濃香型白酒窖泥中產(chǎn)己酸菌的研究進展

唐偉斌，王海麗，宮彬彬，李 林，王子權(quán)，王夢嬌，錢含微，姚亞輝，許長峰*

（邢臺學院生物科學與工程學院，河北 邢臺 054001）

白酒文化源遠流長，早在4 000～5 000年前的“龍山文化”時期，已有谷物制酒。濃香型作為白酒十二香型中的主要香型，其具備窖香濃郁、綿甜醇厚、香味諧調(diào)、尾味凈爽等特點，深受廣大人民的喜愛。影響白酒風味的因素有濃香型白酒窖泥中微生物、窖泥的理化指標、窖泥年份等[1-3]。己酸乙酯是濃香型白酒的主要風味物質(zhì)，己酸作為己酸乙酯合成的前體，己酸的產(chǎn)量決定著己酸乙酯的產(chǎn)量。而濃香型白酒窖泥中的己酸菌可以產(chǎn)生己酸[4]，對其進行生產(chǎn)工藝優(yōu)化可為濃香型白酒的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考[5]。因此，獲得高產(chǎn)己酸的菌株對于提高濃香型白酒的品質(zhì)具有重要意義。

該文從以下幾個方面綜述了濃香型白酒窖泥中產(chǎn)己酸菌的研究進展，分別為產(chǎn)己酸菌的種類、形態(tài)特征、代謝途徑及分離篩選；不同培養(yǎng)條件如乳酸亞鐵、不同碳源、不同氮源對產(chǎn)己酸菌的影響；產(chǎn)己酸菌與酵母菌、放線菌以及產(chǎn)甲烷菌等不同菌種共培養(yǎng)以及產(chǎn)己酸菌在窖池養(yǎng)護等實際中的應(yīng)用。以期有助于濃香型白酒的提質(zhì)増香。

1 產(chǎn)己酸菌研究概況

1.1 產(chǎn)己酸菌的種類及形態(tài)特征

產(chǎn)己酸菌是一類能夠利用乙醇、葡萄糖、半乳糖等有機碳源產(chǎn)生己酸的微生物統(tǒng)稱。其種類包括梭菌屬（Clostridium）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）等[6-10]。產(chǎn)己酸菌是白酒生產(chǎn)過程中一類非常重要的微生物，其細胞長約1.94～3.35 μm、寬約0.51～0.75 μm，游離孢子呈圓形，寬約0.15～0.18 μm，菌落形態(tài)多樣，適宜在中性偏酸的環(huán)境中生存。產(chǎn)己酸菌種類不同，細胞形態(tài)和菌落特征各異，細胞多為桿狀、梭狀，菌落形態(tài)多為圓形、表面光滑，顏色為白色、黃色或淺黃色。其中芽孢桿菌屬（Bacillus）為厭氧或兼性厭氧，梭菌屬（Clostridium）和埃氏巨型球菌（Megasphaera elsdenii）為嚴格厭氧菌，窖泥、酒糟及牛胃等為缺氧環(huán)境，適宜厭氧己酸菌的生長繁殖。產(chǎn)己酸菌的種類、來源及特征見表1。

表1 產(chǎn)己酸菌種類、來源與特征Table 1 Species, origin and characteristics of caproic acid-producing bacteria

