基于兩步法制備生物發(fā)酵蛋白工藝的研究

蔡 吉，陳文聰，劉 軍*，李 麗，張桂容，附俊杰，馮潔雅，2，劉雪嬌，2

（1.四川輕化工大學 生物工程學院，四川 宜賓 644005；2.四川省綿陽市豐谷酒業(yè)有限責任公司，四川 綿陽 621000）

菜籽粕是油菜籽提取菜籽油后得到的一種副產(chǎn)品，我國自20世紀80年代開始，每年產(chǎn)生超過600萬t的菜籽粕，其粗蛋白含量約為35%～45%，且氨基酸較為平衡，是一種物美價廉的植物蛋白資源[1-3]。豆粕是經(jīng)過大豆提取豆油后得到的一種副產(chǎn)品，其產(chǎn)量巨大、營養(yǎng)豐富，目前仍是動物飼料的主要原料，但近年來對豆粕需求的不斷增加導致市場供應需求緊張，為緩解供應緊張、降低成本，已將菜籽粕用于畜牧行業(yè)中以減少或替代豆粕使用[4]。與豆粕相比，菜籽粕的維生素B1（vitamin B1，VB1）、VB2、膽堿、煙酸、生物素和鈣、磷、硒等礦物質元素含量較高，特別是無機磷[5]。但菜籽粕中含有大量的抗營養(yǎng)因子，如硫苷（glucosinolates，GLS）、芥子堿和單寧等。硫苷會在芥子酶的作用下水解生成嗯唑烷硫酮、異硫氰酸酯、腈等有毒物質，長期攝入會造成動物的腎臟、肝臟等內(nèi)臟器官的損害和腫大[6]。因此，要想提高菜籽粕的蛋白利用率就必須消除其主要的抗營養(yǎng)因子。微生物發(fā)酵技術能有效去除多種餅粕中的抗營養(yǎng)因子[7]，從而達到降解和排毒的目的。此外，微生物發(fā)酵還能夠生成大量的菌體蛋白和一些促進動物腸道內(nèi)有益菌群生長的活性物質[8]。如司馬博鋒等[9]以棉粕、菜籽粕和豆粕為原料，發(fā)酵制備的發(fā)酵蛋白，將粗蛋白含量提高了9%，氨基酸含量提高了11.6%，同時抗營養(yǎng)因子游離棉酚降解了45.4%，異硫氰酸酯降解了27.8%。

發(fā)酵、酶解兩步法充分利用了微生物在發(fā)酵過程中產(chǎn)生酶，無需使用外源酶制劑，生物資源的利用達到最大化，可有效改善低質原料蛋白質品質，降解原料中的抗營養(yǎng)因子，完善氨基酸組成，降低生產(chǎn)成本，改善原料的適口性，提高動物的采食率。相比傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵，固態(tài)發(fā)酵、酶解兩步法大幅縮短了處理時間，減少了對固態(tài)發(fā)酵條件的控制依賴，使得終產(chǎn)物得率不僅僅依賴于發(fā)酵過程，增大了固態(tài)發(fā)酵的應用范圍。因此，本試驗利用米曲霉（Aspergillus oryzae）發(fā)酵糧油提取副產(chǎn)物—菜籽粕與豆粕兩種蛋白原料，充分利用植物資源，以期為食品行業(yè)增加產(chǎn)品附加值的同時，為飼料行業(yè)提供一種成本低、動物適口性佳、營養(yǎng)組成合理的新型蛋白原料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米曲霉（Aspergillus oryzae）M1：本實驗室保藏。

菜籽粕、豆粕、麩皮、玉米蛋白粉：樂山恒峰華邦科技有限公司。

麩皮種子培養(yǎng)基：麩皮∶水=2∶1（W/W）。

葡萄糖、蔗糖、硫酸鉀、硫酸鎂、吐溫-80、乙酸鈉、氯化鈀、羧甲基纖維素鈉、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、氫氧化鈉、硼酸、硫酸銅（均為分析純）、酵母浸粉、牛肉膏（均為生化試劑）：成都科龍化工試劑廠；黑芥子硫苷酸鉀（分析純）：上海源葉生物有限公司。

