黑葡萄穗霉菌生防細菌LY424產(chǎn)天然紅色素特性的研究

李紫嫣 楊慧慈 李龍飛 穆守臣 趙志龍 許俊杰 鐘文文

摘要[目的]研究黑葡萄穗霉菌（Starchybotrys chartarum）生防細菌LY424產(chǎn)天然紅色素的特性。[方法]培養(yǎng)菌株、提取色素，測定吸收峰和色素色價，探討不同條件對紅色素穩(wěn)定性的影響。[結(jié)果]紅色素的最大紫外吸收值在波長524 nm處；色素色價為6693；易溶于極性溶劑；酸堿度和溫度對色素影響較小；易被強氧化劑氧化；金屬離子對色素的影響不明顯；保存該色素的條件為密封避光。 [結(jié)論]該紅色素產(chǎn)量和穩(wěn)定性較高，可以作為一種天然色素資源進行開發(fā)。

關(guān)鍵詞天然紅色素；色價；穩(wěn)定性

中圖分類號Q939.9文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）05-0051-03

Abstract[Objective] The basic characteristics of a LY424 bacterial strain which can prevent and control the growth of Starchybotrys chartarum to produce the natural red pigment were studied. [Method] To culture strain and extract pigment， determine absorption peak and color value and the influence of different conditions on the stability of red pigment. [Result] The maximum UV absorption value of the natural red pigment was at 524 nm， the color value was 66.93， the red pigment also dissolved in polar solvents very easily， its color could not be affected by pH， temperature and metal ions， easily oxidized by the strong oxidizer， at this time it was concluded that the pigment need to be kept under conditions of no light and air. [Conclusion] The red pigment has higher production and better stability， so can be used as a natural pigment resource for development.

Key wordsNatural red pigment；Color value；Stability

基金項目國家級大學(xué)生創(chuàng)新項目（201510452017，201610452041）。

作者簡介李紫嫣（1996—），女，山東東營人，本科生，專業(yè)：制藥工程。*通訊作者，講師，從事微生物分離鑒定及生物農(nóng)藥研究。

收稿日期2016-12-19

目前，色素已廣泛應(yīng)用于日常生活及科學(xué)研究的各個領(lǐng)域。食品著色經(jīng)歷了這樣的一個發(fā)展過程：天然色素—人工合成色素—天然色素與人工合成色素并用—更加安全穩(wěn)定的天然食用色素[1]。隨著醫(yī)學(xué)毒理和生物學(xué)研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)允許使用的人工合成色素中，大多數(shù)種類對人體有不同程度的傷害，尤其是致癌[2]、致畸、致突變，已引起人們的高度重視。因此，天然色素越來越受到人們的青睞[3]。與合成色素相比，天然色素具有無毒副作用、安全性高、有一定的營養(yǎng)價值和保健功能、著色比較自然、更接近于天然物質(zhì)的顏色等特點。天然色素不僅廣泛應(yīng)用于飲料、酒類、糕點、糖果等飲料和食品當中[4]，也可應(yīng)用于醫(yī)藥和化妝品生產(chǎn)，這便要求有廣闊的色素來源。目前，對天然色素的研究主要集中在植物與微生物領(lǐng)域[5]。自然界中微生物能產(chǎn)生色素的種類非常豐富，通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)色素[6]，不受資源、環(huán)境和空間的限制，是高效、低成本獲得目標色素的有效途徑。筆者通過研究黑葡萄穗霉菌（Starchybotrys chartarum）生防細菌LY424，探明該細菌菌株產(chǎn)紅色素的基本特性及其穩(wěn)定性，以期為進一步研究開發(fā)利用菌株資源打下良好基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株。

黑葡萄穗霉菌生防細菌LY424細菌菌株[7]由臨沂大學(xué)微生物重點實驗室從土壤中分離保藏。

1.1.2供試培養(yǎng)基。

PDA培養(yǎng)基[7]。

1.1.3主要儀器。

TU-1810紫外可見光分光光度計，超凈工作臺，DS-1型高速離心機，恒溫生化培養(yǎng)箱，電熱水浴鍋，高壓滅菌鍋，紫光燈。

1.2方法

1.2.1菌株的培養(yǎng)。

將菌種用劃線法接到PDA培養(yǎng)基上，置于30 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.2色素的提取。