1.2 產(chǎn)己酸菌的代謝途徑

產(chǎn)己酸菌的代謝途徑為梭菌屬代謝途徑（見圖1）。梭菌屬通過逆β氧化途徑產(chǎn)生己酸[15-17]，首先乙醇或乳酸被氧化成乙酰輔酶A（acetyl coenzyme A，acetyl-CoA），繼而與乙酸縮合產(chǎn)生丁酸，丁酸再與另一個乙酰輔酶A縮合產(chǎn)生己酸[18-19]。在此過程中，原料乙酸過量會造成丁酸產(chǎn)量增加，而乙醇過量則會造成己酸含量增加，因此在釀酒過程中應(yīng)注意提升乙醇的含量，以提高白酒品質(zhì)[20-22]。但是謝圣凱等[23]篩選出兩株在不添加乙醇的條件下仍能產(chǎn)生己酸的產(chǎn)己酸菌菌株，證明了產(chǎn)己酸菌產(chǎn)生己酸的代謝不一定要以乙醇為基礎(chǔ)。任聰?shù)萚24]的供試樣品中梭菌屬的豐度約為0.12%，推測該樣品中的主體產(chǎn)己酸菌并不屬于梭菌屬。朱曉軍[17]實驗所用的四川濃香型白酒廠窖泥混菌的己酸產(chǎn)量可達6.68 mg/mL，窖泥熱激混菌特定種屬聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）驗證中，未發(fā)現(xiàn)克氏梭菌（Clostridium kluyveri）基因組。因此在實際的濃香型白酒釀造體系中，可能存在除克氏梭菌逆β氧化以外的其他己酸途徑，但其他己酸代謝途徑還鮮見報道。

圖1 梭菌屬細菌產(chǎn)己酸的代謝途徑Fig. 1 Metabolic pathways of caproic acid production by Clostridium bacteria

1.3 產(chǎn)己酸菌的分離和篩選

產(chǎn)己酸菌多產(chǎn)生孢子，抗熱性強，可在80 ℃熱水中存活，且多為厭氧或兼性厭氧菌，適宜厭氧條件下篩選。產(chǎn)己酸菌的篩選一般先經(jīng)過熱激除去非目標菌株，再通過特制的產(chǎn)己酸菌篩選培養(yǎng)基進行厭氧培養(yǎng)后，采用硫酸銅顏色反應(yīng)初篩，在發(fā)酵液中加入一定量硫酸銅和乙醚，如發(fā)酵液變藍，則初步判斷菌株產(chǎn)己酸。將發(fā)酵液稀釋涂布平板，挑取單菌厭氧培養(yǎng)進行菌種復篩，發(fā)酵液采用氣相色譜或氣質(zhì)聯(lián)用方法測定己酸含量，確定產(chǎn)己酸菌株。楊菁瑾等[25]在瀘州老窖中采用真空干燥法分離出的產(chǎn)己酸菌中芽孢桿菌屬為優(yōu)勢菌屬。彭兵等[26]通過真空干燥法篩選出一株優(yōu)質(zhì)產(chǎn)己酸菌菌株并將其命名為克氏梭菌JZZ，該菌株屬于梭菌屬，己酸產(chǎn)酸量最高可達到4.36 mg/mL。張家慶[27]通過真空干燥法經(jīng)過多次篩選，從優(yōu)質(zhì)老窖泥中分離出一株產(chǎn)己酸菌株，己酸產(chǎn)量可達4.32 mg/mL。張應(yīng)剛[28]利用厭氧滾管方法篩選出產(chǎn)己酸菌梭菌屬菌株JN-1，己酸產(chǎn)量為2.82 mg/mL。劉宏媛等[29]通過真空干燥法在老窖泥中篩選出來適合偏酸環(huán)境的兩株產(chǎn)己酸菌菌株，己酸產(chǎn)量為5.47 mg/mL。朱曉軍[17]在葡萄糖-乙酸鈉-丁酸鈉增強培養(yǎng)基基礎(chǔ)上通過熱激、不熱激對比方法分離出一株葡萄糖營養(yǎng)型的嚴格厭氧的梭菌屬產(chǎn)己酸菌，己酸產(chǎn)量最高為2.75 mg/mL。趙晨婕等[13]在優(yōu)質(zhì)老窖泥中篩選出3株高產(chǎn)己酸菌菌株，其中菌株克氏梭菌A-3具有pH值、溫度、乙醇耐受范圍廣、己酸產(chǎn)量高等優(yōu)良性狀，己酸產(chǎn)量為9.77 mg/mL。

