固相萃取-加壓毛細管電色譜法測定酵素中敵螨普的殘留

唐 超，肖 琦，付 鵬

（1.重慶安全技術職業(yè)學院 安全監(jiān)督管理系，重慶 404020；2.重慶市萬州食品藥品檢驗所，重慶 404100）

酵素是指以一種或多種原料經(jīng)過發(fā)酵而得到的具有某種生理功能的產(chǎn)品[1-2]，常見的水果、蔬菜均可作為酵素發(fā)酵的原料。目前市場上大量的酵素食品被開發(fā)，如桑葚酵素、蔓越莓酵素、水果酵素、蔬菜酵素等[3-4]，在民眾關注此類產(chǎn)品各種功效時，也應關注此類產(chǎn)品的質量安全。據(jù)報道，桑葚、蔓越莓等易感染螨蟲的農(nóng)產(chǎn)品中被檢測出有敵螨普殘留，此外多種蔬菜中也存在敵螨普殘留的風險[5-7]。敵螨普是一種允許在蔬菜、水果生長過程中使用的殺菌殺螨劑[8-9]，但是具有一定的發(fā)育毒性，可致胎兒畸形，特別是近年來，濫用農(nóng)藥引發(fā)的植物源性食品質量安全事故引起消費者越來越多的關注[10]。在國標GB 2763—2021《食品安全國家標準食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中僅規(guī)定敵螨普在部分蔬菜、水果中有最大殘留限量，但是缺少相對應的國標檢測方法。針對以一種或者多種水果、蔬菜為主要原料制成的各類酵素產(chǎn)品，對敵螨普等相關農(nóng)藥殘留的風險評估也很難開展[11-12]，因此有必要開發(fā)一種快速、實用的檢測其中敵螨普殘留的方法。

目前，對于食品中敵螨普檢測方法主要氣相色譜法和液相色譜串聯(lián)質譜法[13-15]。氣相色譜法雖然穩(wěn)定性較好，但是產(chǎn)品中含有發(fā)酵產(chǎn)生的酚類、有機酸等組分，高溫氣化后易對待測組分產(chǎn)生干擾，造成定量不準確；液相色譜串聯(lián)質譜法靈敏度高、目標物的選擇性較好，但是對儀器和人員有較高要求，檢測成本較高。加壓毛細管電色譜（pressurized capillary electrochromatography，pCEC）技術是一種結合毛細管電泳的高柱效性和高效液相色譜的高選擇性兩者優(yōu)點的新型電動微分離技術[16-17]，此方法的雙重分離機理適用于復雜樣品基質中目標物的分離檢測。本試驗通過優(yōu)化加壓毛細管電色譜的各項檢測條件以及前處理過程，建立了一種快速、簡便的pCEC法分析酵素中敵螨普含量，為快速檢測酵素中敵螨普殘留量提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

敵螨普（純度98.5%）：上海安譜實驗科技股份有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純）：德國Merck公司；磷酸鉀（分析純）：國藥化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

2100型加壓毛細管電色譜系統(tǒng)：美國賽默飛公司；RV10旋轉蒸發(fā)儀：德國IKA公司；親水親油平衡（hydrophilelipophile balance，HLB）小柱、石墨化炭黑（graphitized carbon black，GCB）小柱和多壁碳納米管（multi walled carbon nanotubes，MWCNTS）小柱（3 mg）：美國Waters公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 儀器條件

色譜柱為C18毛細管填充柱（100 μm×45 cm，3 μm）；流速1.0 mL/min；進樣量10 μL；柱溫30 ℃；檢測波長260 nm。

1.3.2 流動相體系的優(yōu)化

流動相中有機相的種類、有機相的比例、鹽溶液的濃度以及pH值等因素都會影響到目標物在加壓毛細管電色譜中的分離效果[18-20]。本實驗對流動相體系中不同的因素有機相的種類（甲醇、乙腈）、有機相的比例（10%、15%、20%）、磷酸鉀緩沖鹽溶液的濃度（10 mmol/L、15 mmol/L、20 mmol/L）及pH值（4.0、4.7、6.0、7.0）進行比較，分別考察以上不同因素對敵螨普保留時間和分離度的影響。