1.2 儀器與設備

MF80BSH-2霉菌培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；QYC-2102C恒溫培養(yǎng)搖床：上海福馬實驗設備有限公司；LS-75HD立式高壓蒸汽滅菌鍋：江陰濱江醫(yī)療設備有限公司；T-114分析天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；T6紫外-可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；AT-710電位自動滴定計：日本京都電子制造有限公司；SH220F石墨消解儀、K9840自動凱氏定氮儀：海能未來技術集團股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 米曲霉麩皮種子制備

使用接種環(huán)勾取2～3環(huán)本實驗室保藏的米曲霉菌種，接種于裝有25 g麩皮種子培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶，30 ℃恒溫培養(yǎng)72 h。

1.3.2 發(fā)酵蛋白原料組成優(yōu)化

將發(fā)酵蛋白原料（菜籽粕、豆粕、玉米蛋白粉）以不同組成（60%、30%、10%；60%、40%、0；70%、25%、5%；70%、20%、10%；70%、30%、0；80%、15%、5%；80%、10%、10%；80%、20%、0）混合均勻，吐溫-80溶解于1 000 mg/L的過氧乙酸溶液（溫度約50 ℃），吐溫-80含量為800 mg/L。用上述溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵蛋白原料初始含水量為45%，靜置滅菌30 min后，取150 g發(fā)酵蛋白原料裝于2 L錐形瓶中，接種3%米曲霉麩皮種子，搖勻，棉花塞封口，30 ℃發(fā)酵48 h。發(fā)酵結束，取140 g發(fā)酵樣品，調(diào)節(jié)初始含水量為60%，密封，45 ℃酶解24 h，后70 ℃烘干24 h，粉碎后過40目篩網(wǎng)，測定樣品蛋白溶解度、酸溶蛋白/粗蛋白及硫苷含量。

1.3.3 固態(tài)發(fā)酵蛋白培養(yǎng)條件優(yōu)化

確定發(fā)酵蛋白原料組成后，分別對發(fā)酵過程中麩皮種子接種量（1%、2%、3%、4%、5%）、發(fā)酵時間（24 h、32 h、40 h、48 h、56 h）、發(fā)酵原料初始含水量（30%、35%、40%、45%、50%）、發(fā)酵溫度（26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃）進行優(yōu)化。固態(tài)發(fā)酵結束后按1.3.2的條件酶解，測定樣品蛋白溶解度、酸溶蛋白/粗蛋白及硫苷含量。

在單因素試驗的基礎上，選取影響顯著的3個主要因素接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）及發(fā)酵時間（C），設計3因素3水平正交試驗，對固態(tài)發(fā)酵蛋白培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，正交試驗因素與水平見表1。固態(tài)發(fā)酵結束后按1.3.2的條件酶解，測定樣品蛋白溶解度、酸溶蛋白/粗蛋白及硫苷含量。

表1 固態(tài)發(fā)酵蛋白培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for optimization of protein culture conditions by solid-state fermentation

1.3.4 酶解條件優(yōu)化

對優(yōu)化培養(yǎng)條件的發(fā)酵樣品進行酶解條件優(yōu)化。分別考察酶解時間（20 h、24 h、28 h、32 h、36 h、40 h）、酶解樣品初始含水量（45%、48%、50%、52%、54%、56%、58%、60%）、酶解溫度（40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃）對酶解效果的影響，樣品于70 ℃烘干24 h，粉碎后過40目篩網(wǎng)，測定樣品蛋白溶解度、酸溶蛋白/粗蛋白及硫苷含量。