2 不同培養(yǎng)條件對產(chǎn)己酸菌的影響

2.1 乳酸亞鐵對產(chǎn)己酸菌的影響

產(chǎn)己酸菌適宜生長的pH為5.0～7.0，在長時間的白酒生產(chǎn)過程中，發(fā)酵體系的pH值會不斷降低，窖泥表面會變得僵硬，生成以乳酸亞鐵為主的白色結(jié)晶體，這些白色晶體會對產(chǎn)己酸菌的生長和代謝造成不利的影響，己酸產(chǎn)量降低，從而使香味物質(zhì)己酸乙酯減少，酒香降低[30]，且乳酸亞鐵會破壞細菌細胞膜，使細胞內(nèi)含物外泄。孫春麗等[31]對產(chǎn)己酸菌ZH-5進行研究，發(fā)現(xiàn)乳酸亞鐵會抑制細菌的濃度，且濃度越高抑制能力越強。因此，在窖泥的養(yǎng)護過程中應(yīng)注意避免發(fā)酵體系pH值的降低及乳酸亞鐵的生成。崔鳳元等[32]在發(fā)酵體系中添加醋酸鈉可以使體系的pH值升高，延緩乳酸亞鐵的形成，使窖池的環(huán)境更適合產(chǎn)己酸菌生存，產(chǎn)己酸菌數(shù)量增加，己酸乙酯的含量提高0.31 mg/mL。

2.2 不同碳源對產(chǎn)己酸菌的影響

產(chǎn)己酸菌對不同碳源的依賴程度不同。薛正楷等[30]對菌株K-2進行研究，證明其可利用葡萄糖、甘露醇、菊糖、阿拉伯糖、蔗糖等多種碳源生成己酸。謝彪等[33]在對菌種js-22-07進行發(fā)酵條件優(yōu)化的研究中發(fā)現(xiàn)，該菌株利用乙醇作為碳源時，己酸產(chǎn)量顯著高于乙酸、葡萄糖等作為碳源時的己酸產(chǎn)量（P＜0.05）。韓珍瓊等[34]篩選出的產(chǎn)己酸菌在乙醇體積分數(shù)為2%～3%之間時活菌數(shù)較多且生長狀態(tài)良好，當乙醇體積分數(shù)＞6%，產(chǎn)己酸菌生長受到抑制甚至死亡，表明乙醇體積分數(shù)在產(chǎn)己酸菌的生長過程中有一定影響。趙晨婕等[13]篩選出的產(chǎn)己酸菌A-3在乙醇體積分數(shù)為2%時產(chǎn)酸量最高，為6.22 mg/mL。朱曉軍[17]的研究結(jié)果表明，窖泥混菌可以用葡萄糖作為碳源，與乙醇作為碳源對比，己酸產(chǎn)量有顯著提高，最高達6.68 mg/mL。還有研究表明，以葡萄糖作為碳源富集窖泥中產(chǎn)己酸菌菌群的效果較以乳酸作為碳源有顯著提升[35]，這可能是由于不同產(chǎn)己酸菌的碳源代謝途徑和其酶活性導致的。

2.3 不同氮源對產(chǎn)己酸菌的影響

氮元素是生物不可缺少的元素，可組成微生物所必須的氨基酸、蛋白質(zhì)和核酸等物質(zhì)[36]。氮元素可提高產(chǎn)己酸菌的己酸產(chǎn)量。謝彪等[33]篩選自酒窖窖泥的梭狀芽胞桿菌（Bacillus megaterium）以硫酸銨（（NH4）2SO4）作為氮源時產(chǎn)己酸能力較強，而菌株以硝酸鈉（NaNO3）作為氮源時產(chǎn)己酸能力較弱。姚萬春等[37]研究了5種氮源對己酸菌生長和代謝的影響，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)己酸菌可利用有機氮源和（NH4）2SO4，對硝酸鹽的利用較差。任靜等[38]研究了不同氨基酸對產(chǎn)己酸菌產(chǎn)己酸的影響，發(fā)現(xiàn)L-亮氨酸含量為0.2%、L-賴氨酸含量為0.1%時，己酸產(chǎn)量最高為4.77 mg/mL。馬業(yè)準[39]在培養(yǎng)基中加入0.2%的L-亮氨酸或L-賴氨酸使己酸產(chǎn)量增加至4.70 mg/mL。