1.3.3 電壓強度的選擇

加壓毛細管電色譜中施加電壓強度的不同會直接改變電滲流作用力的大小及方向，導致目標物在加壓毛細管電色譜中不同的分離效果。本實驗分別施加-6 kV、-4 kV、-2 kV、0、+2 kV、+4 kV負向或正向電壓，分別比較在以上不同電壓下敵螨普在加壓毛細管電色譜中的分離能力和分離速度。

1.3.4 前處理方式的選擇

酵素基質中干擾物較多，為了提高檢測的靈敏度和準確度，分別對試驗中提取液的種類、固相萃取柱類型進行選擇優(yōu)化[21-23]。其中提取液分別比較了20%乙腈水溶液、20%乙醇水溶液、20%乙腈水溶液（含0.1%甲酸）、20%乙腈水溶液（含0.1%氨水）和0.1%氨水溶液，考察對樣品中除雜質效果以及目標化合物回收率的影響；固相萃取選擇保留機理不同的3種固相萃取柱HLB柱、GCB柱和MWCNTS柱，考察對提取液中去除干擾物和富集目標組分的影響。

試驗具體步驟為稱取2.0 g樣品至25 mL刻度具塞管中，加入提取液定容至刻度線后超聲20 min，過濾后取上清液進行固相萃取。3款固相萃取柱HLB柱、GCB柱和MWCNTS柱依據(jù)各自的固相萃取步驟進行后，收集濾液過0.22 μm濾膜后上機測定。

1.3.5 方法學驗證

稱取適量敵螨普標準品，用乙腈溶解配制成100.0μg/mL的儲備液，臨用前以流動相配制成質量濃度分別為1.0ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、50.0 ng/mL、100.0 ng/mL、200.0 ng/mL的標準工作液，繪制標準曲線，其中檢出限（limit of detection，LOD）以信噪比（S/N）=3計算，定量限（limit of quantitation，LOQ）以信噪比（S/N）=10計算，并對方法的加標回收率、精密度、穩(wěn)定性及重復性進行驗證。

2 結果與分析

2.1 流動相體系的優(yōu)化

2.1.1 有機相種類的選擇

由圖1可知，流動相中有機相的不同主要是影響到敵螨普的出峰時間及色譜峰的峰形。當有機相為甲醇時，樣品中的干擾物會對敵螨普的色譜峰存在一定的干擾，且出峰時間較長；而有機相為乙腈時，敵螨普的色譜峰分離度較好，出峰時間也合適，因此選擇乙腈作為流動相體系的有機相。

圖1 甲醇和乙腈對敵螨普分離效果的影響Fig.1 Effect of methanol and acetonitrile on separation of dipteroparasin

2.1.2 乙腈比例的選擇

流動相體系中乙腈比例會影響流動相體系的極性，從而影響目標組分的色譜保留行為[24-26]。實驗通過比較流動相中乙腈的不同比例（10%、15%、20%），考察其對敵螨普分離效果的影響，結果見圖2。

由圖2可知，當流動相中乙腈比例為10%時，流動相體系的極性相對較大，敵螨普的出峰時間較晚，且與樣品中的雜質分離度較差；而在乙腈比例為20%時，流動相體系的洗脫能力較強，敵螨普出峰時間提前，但與雜質峰不能完全分離；樣品中的敵螨普組分在流動相中乙腈比例為15%時，分離度最好，能與雜質峰分開，不受干擾。所以選擇15%的乙腈作為流動相中的有機相比例。

圖2 不同乙腈比例對敵螨普分離效果的影響Fig.2 Effect of different acetonitrile ratio on separation of dipteroparasin

2.1.3 磷酸鉀緩沖液濃度選擇

在乙腈-磷酸鉀緩沖液（15∶85，V/V）的流動相體系中，考察了磷酸鉀緩沖液濃度（10 mmol/L、15 mmol/L、20 mmol/L）對敵螨普分離效果的影響，結果見圖3。

圖3 緩沖液濃度對敵螨普分離效果的影響Fig.3 Effect of buffer concentration on separation of dipteroparasin