1.3.5 測定方法

粗蛋白：根據(jù)GB/T 6432—2018《飼料中粗蛋白的測定凱氏定氮法》測定[10]；蛋白溶解度：根據(jù)GB/T 19541—2017《飼料原料豆粕》氫氧化鉀蛋白溶解度的測定[11]；酸溶蛋白：采用參考文獻[12]的三氯乙酸沉淀法測定；硫苷（GLS）測定：采用參考文獻[13]的氯化鈀比色法測定。氨基酸測定：采用GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》測定[14]。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2016數(shù)據(jù)整理，使用SPSS 23對數(shù)據(jù)進行分析，多組數(shù)據(jù)使用單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA），以Duncan檢驗法進行多重比較，以P＜0.05作為差異性顯著判斷標準，試驗結果采用“平均值±標準差”表示，數(shù)值標注不同字母表明差異性顯著，采用Origin 2018和Microsoft Excel 2016作圖。

2 結果與分析

2.1 原料組成對發(fā)酵蛋白品質的影響

酸溶蛋白主要由小分子菜籽粕肽和游離氨基酸組成，其中小肽由2～20個氨基酸組成，是酸溶蛋白中的主要成分，分子質量均低于6 000 Da[13]，酸溶蛋白含量越高表明其中小肽和游離氨基酸含量也越高[15-16]，其中游離氨基酸和部分小肽可被直接吸收利用[17]。如YAMADA Y等[18-19]分別從菜籽粕水解物中分離出具有降壓活性的三肽，其氨基酸序列分別為Arg-Ile-Tyr和Gly-His-Ser，均具有較好的降壓效果。酸溶蛋白含量可以有效反映蛋白原料質量的高低。油菜籽經(jīng)過壓榨或其他熱處理方式分離油脂與菜籽蛋白時，高溫會使菜籽蛋白受到不同程度的不可逆轉的熱變。熱反應會使蛋白溶解度下降，原因為高溫使蛋白發(fā)生解離，疏水基團暴露蛋白結構性展開，疏水性的增加引起蛋白溶解度下降[20]。但蛋白溶解也受到處理方式的變化存在差異，有時高熱變性也具有較高的蛋白溶解度[21]。原料組成對發(fā)酵蛋白品質的影響見表2。由表2可知，當原料組成為70%菜籽粕+30%豆粕時，其蛋白溶解度為70.26%，顯著高于其他組（P＜0.05）；酸溶蛋白/粗蛋白的比值也較高，硫苷含量較低。因此，確定發(fā)酵蛋白原料組成為70%菜籽粕+30%豆粕。

表2 原料組成對發(fā)酵蛋白品質的影響Table 2 Effect of raw material composition on fermented protein quality

2.2 固態(tài)發(fā)酵蛋白培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.2.1 接種量對發(fā)酵蛋白品質的影響

由圖1可知，隨著米曲霉麩皮種子接種量的增加，發(fā)酵蛋白的蛋白溶解度、硫苷含量先升高后降低，酸溶蛋白/粗蛋白變化不大。當接種量為3%時，蛋白溶解度最高，酸溶蛋白/粗蛋白較高且差異不顯著（P＞0.05），硫苷含量較低且差異不顯著（P＞0.05）。原因可能是適當增加接種量，由于培養(yǎng)基中產(chǎn)酶增加而蛋白溶解度得到有效改善；但當接種量＞3%時，原料中溶氧不足，降解大分子蛋白與硫苷的酶合成受到一定影響[22]。因此初步確定最優(yōu)米曲霉麩皮種子接種量為3%。

圖1 接種量對發(fā)酵蛋白品質的影響Fig.1 Effect of inoculum on fermented protein quality

2.2.2 發(fā)酵時間對發(fā)酵蛋白品質的影響

由圖2可知，隨發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵蛋白的蛋白溶解度與酸溶蛋白/粗蛋白先升高后降低，硫苷含量升高。在發(fā)酵40 h時，蛋白溶解度較高且差異不顯著（P＞0.05），酸溶蛋白/粗蛋白最高且差異顯著（P＜0.05），硫苷含量較低且差異不顯著（P＞0.05）?？赡苁且驗殡S發(fā)酵時間的延長，酶的活性受到影響，從而使酶解階段的硫苷降解率減少。因此初步確定最優(yōu)發(fā)酵時間為40 h。

