取效果，結(jié)果見圖4。由圖4可知，隨著氯化鈉添加量的增加，萃取效率有一定改善，當(dāng)添加量為1.0 g時(shí)，甘草酸和甘草次酸均得到了較好的響應(yīng)，說明此時(shí)的鹽析效應(yīng)最有利于萃取的進(jìn)行，而隨著添加量的增大，萃取效率逐漸下降，可能是離子強(qiáng)度過強(qiáng)導(dǎo)致鹽離子在萃取劑中產(chǎn)生了靜電效應(yīng)阻止了目標(biāo)化合物進(jìn)入萃取劑中[22]。故選擇氯化鈉添加量為1.0 g。

圖4 氯化鈉添加量對萃取效果的影響Fig.4 Effect of sodium chloride addition on extraction efficiency

2.1.5 萃取溫度的選擇

溫度提高能夠加快萃取體系中目標(biāo)化合物的轉(zhuǎn)移，加速達(dá)到萃取平衡。實(shí)驗(yàn)從室溫（26 ℃）開始，逐漸升高體系溫度，考察萃取溫度（26～60 ℃）對甘草酸、甘草次酸富集效率的影響，結(jié)果見圖5。由圖5可知，溫度對目標(biāo)化合物萃取效率影響較大，響應(yīng)值隨著溫度增高明顯呈上升趨勢。萃取溫度40 ℃時(shí)，目標(biāo)化合物均得到最佳響應(yīng)，而后下降，疑為溫度過高導(dǎo)致萃取劑揮發(fā)損失，回收率受影響，正十二醇萃取后液滴表面積隨溫度升高而增大，到達(dá)60 ℃時(shí)已呈平鋪狀態(tài)，不利于液滴的分離，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性呈下降趨勢。故確定萃取溫度為40 ℃。

圖5 萃取溫度對萃取效率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on extraction efficiency

2.1.6 萃取時(shí)間的選擇

液相微萃取是目標(biāo)化合物在供相和萃取相之間達(dá)到分配平衡的過程，因此對于萃取時(shí)間的控制尤為重要。時(shí)間過短，萃取未到達(dá)平衡，導(dǎo)致萃取不佳；時(shí)間過長，同樣也會引起萃取劑的損失。實(shí)驗(yàn)考察了萃取時(shí)間5～30 min內(nèi)對萃取效果的影響，結(jié)果見圖6。由圖6可知，隨著萃取時(shí)間的增加，萃取效率先增大后降低。當(dāng)萃取時(shí)間為15 min時(shí)，甘草酸達(dá)到最佳萃取效果；甘草次酸萃取效果在20 min時(shí)達(dá)到最佳，但在15 min時(shí)也達(dá)到了較高水平，考慮到整體實(shí)驗(yàn)效率，盡可能在較短的時(shí)間完成萃取，最終確定萃取時(shí)間為15 min。

圖6 萃取時(shí)間對萃取效果的影響Fig.6 Effect of extraction time on extraction efficiency

2.1.7 驗(yàn)證試驗(yàn)

圖7 標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品中甘草酸及甘草次酸色譜圖Fig.7 Chromatograms of glycyrrhizic acid and glycyrrhetinic acid of standard solution and sample

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及定量限

分別取適量甘草酸、甘草次酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用水配制成質(zhì)量濃度為2.50 ng/mL、5.00 ng/mL、10.0 ng/mL、25.0 ng/mL、50.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，而后使用最佳的SFOD-LPME條件進(jìn)行萃取，并注入色譜系統(tǒng)進(jìn)行分析。使用甘草酸、甘草次酸工作液萃取后峰面積（y）與質(zhì)量濃度（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2。

表2 甘草酸和甘草次酸的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢測限及定量限Table 2 Regression equation, correlation coefficients, linear ranges,detection limits and quantitation limits of glycyrrhizic acid and glycyrrhetinic acid

由表2可知，在2.50～50.0 ng/mL范圍內(nèi)，甘草酸、甘草次酸顯示良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2均為0.999 9。注入樣品萃取空白，計(jì)算信噪比，分別以3倍信噪比及10倍信噪比計(jì)算得該方法的檢出限及定量限，得甘草酸、甘草次酸檢出限為0.004 mg/L，定量限為0.01 mg/L，滿足檢測要求。

2.2.2 方法精密度及回收率考察

方法選取清香型、濃香型、醬香型、米香型四種風(fēng)味的白酒基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，加標(biāo)量分別為0.01 mg/L、0.05 mg/L、0.40 mg/L的3水平3平行試驗(yàn)，按照本方法進(jìn)行萃取分析，加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 白酒中甘草酸、甘草次酸的加標(biāo)回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Standard recovery rates and precision tests of glycyrrhizic acid and glycyrrhetinic acid in Baijiu

由表3可知，清香型白酒回收率在92.1%～97.0%之間，精密度試驗(yàn)結(jié)果RSD在1.59%～5.22%之間；濃香型白酒回收率在90.6%～96.4%之間，精密度試驗(yàn)結(jié)果RSD在2.85%～4.21%之間；醬香型白酒回收率在101.2%～105.0%之間，精密度試驗(yàn)結(jié)果RSD在3.15%～5.68%之間；米香型白酒回收率在89.2%～102.6%之間，精密度試驗(yàn)結(jié)果RSD在2.06%～5.08%之間，四種香型白酒基質(zhì)間加標(biāo)回收結(jié)果均良好，且無明顯差別，說明該方法整體適應(yīng)性較好，受基質(zhì)影響小。總體而言，甘草酸加標(biāo)回收率在89.2%～104.2%之間，甘草次酸加標(biāo)回收率在93.4%～105.0%之間，精密度試驗(yàn)結(jié)果RSD分別在1.59%～5.57%及1.64%～5.68%之間，精密度和回收率均符合檢測要求。

2.3 實(shí)際樣品的測定

對隨機(jī)采購的四種香型共50份白酒樣品進(jìn)行檢測，每份樣品平行測定3次，檢測結(jié)果顯示，樣品中均無甘草酸、甘草次酸檢出。

3 結(jié)論

隨著市場對天然甜味劑的認(rèn)可，其替代傳統(tǒng)甜味劑必然是大勢所趨，雖然甘草酸、甘草次酸作為甜味劑添加在食品中不僅能夠改善口感，還具有營養(yǎng)保健的作用，但是對于白酒行業(yè)來說，這是對傳統(tǒng)工藝的傷害，更是對消費(fèi)者的欺瞞，甚至?xí)l(fā)企業(yè)間不正當(dāng)競爭。因此，對白酒中天然甜味劑含量展開監(jiān)測仍然十分必要。高效天然甜味劑的推廣和使用，將對檢測方法的靈敏度提出更高的要求，同時(shí)也是對白酒中甜味劑違法添加的監(jiān)管提出了一個新的挑戰(zhàn)。本研究建立SFOD-LPME-HPLC法測定白酒中天然甜味劑甘草酸、甘草次酸，方法靈敏度高，操作簡單，富集效果顯著，適用于白酒中微量甘草酸、甘草次酸的分析檢測，可為白酒中添加劑的檢測提供方法參考，有助于建立相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)及預(yù)警機(jī)制，對市場形成更有效的監(jiān)管。