用無菌蒸餾水將菌體及其色素等從平板培養(yǎng)基上完全洗下，放燒杯內(nèi)用DS-1型細胞破碎儀在12 000 r/min轉(zhuǎn)速下破碎10 min，然后再用離心機，在4 ℃下以11 000 r/min反復(fù)離心洗滌除去菌體，留上部色素液。

1.2.3紫外光譜掃描。

將“1.2.2”所得色素液用TU-1810紫外可見光分光光度計掃描，并以靈菌紅素純品（由中國海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院提供）為對照，找出最大吸收波長[8]。

1.2.4紅色素色價的測定。

取2 g的菌體及其代謝物混合體，加無菌蒸餾水以離心的方法反復(fù)洗脫胞外色素，得上部色素液后定容到50 mL，然后稱菌體濕重，從2 g混合物中減去菌體重量后可得紅色代謝產(chǎn)物的質(zhì)量。以蒸餾水為參照測色素液在最大吸收峰處的吸光度，用公式計算色價[9]：

色素色價=吸光度×稀釋倍數(shù)/質(zhì)量

1.2.5色素穩(wěn)定性的研究。

色素與有機溶劑的相溶性檢測：取12支試管，在室溫下分別加入3 mL的甲醇、乙醇、甲醛、丙酮、甲酸、水、二甲苯、乙酸乙酯、四氯化碳、四氯甲烷、液體石蠟、甘油，然后給每支試管加入3 mL色素液，同時觀察相溶性和顏色變化，以后隔不同的時間段測可溶溶液的吸光度，分析其色變情況。

不同pH溶液處理色素：取等量的色素液，分別用HCl和NaOH調(diào)節(jié)pH為2、4、6、8、10、12、14，觀察色素色調(diào)變化，并分別測其吸光度。

不同溫度下處理色素：取等量的色素液裝入試管中，放室溫以及40、60、80、100 ℃下在不同的時段觀察色素的色調(diào)變化，并分別測其吸光度。

色素在不同金屬鹽離子溶液中的變化：取相同體積的色素液裝入試管中，分別加入0.2 g的不同鹽，觀察當時溶液的變化，并分別測其吸光度，24 h后再測其吸光度，對比分析金屬離子對色素的影響情況。

氧化還原劑對色素的影響：取80 mL色素液等量分裝在8支試管中，依次編號為1、2、3、4、5、6、7和8，1～4號分別加入0.1、0.3、0.6、1.0 mL H2O2，5～8號分別加入0.05、0.10、0.20、0.40 g的Na2SO3，觀察顏色變化，并分別測其吸光度。

可見光和紫外光對色素的影響：將裝有色素液的試管放在可見光和紫外光下，分別在不同的時段觀察其變化結(jié)果。

自然光下2種保存色素方法比較：取等量50 mL色素液分裝在磨口瓶里，一只用緊塞不透氣的橡膠塞，一只用可透過空氣但可隔離細菌的透膜封口，在不同的時段測定吸光度。

2結(jié)果與分析

2.1紫外-可見光譜掃描分析

色素的紫外可見光掃描圖譜見圖1。由圖1可知，該色素在波長524 nm處有最大吸收峰，說明該色素的分子結(jié)構(gòu)具有很大的共軛體系，可能有很多共軛雙鍵、苯環(huán)或類似苯環(huán)的共軛結(jié)構(gòu)，或含雜原子的一些雜環(huán)，故在生態(tài)條件的研究中可測定色素溶液在波長524 nm處的吸收值來研究色素的產(chǎn)量，同時為下一步色素的鑒定提供一定的依據(jù)。

2.2色素的色價測定

通過稱量計算得紅色代謝物濕重為1.154 2 g，其稀釋50倍后在最大吸收波長524 nm處的吸光度為1.545，帶入公式計算得色素色價為66.93。

2.3與有機溶劑的相溶性

從表1看出，用甲醇、乙醇、甲醛、丙酮、甲酸和水幾類極性溶劑洗脫菌體后，溶液不分層，均表現(xiàn)可溶性或者易溶性，說明色素結(jié)構(gòu)中含有極性基團。

用二甲苯、乙酸乙酯、四氯化碳和三氯甲烷洗脫菌體后，溶液出現(xiàn)分層現(xiàn)象，均表現(xiàn)不溶性。由此推知，色素化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有雙鍵、羰基和醛基等極性基團。

