高色價(jià)紅曲米液態(tài)制種的培養(yǎng)條件優(yōu)化

黃穎穎 陳慎 楊成龍

摘 要：為進(jìn)一步研究液態(tài)制種的培養(yǎng)條件對(duì)高色價(jià)紅曲米的影響，提高液態(tài)種子液中紅曲霉菌絲體數(shù)量和質(zhì)量，更好地縮短發(fā)酵周期，促進(jìn)高品質(zhì)紅曲米規(guī)?；笊a(chǎn)，對(duì)液態(tài)制種過程中的培養(yǎng)周期、培養(yǎng)溫度、接種量、培養(yǎng)基起始pH值和裝液量等主要培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果表明：紅曲霉液態(tài)制種的最適培養(yǎng)條件為液態(tài)制種培養(yǎng)基的起始pH 5.5，接種量6%，培養(yǎng)溫度35℃，培養(yǎng)周期24 h。經(jīng)優(yōu)化紅曲霉的液態(tài)制種工藝，紅曲米色價(jià)達(dá)6000～6200 u·g-1，發(fā)酵周期10～12 d，產(chǎn)品得率達(dá)35%～38%。

關(guān)鍵詞：紅曲霉;液態(tài)制種;紅曲色素;色價(jià)

Abstract：In order to further research the effects of the culture conditions of liquid seed production on red yeast rice with high color value， improve the quantity and quality of monascus mycelium in liquid seed solution， shorten the fermentation period and promote the largescale production of highquality red yeast rice， the main culture conditions such as culture cycle， culture temperature， inoculum size， initial pH value of culture medium and loaded liquid were optimized. The results showed that the optimal culture conditions for liquid seed production of monascus were the initial pH of liquid seed production medium of 5.5， inoculum size of 6%， culture temperature at 35℃ and culture cycle of 24 h. After optimizing the liquid seed production process of monascus， the color value of red yeast rice was up to 6000-6200 u·g-1， the fermentation period was 10-12 d， and the production yield was up to 35%-38%.

Key words：Monascus; Liquid seed production; Monascus pigment; Color value

紅曲色素是絲狀真菌紅曲霉的次級(jí)代謝產(chǎn)物，為食品添加劑中允許使用的唯一微生物來源的天然色素。近年來，由于紅曲色素具有性質(zhì)穩(wěn)定、耐熱性強(qiáng)，對(duì)蛋白質(zhì)著色力好等優(yōu)點(diǎn)，可取代亞硝酸鹽（一級(jí)致癌物），在肉制品加工和水產(chǎn)品加工領(lǐng)域的使用量迅速增加，已躍升到紅曲米和紅曲色素最主要的應(yīng)用領(lǐng)域，成為世界上生產(chǎn)量及使用量最大的天然食用色素之一[1]。由于紅曲霉的生長(zhǎng)速度相對(duì)緩慢，在紅曲發(fā)酵生產(chǎn)的前期容易被雜菌污染，因此高色價(jià)紅曲米的工業(yè)化生產(chǎn)一般采用純種紅曲二級(jí)種子制作的方法。傳統(tǒng)的純種紅曲二級(jí)種子制作的方法是三角瓶固態(tài)菌種發(fā)酵法，培養(yǎng)紅曲米作為紅曲二級(jí)種子用于后續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)。固態(tài)紅曲米二級(jí)種子方便貯藏，但存在培養(yǎng)周期長(zhǎng)、種子萌發(fā)緩慢、菌絲體生長(zhǎng)不均勻等缺點(diǎn)。相比而言，液態(tài)二級(jí)種子懸浮液以其菌絲體粗壯、萌發(fā)點(diǎn)多且萌發(fā)面積大等優(yōu)勢(shì)已成為工廠化生產(chǎn)的發(fā)展方向[2]。采用液態(tài)制種取代傳統(tǒng)的固態(tài)制種工藝，不僅能使紅曲米發(fā)酵前期紅曲霉萌發(fā)迅速成為優(yōu)勢(shì)菌，縮短發(fā)酵時(shí)間，而且能有效防止發(fā)酵前期易染雜菌的弊端，促進(jìn)規(guī)模化大生產(chǎn)。

