固態(tài)發(fā)酵制備紅曲淮山的工藝優(yōu)化

任二芳 牛德寶 謝朝敏 蘇艷蘭 羅小杰 王淋靚 劉功德 李建強

摘要：【目的】優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵制備紅曲淮山工藝，為淮山資源的開發(fā)利用提供技術支持。【方法】以淮山為原料，在單因素試驗的基礎上，以發(fā)酵時間、底物量、接種量和培養(yǎng)基初始水含量為考察因素，以色價為評價指標，通過正交試驗確定固態(tài)發(fā)酵制備紅曲淮山的最佳工藝，并參照QB/T 2847-2007《功能性紅曲米（粉）》和GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的測定》對制備的紅曲淮山進行功能成分分析?！窘Y(jié)果】影響固態(tài)發(fā)酵制備紅曲淮山的因素排序為底物量>培養(yǎng)基初始水含量>發(fā)酵時間>接種量；固態(tài)發(fā)酵制備紅曲淮山的最佳工藝條件：發(fā)酵時間13 d、底物量45 g（置于250 mL三角瓶中）、接種量0.4%、培養(yǎng)基初始水含量60%，在此條件下制得的紅曲淮山色價均值為1205.42 u/g，降血脂功效成分莫納科林K和降血壓功效成分γ-氨基丁酸含量分別為80.00和31.74 mg/100 g，是發(fā)酵前紅曲的10.00倍和10.58倍?！窘Y(jié)論】淮山代替秈米作為紅曲霉的發(fā)酵底物，發(fā)酵得到的紅曲淮山功效成分含量高，為淮山資源的充分利用提供一條新途徑。

關鍵詞： 固態(tài)發(fā)酵；紅曲；淮山；色價；正交試驗

中圖分類號： TS201.3 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）06-1074-06

Optimization of solid state fermentation preparation for

yam fermented by monascus

Abstract：【Objective】Solid state fermentation preparation for yam fermented by monascus was optimized to provide technical support for yam resources development and utilization. 【Method】Using yam as raw materials， on the basis of single factor test， fermentation time， substrate quantity， inoculation rate and initial moisture content of medium as investigation factors and color value as evaluation index， the optimum solid state fermentation condition for yam fermented by monascus was determined by orthogonal test. According to QB/T2847-2007 Functional Monascus Rice（Powder） and GB/T5009.124-2003 Measure ment of Amino Acid in Food， functional components of yam fermented by monascus was analyzed. 【Result】The order of factors affecting solid state fermentation preparation for yam fermented by monascus was as follows： substrate quantity>initial moisture content of medium>fermentation time>inoculation rate. In addition， the optimal fermentation conditions were： fermentation time 13 d， substrate quantity 45 g（placed in 250 mL triangular flask）， inoculation rate 0.4% and initial moisture content of medium 60%. In this condition， the average color value of yam fermented by monascus reached 1205.42 u/g. The content of functional components for blood lipid reduction Monakelin K was 80.00 mg/100 g， which was 10.00 times of monascus before fermentation. The content of functional components for blood pressure decline γ-aminobutyric acid was 31.74 mg/100 g， which was 10.58 times of monascus before fermentation. 【Conclusion】Using yam as substrate quantity instead of indica rice for monascus， the obtained monascus yam contains high functional components. This study could open up a new way to make full use of yam resources.

Key words： solid state fermentation； monascus； yam； color value； orthogonal experiment