3 產(chǎn)己酸菌與不同菌種共培養(yǎng)

窖池是一個小的微生態(tài)系統(tǒng)，微生物資源豐富，對產(chǎn)己酸菌的研究不能只局限于菌株自身，對窖泥中其他菌種進行研究也十分重要。隨著微生物的生長，其發(fā)酵體系的溫度、pH、營養(yǎng)物質(zhì)都可能隨之改變，部分菌株可以使發(fā)酵體系朝著更適合產(chǎn)己酸菌生長代謝的方向發(fā)展。但是由于窖泥中的微生物多樣性，人們對產(chǎn)己酸菌與其他菌種之間共同培養(yǎng)的作用機制仍然不了解。因此，有必要對產(chǎn)己酸菌與不同菌種共培養(yǎng)進行研究，以期探究其提高己酸產(chǎn)量的機制。

3.1 產(chǎn)己酸菌與酵母菌共培養(yǎng)

楊愛華等[40]分別將3株產(chǎn)己酸菌與酵母菌混合培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)混合體系的乙酸、丁酸及己酸產(chǎn)量均有顯著提高，后又分別將這3株產(chǎn)己酸菌與酵母粉進行混合發(fā)酵，但總酸產(chǎn)量并沒有提高，可能已酸產(chǎn)量提高不是由于酵母為己酸菌提供營養(yǎng)物質(zhì)的原因。嵇翔等[41]將梭菌屬菌株8022與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）混合培養(yǎng)，總酸產(chǎn)量增加12.5%。產(chǎn)己酸菌為厭氧菌或兼性厭氧菌，白酒發(fā)酵過程中會消耗窖泥中的氧氣，使窖泥形成一種厭氧或半?yún)捬鯛顟B(tài)。窖泥中含有多種微生物，各種微生物協(xié)同合作，共同生長，不適應(yīng)這種環(huán)境的微生物則被淘汰。由于酵母菌的加入使氧氣含量降低，缺氧環(huán)境促進了乙酸縮合成丁酸，丁酸縮合成己酸的過程，從而導致己酸產(chǎn)量提高。

3.2 產(chǎn)己酸菌與放線菌共培養(yǎng)

放線菌為革蘭氏陽性菌，繁殖方式分為孢子繁殖為主，存在于土壤、水以及空氣等地。目前放線菌主要用于抗生素、甾體、抗癌劑、抗寄生蟲劑、維生素、酶、殺蟲劑的生產(chǎn)以及污水處理等方面[42]。濃香型白酒發(fā)酵體系中的放線菌主要由酒曲和窖泥提供，人們在多年以前就發(fā)現(xiàn)了放線菌與產(chǎn)己酸菌共同培養(yǎng)可以使己酸產(chǎn)量提高[43]。因此，研究產(chǎn)己酸菌與放線菌共培養(yǎng)提高己酸產(chǎn)量的機制是白酒提質(zhì)増香的一個重要研究方向。