本課題組前期研發(fā)出一套純種紅曲液態(tài)制種工藝，但該工藝中存在菌絲體早衰、后期紅曲米色價(jià)不高等問題。本試驗(yàn)采用本實(shí)驗(yàn)室保存的1株高色價(jià)紅曲霉菌株，通過對(duì)前期液態(tài)制種的優(yōu)化和紅曲米產(chǎn)品色價(jià)的關(guān)系進(jìn)行探討，并通過二次旋轉(zhuǎn)正交設(shè)計(jì)，探究液態(tài)制種工藝與紅曲米產(chǎn)品色價(jià)的關(guān)系，以期得到高色價(jià)紅曲產(chǎn)品的最優(yōu)液態(tài)制種培養(yǎng)工藝。通過研究液態(tài)制種培養(yǎng)條件控制對(duì)紅曲霉菌絲體生長(zhǎng)持續(xù)性、產(chǎn)色能力、紅曲米發(fā)酵周期及其產(chǎn)品品質(zhì)的影響，優(yōu)化液態(tài)制種工藝，將對(duì)福建省紅曲產(chǎn)業(yè)的技術(shù)進(jìn)步、提高福建省紅曲行業(yè)的國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力具有積極意義。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 由本實(shí)驗(yàn)室特有的工業(yè)化生產(chǎn)價(jià)值的紅曲霉菌專用種質(zhì)資源庫(kù)中篩選鑒定的代表性紅曲霉菌株為研究對(duì)象。

1.1.2 儀器和試劑 恒溫培養(yǎng)振蕩器SKY200B（上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司）;分光光度計(jì)721型（上海精密科學(xué)儀器有限公司）;無油真空泵HP01（天津市恒奧科技發(fā)展有限公司）;生化培養(yǎng)箱LRH150（上海一恒科技有限公司）;水浴鍋（上海寶磊儀器有限公司）;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG9070型（上海一恒科技有限公司）;手提式滅菌器DSX280A1（上海申安醫(yī)療器械廠）;潔凈工作臺(tái)SWCJIFD（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）;電子天平AR2140[梅特勒托利多儀器（上海）有限公司]。

1.1.3 培養(yǎng)基 試管斜面培養(yǎng)基：麥芽汁10oBé、pH 6～7、瓊脂2%，121℃滅菌30 min。

液態(tài)種子基本培養(yǎng)基：6%大米粉、2.5%蛋白胨、0.15% NaNO3、0.15% KH2PO4、0.1% MgSO4、pH 5.5。在250 mL三角瓶中裝50 mL液態(tài)種子培養(yǎng)基并加入數(shù)顆小玻璃珠，121℃滅菌30 min。

固態(tài)發(fā)酵基本培養(yǎng)基：將糙米洗凈后，與浸米水1∶1的比例浸泡6 h后瀝干水分，121℃滅菌20 min后冷卻備用。

1.2 紅曲米培養(yǎng)工藝和色素的測(cè)定及計(jì)算方法

1.2.1 紅曲米培養(yǎng)工藝流程

1.2.2 紅曲霉試管斜面種子的制備 在無菌條件下，將紅曲霉試管原菌接入試管斜面培養(yǎng)基中，置于35℃的恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)13 d，備用。

1.2.3 紅曲霉液態(tài)種子的制備 將菌種從斜面種子接到一級(jí)液態(tài)種子培養(yǎng)基后，置于35℃恒溫?fù)u床內(nèi)，160 r·min-1振蕩培養(yǎng)2 d后，按6%接種量接到二級(jí)液態(tài)種子培養(yǎng)基中，置于恒溫?fù)u床內(nèi)培養(yǎng)1 d取出現(xiàn)用。

1.2.4 紅曲米固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng) 將二級(jí)液態(tài)種子接入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，于35℃恒溫培養(yǎng)13 d，其間每12 h搖瓶1次，以防止培養(yǎng)基結(jié)塊，培養(yǎng)48 h后每個(gè)三角瓶中分別補(bǔ)無菌水5 mL。培養(yǎng)結(jié)束后，取出紅曲米于60℃通風(fēng)干燥至含水量12%以下備用。試驗(yàn)各處理均為3次重復(fù)。

1.2.5 紅曲米色價(jià)的測(cè)定及計(jì)算方法 參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《GB 1886.19-2015 食品添加劑紅曲米（粉）》[3]進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 菌絲體生物量測(cè)定 發(fā)酵液用紗布過濾，濕菌體用蒸餾水洗滌后，于60℃烘干至恒重后稱重。

1.2.7 紅曲米桔霉素的測(cè)定及計(jì)算方法 參照國(guó)標(biāo)《GB/T 5009.222-2016 食品中桔青霉素的測(cè)定》[4]進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.8 紅曲米得率 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，取出紅曲米于60℃通風(fēng)干燥至含水量12%以下，稱質(zhì)量，計(jì)算紅曲米占初始糙米質(zhì)量的比例為紅曲米得率。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 液態(tài)制種的培養(yǎng)時(shí)間對(duì)液態(tài)種子液中菌絲體生物量和色價(jià)影響的研究 在pH 5.5，溫度35℃培養(yǎng)，每隔6 h測(cè)生物量和色價(jià)，每個(gè)水平3次重復(fù)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)紅曲霉生物量和紅曲米色價(jià)的影響。