由圖3可知，當磷酸鉀緩沖液濃度為20 mmol/L時，樣品中敵螨普目標峰與相鄰雜質峰重疊，這是由于電泳中高焦耳熱的影響，樣品中敵螨普目標峰增寬嚴重，柱效下降。當磷酸鉀緩沖液濃度為10 mmol/L或者15 mmol/L時，敵螨普目標峰都能與相鄰雜質峰分開，但后者的分離度更好一些，所以選擇15 mmol/L磷酸鉀溶液作為流動相緩沖液。

2.1.4 磷酸鉀緩沖液pH值的選擇

在確定流動相條件下，分別考察不同pH值的磷酸鉀緩沖液pH（pH4.0、pH 4.7、pH 6.0、pH 7.0）對敵螨普分離效果的影響，結果見圖4。

圖4 緩沖液pH值對敵螨普分離效果的影響Fig.4 Effect of buffer pH on separation of dipteroparasin

由圖4可知，磷酸鉀緩沖液的pH值主要是對敵螨普與干擾物的分離度影響較顯著。當緩沖溶液pH值為7.0或者6.0時，敵螨普與相鄰干擾物的雜質峰分離度較低，影響定量的準確性；而在緩沖溶液pH值為4.0和4.7時，樣品的電泳譜圖中敵螨普的目標峰分離較好，出峰時間適宜，并且緩沖溶液直接配制后的pH值即為4.7，無需進一步調(diào)節(jié)，節(jié)省試驗時間，所以選擇4.7作為磷酸鉀緩沖溶液pH值。

2.2 分離電壓的選擇

在采用乙腈-15 mmol/L pH 4.7磷酸鉀緩沖液（15∶85，V/V）為流動相，分別施加+4 kV、+2 kV、0的正向電壓和-2 kV、-4 kV、-6 kV的負向電壓，考察分離電壓對敵螨普分離效果的影響。

由圖5a～圖5c可知，分別施加-6 kV、-4 kV、-2 kV負向電壓時，對樣品中敵螨普的出峰時間影響較小。這是因為在毛細管電泳出口端施加負向電壓時，電滲流方向朝向毛細管入口端，與系統(tǒng)中壓力流方向相反，電滲流作用力與壓力流以及電場力相互作用，使得敵螨普的電泳表觀淌度減小，表現(xiàn)為目標組分出峰時間變化不大。0電壓情況下，敵螨普與雜質峰重疊（圖5d）。

圖5 分離電壓對樣品中敵螨普分離效果的影響Fig.5 Effect of separation voltage on separation of dipteroparasin

由圖5e和5f可知，施加正向電壓時，在電滲流作用力的推動下敵螨普的分離速度明顯加快，同時色譜峰形變窄。施加電壓為+2 kV時，敵螨普的出峰時間為18 min左右，并且與雜質峰完全分離；當施加電壓為+4 kV時，敵螨普的出峰時間變短，但分離度有所降低。綜合考慮出峰時間、分離度以及靈敏度，選擇+2 kV作為較優(yōu)的施加電壓。

2.3 標準曲線的制作

依據(jù)上述實驗條件，敵螨普在1.0～200.0 ng/mL質量濃度范圍呈線性。實驗結果表明，敵螨普在相應的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關系，具體結果見表1。

表1 敵螨普的保留時間、標準曲線回歸方程、相關系數(shù)、檢出限與定量限Table 1 Retention time,standard curve regression equation,correlation coefficient,detection limit and quantification limit of dipteroparasin

2.4 樣品前處理方法的優(yōu)化

2.4.1 提取溶劑的選擇

選用添加目標組分敵螨普的酵素為實驗對象，考察不同提取液對目標物組分峰面積及電色譜圖的影響，結果見圖6。

圖6 不同提取溶劑提取后樣品的pCEC譜圖Fig.6 pCEC chromatograms of samples after extraction with different extraction solvents

由圖6可知，5種提取溶劑體現(xiàn)在樣品峰面積上是20%乙腈水溶液的效果最好，其他提取方式的圖譜上的目標峰面積較小或者有雜質峰干擾，且20%乙腈水溶液方便易得，提取時不易發(fā)生乳化現(xiàn)象，因此本研究選擇20%乙腈水溶液進行提取。