劉延波等[44]分析了濃香型白酒高溫曲的菌種群落結(jié)構(gòu)，其中放線菌門（Actinobacteria）占3.87%。郭威等[45]篩選出了一株促己酸菌產(chǎn)乙酸且良好適應(yīng)窖池環(huán)境的放線菌菌株，將其命名為GW01。在其后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn)由菌株GW01產(chǎn)生的具有抗氧化作用，能清除自由基的黑色素是己酸產(chǎn)量增加的促進因子。施思等[46]通過放線菌與產(chǎn)己酸菌復配發(fā)酵，證明放線菌通過調(diào)控丙酮酸代謝、硫代謝、糖酵解途徑、苯丙氨酸代謝、淀粉和蔗糖代謝及半乳糖的代謝能夠增加己酸產(chǎn)量降低乳酸產(chǎn)量。有研究表明，放線菌具有蛋白酶活性、纖維素酶活性、淀粉酶活性、明膠酶活性。放線菌能夠利用蛋白酶分解大分子蛋白質(zhì)，形成能被產(chǎn)己酸菌利用的小分子物質(zhì)，促進產(chǎn)己酸菌的生長繁殖，能夠利用纖維素酶分解纖維素產(chǎn)生葡萄糖，利用淀粉酶分解淀粉產(chǎn)生葡萄糖，產(chǎn)己酸菌利用放線菌產(chǎn)生的葡萄糖生成己酸。因此，放線菌與產(chǎn)己酸菌的共培養(yǎng)可提高己酸菌的產(chǎn)酸能力[47]。放線菌與產(chǎn)己酸菌共培養(yǎng)為提高己酸產(chǎn)量提供了新途徑。可篩選、選育具備多種分解酶、高酶活的放線菌應(yīng)用于釀酒以提升白酒品質(zhì)。

3.3 產(chǎn)己酸菌與甲烷菌共培養(yǎng)

甲烷菌是一類嚴格厭氧的原核微生物，無法在有氧氣的環(huán)境中生存，所以甲烷菌分離及培養(yǎng)的難度較大，所需成本也較高。盡管研究產(chǎn)己酸菌與甲烷菌的相互作用較為困難，但是已有關(guān)于其共培養(yǎng)提高己酸產(chǎn)量的研究報道。

甲烷菌和產(chǎn)己酸菌是互利共生關(guān)系，窖泥的好壞不僅與產(chǎn)己酸菌有關(guān)，也與甲烷菌有密切關(guān)系。產(chǎn)己酸菌在生長代謝過程中會生成H2和CO2，它們可以抑制己酸菌的生長繁殖，在嚴格厭氧條件下甲烷菌可以利用其他微生物代謝的乙酸、H2和CO2轉(zhuǎn)化為CH4和水，消除產(chǎn)H2和CO2對己酸菌代謝的抑制作用，使己酸產(chǎn)量提高。張應(yīng)剛[28]在白酒發(fā)酵體系中添加了甲烷菌，使黃水中的己酸、丁酸和乙酸的含量顯著提高，同時還降低了白酒發(fā)酵體系中甲醇的含量，提升了白酒的質(zhì)量。甲烷菌和產(chǎn)己酸菌皆適合厭氧環(huán)境，相比于新窖泥，老窖泥中兩者的含量均呈現(xiàn)增加趨勢。產(chǎn)己酸菌利用乙醇產(chǎn)生丁酸時會產(chǎn)生氫，氫會抑制產(chǎn)己酸菌的生長。甲烷菌能夠利用氫來產(chǎn)生有機物供自身生長，從而解除產(chǎn)己酸菌的氫抑制現(xiàn)象，且產(chǎn)生的甲烷能夠刺激產(chǎn)己酸菌產(chǎn)己酸。產(chǎn)己酸菌與甲烷菌相互耦連，實現(xiàn)“種間氫轉(zhuǎn)移”。由于甲烷菌的存在，窖泥中能夠出現(xiàn)多種產(chǎn)氫型的發(fā)酵反應(yīng)，促進了有機酸的形成，進而促進了己酸乙酯的含量，提高白酒的品質(zhì)。窖泥中甲烷菌和產(chǎn)己酸菌的含量也可以作為窖泥質(zhì)量的判斷標準，窖泥中兩者含量高說明窖泥品質(zhì)較好。