1.3.2 液態(tài)制種的培養(yǎng)溫度對(duì)液態(tài)種子液中菌絲體生物量和色價(jià)影響的研究 在pH 5.5，培養(yǎng)溫度分別為26℃、29℃、32℃、35℃、38℃培養(yǎng)，每個(gè)水平3個(gè)重復(fù)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察不同培養(yǎng)溫度制種對(duì)紅曲霉生物量和紅曲米色價(jià)的影響。

1.3.3 紅曲霉液態(tài)制種培養(yǎng)條件的正交試驗(yàn) 以pH、轉(zhuǎn)速、裝液量三因素為研究對(duì)象，分別取3個(gè)水平，以505 nm處色價(jià)為參考指標(biāo)進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)，因素水平表見表1。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Office Excel 2007版辦公軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，利用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 液態(tài)制種的培養(yǎng)時(shí)間對(duì)液態(tài)種子液中菌絲體生物量和色價(jià)的影響

從圖2可知，紅曲霉菌絲體次級(jí)代謝產(chǎn)生紅曲色素，液態(tài)種子液中的菌絲體生物量和色價(jià)會(huì)隨著液態(tài)種子培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加，但到達(dá)一定程度后反而會(huì)有所下降，因此要控制好培養(yǎng)時(shí)間，選用液態(tài)種子液中菌絲體生物量達(dá)到最高且最粗壯旺盛的時(shí)間為培養(yǎng)周期，用于后續(xù)接種固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)。由圖2可以看出，前24 h為菌體生長(zhǎng)期，隨后48 h是色素代謝期，再往后菌絲體生長(zhǎng)和產(chǎn)色能力均減弱。菌絲體生物量均隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而先增大后逐漸減少。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為2 d時(shí)，菌株的產(chǎn)色能力達(dá)到最大，色價(jià)逐漸趨于平緩。同時(shí)，用顯微鏡對(duì)菌株進(jìn)行涂片觀察菌絲和孢子的萌發(fā)狀況，菌株的菌絲體粗壯，孢子萌發(fā)情況好（圖3），與試驗(yàn)結(jié)果相符合。因此，選擇液態(tài)種子培養(yǎng)24 h為后續(xù)試驗(yàn)的培養(yǎng)周期條件。

2.2 液態(tài)制種的培養(yǎng)溫度對(duì)液態(tài)種子液中菌絲體生物量和色價(jià)的影響

從圖4可知，溫度的調(diào)節(jié)控制是影響有機(jī)體生長(zhǎng)繁殖的最重要因素之一，因?yàn)槿魏紊锘瘜W(xué)的酶促反應(yīng)都與溫度變化有關(guān)。根據(jù)酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)來看，溫度升高，反應(yīng)速度加快，呼吸強(qiáng)度增加，最終導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖加快。但隨著溫度的上升，加快細(xì)胞的自溶速度，同時(shí)酶失活的速度也加大，影響生物的代謝產(chǎn)物。通過試驗(yàn)可知，在35℃附近效果最好。

2.3 紅曲霉液態(tài)制種培養(yǎng)條件的正交優(yōu)化

從正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析表2和方差分析表3可以看出，液態(tài)種子培養(yǎng)條件中影響紅曲色素產(chǎn)量的主次因素為：pH>轉(zhuǎn)速>裝液量。在試驗(yàn)范圍內(nèi)，pH和轉(zhuǎn)速對(duì)紅曲霉產(chǎn)色素的影響均達(dá)顯著水平，且pH的影響是極顯著，這驗(yàn)證了其他學(xué)者的結(jié)論，而裝液量的影響不顯著，三者的最優(yōu)組合為A3B2C1，即pH 5.5，轉(zhuǎn)速180 r·min-1，裝液量50 mL·瓶-1（250 mL）。優(yōu)化后的培養(yǎng)條件是：pH 5.5，轉(zhuǎn)速180 r·min-1，裝液量50 mL·瓶-1（250 mL），培養(yǎng)時(shí)間1 d，培養(yǎng)溫度35℃。在此條件下制備的液態(tài)種子液用于紅曲米固態(tài)培養(yǎng)，紅曲霉產(chǎn)色素的色價(jià)可達(dá)到6105.6 u·g-1。