圖2 發(fā)酵時間對發(fā)酵蛋白品質的影響Fig.2 Effect of fermentation time on fermented protein quality

2.2.3 發(fā)酵原料初始含水量對發(fā)酵蛋白品質的影響

由圖3可知，隨著發(fā)酵原料初始含水量的增加，蛋白溶解度、酸溶蛋白/粗蛋白呈上升趨勢，而硫苷呈現(xiàn)下降趨勢；且在水分為45%時，酸溶蛋白/粗蛋白含量最高，為51.83%，但當發(fā)酵水分＞45%后，蛋白溶解度、酸溶蛋白/粗蛋白開始降低，硫苷升高，且差異顯著（P＜0.05）。據(jù)相關文獻報道，米曲霉在曲料上充分生長發(fā)育產(chǎn)生醬油發(fā)酵所需要的中性及酸性蛋白酶類、氨肽酶、淀粉酶、糖化酶、纖維素酶等[23]。酶產(chǎn)量及活性與微生物生長代謝狀況直接相關，水分過高影響培養(yǎng)基中的疏松程度，溶氧量低，會抑制纖維素酶和硫苷水解酶等的產(chǎn)量，從而導致后續(xù)酶解階段對硫苷的降解減弱，而水分過低又會影響麩皮中的活化萌發(fā)速度，延遲發(fā)酵時間。因此初步確定最優(yōu)發(fā)酵原料初始含水量為45%。

2.2.4 發(fā)酵溫度對發(fā)酵蛋白品質的影響

由圖4可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵蛋白的蛋白溶解度和酸溶蛋白/粗蛋白均先升高后降低，硫苷含量升高。在發(fā)酵溫度28 ℃時，蛋白溶解度和酸溶蛋白/粗蛋白均達到最高且差異顯著（P＜0.05），硫苷含量較低且差異不顯著（P＞0.05）?？赡苁?8 ℃時蛋白酶的產(chǎn)量和酶活力相對較高，硫苷水解酶最適作用溫度為40～60 ℃，發(fā)酵溫度未能達到，主要依靠酶解階段進行降解。因此初步確定最優(yōu)發(fā)酵溫度為28 ℃。

2.2.5 固態(tài)發(fā)酵蛋白培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗

由表3可知，3個因素對發(fā)酵蛋白蛋白溶解度的影響主次順序為B＞C＞A；對酸溶蛋白/粗蛋白的影響主次順序為C＞B＞A。以蛋白溶解度、酸溶蛋白/粗蛋白為考察指標時的最優(yōu)組合均為A2B2C2，即接種量為3%、發(fā)酵溫度為28 ℃、發(fā)酵時間為40 h。在此條件下，發(fā)酵蛋白的蛋白溶解度為63.54%，酸溶蛋白/粗蛋白為47.56%，硫苷含量為14.13μmol/g。

表3 固態(tài)發(fā)酵蛋白培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for optimization of protein culture conditions by solid-state fermentation

2.3 酶解條件優(yōu)化

2.3.1 酶解時間對發(fā)酵蛋白品質的影響

由圖5可知，隨著酶解時間的延長，蛋白溶解度和酸溶蛋白/粗蛋白有小幅升高，但差異不顯著（P＞0.05）；硫苷含量先升高后降低再緩慢升高。在酶解32 h時，硫苷含量達到最低，可能是固態(tài)發(fā)酵過程中產(chǎn)生的分解硫苷的酶類有限，當酶解時間超過32 h，酶活性降低，硫苷降解減弱。綜合考慮，確定最優(yōu)酶解時間為32 h。