4 產(chǎn)己酸菌的實際應(yīng)用

4.1 產(chǎn)己酸菌使用次數(shù)與復壯對己酸產(chǎn)量的影響

產(chǎn)己酸菌在實際應(yīng)用過程中會逐漸沾染雜菌，這些雜菌會對產(chǎn)己酸菌的生長及代謝產(chǎn)生不利的影響，在多次使用后就需要對其進行熱處理以去除雜菌和復壯。趙德義等[48]指出，一般產(chǎn)己酸菌使用3輪后，雜菌數(shù)量就會顯著增多，導致己酸產(chǎn)量下降，所以每使用3輪左右就需要對產(chǎn)己酸菌進行一次復壯。楊愛華等[40]對3株產(chǎn)己酸菌菌株進行熱處理，初次進行熱處理，產(chǎn)己酸菌數(shù)量會下降，但經(jīng)過多次加熱處理后活菌數(shù)量基本保持不變，己酸產(chǎn)量得以提高。

4.2 產(chǎn)己酸菌在窖池養(yǎng)護中的作用

濃香型白酒是中國白酒中最受消費者喜愛的白酒香型，品質(zhì)優(yōu)良的窖泥可以釀造出更加優(yōu)質(zhì)的白酒。窖泥經(jīng)過長時間的使用會出現(xiàn)板結(jié)、析出以乳酸亞鐵為主的白色結(jié)晶體等退化現(xiàn)象，導致產(chǎn)己酸菌的產(chǎn)酸量下降，甚至會使產(chǎn)己酸菌死亡，使己酸乙酯等香體成分含量降低。為了穩(wěn)定并提高白酒質(zhì)量，就必須對窖泥進行養(yǎng)護，目前高濃度的己酸菌發(fā)酵液已應(yīng)用于窖泥的養(yǎng)護及人工窖泥的快速老熟。

彭兵等[49]采用正交設(shè)計方法，以己酸菌和窖泥復合菌液為菌種，以己酸產(chǎn)量為評價指標，考察營養(yǎng)液初始培養(yǎng)基對己酸產(chǎn)量的影響，獲得了最優(yōu)窖泥營養(yǎng)液配方。桑其明等[50]使用多元化窖泥養(yǎng)護液對新建3年的窖池進行了兩年養(yǎng)護后，新窖泥的理化指標、微生物指標及產(chǎn)酯能力與30年的成熟窖泥的指標相近。杜禮泉等[51]的研究表明，采用己酸菌、液體窖泥菌液∶窖泥復合功能菌液（1∶1）對新窖泥的養(yǎng)護效果最佳；采用己酸菌、液體窖泥菌液∶窖泥復合功能菌液（1∶2）對退化窖泥的養(yǎng)護效果最佳。

窖泥的養(yǎng)護是一個系統(tǒng)性的、長期的工作，并不是所有的窖泥都能在短時間內(nèi)變成優(yōu)質(zhì)的窖泥，應(yīng)當嚴格篩選窖泥及菌種來源，這樣才能更容易培養(yǎng)出更優(yōu)質(zhì)的窖泥，獲得更高質(zhì)量的白酒。然而，即使是非常優(yōu)質(zhì)的窖泥，也不能保證窖泥會一直朝著更優(yōu)質(zhì)的方向轉(zhuǎn)變，只有合理養(yǎng)護窖泥才能使窖泥不退化，更優(yōu)質(zhì)。

5 展望

目前，關(guān)于濃香型白酒窖泥中產(chǎn)己酸菌的研究集中在產(chǎn)己酸菌的分離和篩選、產(chǎn)己酸菌和其他菌種共培養(yǎng)，人工窖泥的老熟以及窖池養(yǎng)護等方面。為提高濃香型白酒窖泥中的產(chǎn)己酸菌產(chǎn)酸能力，可采取以下措施：篩選兼性厭氧型高產(chǎn)己酸菌，選擇鐵離子含量低的土壤制備人工窖泥，適當添加醋酸鈉調(diào)節(jié)pH值，選擇合適的碳源、氮源，調(diào)整產(chǎn)己酸菌與酵母菌、放線菌和甲烷菌的共培養(yǎng)比例。在實際生產(chǎn)中注意窖泥的工作，提升己酸產(chǎn)量和白酒品質(zhì)，降低研發(fā)成本。