3 結(jié)論與討論

紅曲霉作為我國(guó)重要的微生物資源和工業(yè)生產(chǎn)用菌，在食品工業(yè)中應(yīng)用極廣。紅曲產(chǎn)品可分為酒曲、色曲和功能曲三類，除可發(fā)酵制成多種傳統(tǒng)食品， 如紅曲米、紅曲黃酒、紅腐乳等，還能合成廣泛的具有生物活性的天然產(chǎn)物，如紅曲色素，膽固醇抑制劑洛伐他汀及具有降血壓、抗藥、抗腫瘤、降糖生理活性的成分等[5]。與其他工業(yè)微生物相比，紅曲菌具有有益產(chǎn)物多樣性和高產(chǎn)性的特點(diǎn)，是國(guó)際范圍內(nèi)增長(zhǎng)速度最快、產(chǎn)量和使用量最大的天然著色劑品種。藥理研究表明，紅曲色素具有廣泛的生理活性，如抑制細(xì)胞癌變、抗菌活性、消除活性氧和抗突變等功效[6-7];又因其性質(zhì)安全穩(wěn)定、耐熱性強(qiáng)，和對(duì)蛋白質(zhì)著色力好等優(yōu)點(diǎn)，近年來在食品工業(yè)上作為食品著色劑、食品原料廣泛應(yīng)用于肉制品加工和水產(chǎn)品加工領(lǐng)域，市場(chǎng)前景廣闊。

我國(guó)是紅曲的主要生產(chǎn)國(guó)，福建省又是我國(guó)紅曲傳統(tǒng)的發(fā)源地和主產(chǎn)區(qū)，其紅曲產(chǎn)量和出口量均超過全國(guó)的一半以上，已出口到美國(guó)、法國(guó)、德國(guó)、日本和韓國(guó)等國(guó)家。福建紅曲以品質(zhì)優(yōu)、色價(jià)高的特點(diǎn)，在國(guó)內(nèi)外一直享有極高聲譽(yù)[8]。歐亞各國(guó)以食品配料從中國(guó)進(jìn)口紅曲，用于火腿腸生產(chǎn)，其進(jìn)口量已超過我國(guó)總產(chǎn)量的一半，因此具有廣闊的應(yīng)用前景[9]。本試驗(yàn)以紅曲霉生物量和產(chǎn)色能力為考察指標(biāo)，對(duì)液態(tài)制種培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。通過進(jìn)行單因素和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，確定適宜的液態(tài)制種培養(yǎng)工藝。優(yōu)化后的液態(tài)制種工藝為（一級(jí)種子和二級(jí)種子）：6%大米粉、2.5%蛋白胨、0.15% NaNO3、0.15% KH2PO4、0.1% MgSO4、pH 5.5，培養(yǎng)各24 h，培養(yǎng)溫度35℃，轉(zhuǎn)速180 r·min-1，裝液量50 mL·瓶-1 （250 mL）。按6%接種量生產(chǎn)紅曲米，紅曲米色價(jià)達(dá)6000～6200 u·g-1，發(fā)酵周期10～12 d，產(chǎn)品得率達(dá)35%～38%。通過研究紅曲霉液態(tài)制種工藝對(duì)紅曲米產(chǎn)色素能力的影響，提高液態(tài)種子液中紅曲霉菌絲體數(shù)量和質(zhì)量，進(jìn)而縮短發(fā)酵周期，實(shí)現(xiàn)高品質(zhì)紅曲米規(guī)模化大生產(chǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1]PAN TM， HSU WH.MonascusFermented Products（2nd Ed.）[M].London：Food science，2014：815-825.

[2]杜士良.純種紅曲二級(jí)種子制作的兩種方法[J].釀酒科技， 2001，104（2）：26.

[3]中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).GB 1886.19-2015食品添加劑紅曲米（粉）[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2015.

[4]中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局.GB/T 5009.222-2016食品中桔青霉素的測(cè)定[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016.

[5]黃穎穎，陳慎，楊成龍，等.紅曲色素和桔霉素代謝調(diào)控方法的研究進(jìn)展[J].中國(guó)調(diào)味品， 2018，43（2）， 188-194.

[6]YANG C L，WU X P，CHEN B，et al.Comparative analysis of genetic polymorphisms among Monascus strains by ISSR and RAPD markers[J].Journal of the Science of Food & Agriculture，2016，97（2），636-640.

[7]黃穎穎，陸東和，楊成龍，等.微量營(yíng)養(yǎng)源對(duì)紅曲霉產(chǎn)洛伐他汀開閉環(huán)組分的影響[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，30（3）：286-292.

[8]楊成龍，楊曉君，鄧思珊，等.幾種維生素對(duì)紅曲霉S產(chǎn)色素的影響[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，29（3）：266-270.

[9]楊成龍，陳章娥，吳小平，等.基因組ITS序列分析鑒定紅曲霉菌株[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2015，29（2）：252-259.

（責(zé)任編輯：柯文輝）