圖5 酶解時間對發(fā)酵蛋白品質的影響Fig.5 Effect of enzymolysis time on fermented protein quality

2.3.2 酶解樣品初始含水量對發(fā)酵蛋白品質的影響

由圖6可知，隨酶解樣品初始含水量的增加，發(fā)酵蛋白的蛋白溶解度有小幅度升高后降低，但差異不顯著（P＞0.05），酸溶蛋白/粗蛋白呈升高趨勢且差異顯著（P＜0.05），硫苷含量先降低后升高，但差異不顯著（P＞0.05）。在酶解樣品初始含水量56%時，酸溶蛋白/粗蛋白達最高。水分含量的高低在影響微生物生長的同時，主要影響酶的作用效果，酶解樣品初始含水量超過56%時，蛋白酶的活性和穩(wěn)定性下降。綜合考慮，確定最優(yōu)酶解樣品初始含水量為56%。

圖6 酶解樣品初始含水量對發(fā)酵蛋白品質的影響Fig.6 Effect of initial moisture in enzymolysis sample on fermented protein quality

2.3.3 酶解溫度對發(fā)酵蛋白品質的影響

由圖7可知，隨酶解溫度的升高，發(fā)酵蛋白的蛋白溶解度、酸溶蛋白/粗蛋白均先升高后降低，硫苷含量先小幅降低再升高再降低。酶解溫度為50 ℃時，發(fā)酵蛋白的蛋白溶解度、酸溶蛋白/粗蛋白均達最高且差異顯著（P＜0.05），硫苷含量降至最低但差異不顯著（P＞0.05）。綜合考慮，確定最優(yōu)酶解溫度為50 ℃。

圖7 酶解溫度對發(fā)酵蛋白品質的影響Fig.7 Effect of enzymolysis temperature on fermented protein quality

2.4 發(fā)酵蛋白品質及氨基酸含量分析

氨基酸對動物的免疫機能影響重大，缺乏氨基酸動物就會出現(xiàn)生長受阻，胸腺退化，脾臟淋巴細胞分裂降低等現(xiàn)象[24-26]。由表4可知，與未處理的原料相比，發(fā)酵蛋白的蛋白溶解度（65.80%）提高97.49%，酸溶蛋白/粗蛋白（44.13%）提高779.75%，硫苷含量（8.63 μmol/g）降低69.14%。經(jīng)固態(tài)發(fā)酵、酶解后，發(fā)酵蛋白的天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸含量均顯著提高（P＜0.05）。

表4 未處理原料、發(fā)酵蛋白品質及氨基酸含量分析Table 4 Analysis of untreated raw material,fermented protein quality and amino acid content%

3 結論

本研究采用米曲霉固態(tài)發(fā)酵＋酶解的模式對以菜籽粕為主要原料，豆粕為輔助原料的蛋白原料制作工藝參數(shù)進行優(yōu)化，確定最佳發(fā)酵原料組成為70%菜籽粕+30%豆粕；固態(tài)發(fā)酵的最佳條件為發(fā)酵蛋白原料初始含水量45%，米曲霉麩皮種子接種量3%，發(fā)酵時間40 h，發(fā)酵溫度30 ℃；最佳酶解條件為酶解時間32 h，酶解樣品初始含水量56%，酶解溫度50 ℃。在此工藝條件下，發(fā)酵蛋白的蛋白溶解度提高97.49%，酸溶蛋白/粗蛋白提高779.75%，硫苷含量降低69.14%。發(fā)酵、酶解兩步工藝充分利用了微生物在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酶，無需使用外源酶制劑，生物資源的利用達到最大化。相比傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵，固態(tài)發(fā)酵、酶解兩步法大幅縮短了處理時間，減少了對固態(tài)發(fā)酵條件的控制依賴，使得終產(chǎn)物得率不僅僅依賴于發(fā)酵過程，增大了固態(tài)發(fā)酵的應用范圍。