2.4.2 固相萃取柱的選擇

考慮提取液中還會含有小分子酸、酚類、糖類等雜質成分對目標組分產(chǎn)生干擾，前處理一般會選擇固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）法和分散固相萃?。╭uick-easycheap-effective-rugged-safe，QuEChERS）法進行凈化。但是針對敵螨普農(nóng)藥殘留采用QuEChERS方法時，需要對其中GCB、C18和乙二胺-N-丙基硅烷（primary secondary amine，PSA）三者的配比進行綜合考察優(yōu)化，由于實際樣品基質復雜多變，單一配比無法應對所有類型樣品，具有一定局限性。本研究采用更為通用的固相萃取法進行實驗，分別比較了HLB柱、GCB柱和MWCNTS柱的凈化效果，以敵螨普的加標回收率為比較依據(jù)，分析這3種固相萃取柱對目標組分凈化效果的影響，結果見圖7。

圖7 提取液經(jīng)不同固相萃取小柱處理后回收率的比較Fig.7 Comparison of recovery rates of extracting solution treated with different solid phase extraction columns

由圖7可知，采用HLB小柱效果較好，敵螨普的加標回收率最高，且與MWCNTS柱和GCB柱間敵螨普組分的峰面積差異顯著（P＜0.05）。這是由于MWCNTS柱和GCB柱的特異選擇性強，敵螨普不能很好地保留在小柱上；而HLB固相萃取小柱適用范圍廣，適合大多數(shù)化合物的分離，能將敵螨普非常好地保留住，所以使用HLB小柱回收效果最好。本試驗采用了新型PRiME HLB固相萃取柱，采用的是樣品提取液通過型凈化方式，相比以前富集型HLB小柱節(jié)省了時間，提高了試驗效率，故選擇PRiME HLB固相萃取小柱作為前處理的凈化柱。

2.5 加標回收率及精密度試驗

在加標回收率試驗中，選用桑葚酵素、蘋果酵素、水果酵素、蔬菜酵素4種酵素樣品中添加敵螨普，分別添加3.0μg/kg、10.0 μg/kg、30.0 μg/kg三個水平的標準溶液，每個水平測定5次，計算加標回收率以及精密度試驗結果相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），結果見表2。

表2 方法的加標回收率及精密度試驗結果（n=5）Table 2 Results of standard recovery and precision tests of the method (n=5)

由表2可見，敵螨普的3個水平的加標回收率為85.6%～92.9%，重復測定5次的RSD為2.83%～5.12%，表明本實驗所建立的方法能夠滿足檢測實際樣品需要。

2.6 重復性與穩(wěn)定性試驗

在上述優(yōu)化后的方法條件下，對敵螨普標準溶液（20.0 ng/mL）進行加壓毛細管電色譜法檢測分析，連續(xù)測定7 d，每天進樣5次，測定敵螨普組分保留時間和峰面積的日間和日內(nèi)相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。結果顯示，敵螨普保留時間的日間和日內(nèi)RSD范圍分別為3.2%～6.3%和3.6%～4.7%；峰面積的日間和日內(nèi)RSD范圍分別為3.8%～6.3%和3.5%～4.6%，說明該方法的穩(wěn)定性和重復性均良好。

2.7 樣品的測定

在上述優(yōu)化條件下，隨機抽取了市售10批次的酵素樣品，包含桑葚酵素、蘋果酵素、草莓酵素、玫瑰花酵素、蔓越莓酵素、水果酵素、蔬菜酵素等，發(fā)現(xiàn)兩個批次中有檢出，分別為0.06 mg/kg和0.12 mg/kg，其他批次未檢出，參照草莓中限量值為0.5 mg/kg，整體情況良好。

3 結論

本研究建立了一種加壓毛細管電色譜法測定酵素中敵螨普殘留量的方法。該方法前處理以20%乙腈水溶液作為提取溶劑，結合PRiME HLB小柱凈化，簡化了樣品前處理過程，提高了效率。以乙腈-15 mmol/L pH 4.7磷酸鉀緩沖液（15∶85，V/V）為流動相，在電壓強度＋2 kV條件下酵素中的敵螨普能得到良好基線分離，其峰型良好，出峰時間合適。該方法與同類研究方法相比，提高了目標物的檢測靈敏度，降低了檢測成本，為檢測酵素中敵螨普殘留量提供一種新的參考方法。