2.5不同溫度對色素的影響

從表3看出，該菌紅色素在室溫下，隨著加熱時間延長其OD524和殘存率均有所變化，但變化幅度較小，說明紅色素在室溫下較為穩(wěn)定；在40～60 ℃下處理時，其OD524和殘存率變化不大，說明在該溫度范圍內(nèi)色素保持良好的穩(wěn)定性；在80 ℃下OD524和殘存率變化幅度均較大，可知該溫度下色素有部分降解現(xiàn)象，高溫影響色素的穩(wěn)定性；溫度達到100 ℃時，OD524和殘存率變化幅度進一步擴大，OD524小到1.572，殘存率降低到55.24%。由此可知，該色素穩(wěn)定性隨溫度的升高而降低。

2.6金屬離子的影響

從表4看出，不加金屬離子時原液均呈桃紅色，加入金屬離子24 h后原液顏色發(fā)生不同變化，Na+溶液顏色不變，F(xiàn)e3+溶液逐漸變成灰色，Mn2+溶液由桃紅色變成紫紅色，Ca2+、Mg2+兩溶液由桃紅色變成紅色。由此可知，金屬離子Fe3+ 和Mn2+加入原液后顏色變化較大，原因是它們具有較強的氧化性，而其他金屬離子則無此特性，原因是它們均無氧化性。

2.7氧化還原劑對色素的影響

從表5吸光度及殘存率看出，在原液中加入H2O2和Na2SO3，1～4號的吸光度均有所減小而且變化幅度較大，顏色由鮮紅色逐步變成淺紅色；加入Na2SO3的5～8號的吸光度亦有所減小且變化幅度較小，顏色由鮮紅色變?yōu)樘壹t色，說明氧化劑對色素具有一定的降解作用。

2.8光照對色素的影響

從表6看出，可見光下隨著時間的延長，色素的吸光度和殘存率均逐漸減小，說明該色素在可見光下容易發(fā)生降解，其對光穩(wěn)定性較差；在紫外光下，隨著時間的延長色素吸光度和殘存率均減小，說明紫外光對該色素亦有降解作用。

2.9色素的保存方法

從表7 看出，色素的吸光度和殘存率隨時間延長均逐漸減小，且減小幅度較大，說明暴露空氣的情況下，色素因氧氣存在而降解；在封閉條件下，殘存率和OD524均減小，但減小幅度不大，說明封閉條件下有利于色素的穩(wěn)定。

3結(jié)論與討論

該色素在波長524 nm處有最大吸收峰，袁保紅等[10]報道的色素最大吸收峰為534 nm，由此推測該色素的分子結(jié)構(gòu)存在共軛體系，可能有很多共軛雙鍵、苯環(huán)或類似苯環(huán)的共軛結(jié)構(gòu)，或含雜原子的一些雜環(huán)。至于該色素的具體結(jié)構(gòu)和影響結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的基團有待于進一步測定。

參照國家色素測定標準[11]，經(jīng)測定該菌株所產(chǎn)紅色素色價為66.93，說明該色素產(chǎn)量較高，可以作為一種天然色素資源進行開發(fā)，前景較為廣闊。

細菌LY424產(chǎn)生的紅色素可以有效抑制黑葡萄穗霉菌的生長，因此該菌株還可以作為生防菌來研究開發(fā)，具有良好的應(yīng)用前景。

pH對該菌紅色素的穩(wěn)定性有一定影響，在pH 2～6時顏色逐漸變成紫色，在pH 8～12時色素顏色逐漸變成淡紅色。用甲醇、乙醇、甲醛、丙酮、甲酸和水幾類極性溶劑洗脫菌體后，均表現(xiàn)可溶性；用二甲苯、乙酸乙酯、四氯化碳和三氯甲烷洗脫菌體后，均表現(xiàn)不溶性。該菌紅色素在室溫下較為穩(wěn)定；在40～60 ℃下處理時，色素保持良好穩(wěn)定性；在80 ℃下色素有部分降解現(xiàn)象；溫度達到100 ℃時色素穩(wěn)定性較差。不加金屬離子時原液均呈桃紅色，加入金屬離子Fe3+和Mn2+后顏色變化較大，原因是它們具有較強的氧化性，而其他金屬離子對色素顏色影響不大。加入H2O2后，色素顏色逐漸變?yōu)闊o色；加入Na2SO3后，色素顏色無變化。該色素長期暴露空氣時降解速度加快，因此在儲藏時應(yīng)密封保存。

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