0 引言

【研究意義】紅曲又稱紅曲米，傳統(tǒng)紅曲是以秈米為原料，經(jīng)紅曲霉發(fā)酵而制成的紫紅色米曲（毛瑞豐，2003）。紅曲中不僅含有紅色素，還含有洛伐他汀等多種活性物質(zhì)，具有降膽固醇、降血糖、降血壓等功效；除了應用于釀酒，在腐乳、食醋、食品色素及中藥等領域也有廣泛應用，對食品工業(yè)具有重要價值（張秀媛等，2012）。紅曲產(chǎn)地主要分布于我國福建、浙江、廣東、江蘇、臺灣等地，以福建古田紅曲最著名（路秀玲等，2001；沈士秀，2001）。目前，國內(nèi)的紅曲米生產(chǎn)大多仍采用傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵工藝，盡管固態(tài)發(fā)酵工藝存在種子純度低、發(fā)酵周期較長、生產(chǎn)效率低等缺點，但也具有過程易操作、水活度低、基本無廢水及污染物排放等優(yōu)點（姜冰潔，2015）?；瓷绞撬幨硟捎弥参铮粌H富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、粗纖維、胡蘿卜素、B族維生素、尼克酸、維生素C、鈣、磷、鐵等營養(yǎng)成分（王蕊，2006），還含有皂苷、多巴胺、膽堿、麥角固醇、植酸等生物活性物質(zhì)（Alves et al.，2002；Chen and Lin，2007；Huang et al.，2007；Yang and Lin，2008），營養(yǎng)價值高，具有健脾、補肺、固腎、益精、降血糖、降血脂、減少皮下脂肪堆積、調(diào)理腸胃等功效，能有效防止結(jié)締組織萎縮，預防發(fā)生類風濕關節(jié)炎等膠原病（王蕊，2006）?；瓷交瘜W成分與秈米相似，兩者淀粉含量接近，若能以淮山代替秈米作為紅曲霉的發(fā)酵底物，不僅使淮山資源得到充分利用，還能充分發(fā)揮淮山和紅曲的雙重保健功效。因此，研究固態(tài)發(fā)酵制備紅曲淮山的工藝條件，對充分開發(fā)利用淮山資源具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】陳運中（2003）以早秈米為原料，紅曲霉為菌種，研究種子液體發(fā)酵和紅曲固體發(fā)酵生產(chǎn)紅曲色素工藝，選育出SM005h優(yōu)勢菌株1株，得到種子液體發(fā)酵最佳條件為6%接種量、1∶0.5通氣量、攪拌轉(zhuǎn)速350 r/min、31 ℃下培養(yǎng)31 h；紅曲固體發(fā)酵最佳條件是接種量6%、米飯初始水分含量38%、發(fā)酵溫度32～35 ℃。高玉榮等（2008）采用Box-Behnken試驗設計和響應面優(yōu)化確定了玉米固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)紅曲紅色素補加營養(yǎng)物的最佳添加量：葡萄糖0.26%（w/w）、硫酸鎂0.43%（w/w）、酵母膏0.25%（w/w），在此條件下紅曲紅色素紅色價為2335.17 u/g，色調(diào)為1.69，比未補加營養(yǎng)物時分別提高55.67%和64.08%。劉安軍等（2009）以豆粕為原料，利用紅曲霉菌株進行固態(tài)發(fā)酵，豆粕與水的質(zhì)量比為1∶1時得到的發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)量較高。張秀媛等（2012）以小米為原料，通過正交試驗優(yōu)化得到固體發(fā)酵制備張雜谷紅曲米最佳工藝條件：150 mL三角瓶中，30 ℃下進行恒溫培養(yǎng)，發(fā)酵時間14 d、中間加水量8%（接種72 h后每24 h加1次水并搖瓶）、接種量10%、底物量15 g，所得紅曲米色價為2618 u/g。由上述研究可看出，紅曲可以不同底物原料進行固態(tài)發(fā)酵。此外，也有一些學者對紅曲中莫納科林K、γ-氨基丁酸等關鍵活性物質(zhì)進行研究，如胡珊等（2011）通過篩選獲得1株γ-氨基丁酸高產(chǎn)菌MXL-8，該菌在29 ℃、200 r/min搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)6 d，γ-氨基丁酸產(chǎn)量可達22.373 mg/mL；黃群等（2011）篩選出產(chǎn)莫納科林K能力達157 mg/L的M3菌株為優(yōu)勢菌株，且在最優(yōu)條件下發(fā)酵液的莫納科林K質(zhì)量濃度達354.68 mg/L；上述優(yōu)勢菌株的篩選均通過液態(tài)發(fā)酵進行?！颈狙芯壳腥朦c】目前，有關固態(tài)發(fā)酵制備紅曲淮山工藝方面的研究鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】以淮山為原料，通過單因素試驗和正交試驗探討固態(tài)發(fā)酵制備紅曲淮山的最佳工藝條件，并測定紅曲淮山的功能成分含量，為淮山資源的開發(fā)利用提供技術支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

淮山購自廣西利客隆超市中華店；紅曲購自古田縣生華紅曲有限公司；乙醇購自廣東省化學試劑工程技術研究開發(fā)中心，為分析純。主要儀器設備：HY101-1A型鼓風電熱恒溫干燥箱（上海滬越實驗儀器有限公司）；YX-280B型手提式壓力蒸汽消毒器（江陰濱江醫(yī)療設備廠）；SW-CJ-IBU潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；JJ500型電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）；LRH-250-M霉菌培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠）；HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠）；722型可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 無硫淮山粒制備 清洗淮山并削皮，切成0.5～2.0 cm正方形顆粒后，置于由1.0%氯化鈉、0.3%抗壞血酸和0.4%檸檬酸組成的護色液中浸泡2～5 h，然后50～65 ℃烘干，使干燥后的淮山水含量在12%以下，即得無硫淮山粒。

1. 2. 2 固態(tài)發(fā)酵制備紅曲淮山單因素試驗

1. 2. 2. 1 發(fā)酵時間對固態(tài)發(fā)酵制備紅曲淮山的影響

將無硫淮山粒浸泡于自來水中15 h，使復水后的無硫淮山粒（固態(tài)培養(yǎng)基）水含量為55%，常壓將其蒸至熟而不爛，冷卻后與0.5%（以無硫干淮山粒的重量計，下同）的紅曲粉（發(fā)酵劑）混勻，取55 g混合物裝入250 mL三角瓶中，置于溫度32 ℃、濕度65%的培養(yǎng)箱中分別發(fā)酵6、7、8、9、10、11、12、13和14 d，然后60 ℃烘干，使紅曲淮山水含量在10%以下，打粉并測定色價。

1. 2. 2. 2 底物量對固態(tài)發(fā)酵制備紅曲淮山的影響

將無硫淮山粒浸泡于自來水中15 h，使復水后的無硫淮山粒水含量為55%，常壓將其蒸至熟而不爛，冷卻后與0.5%紅曲粉混勻，分別稱取25、35、45、55和65 g混合物裝入250 mL三角瓶中，置于溫度32 ℃、濕度65%的培養(yǎng)箱中發(fā)酵12 d，然后60 ℃烘干，使紅曲淮山水含量在10%以下，打粉并測定色價。

1. 2. 2. 3 接種量對固態(tài)發(fā)酵制備紅曲淮山的影響

將無硫淮山粒浸泡于自來水中15 h，使復水后的無硫淮山粒水含量為55%，常壓將其蒸至熟而不爛，冷卻后分別與0.3%、0.4%、0.5%、0.6%和0.7%的紅曲粉混勻，取55 g混合物裝入250 mL三角瓶中，置于溫度32 ℃、濕度65%的培養(yǎng)箱中發(fā)酵12 d，然后60 ℃烘干，使紅曲淮山水含量在10%以下，打粉并測定色價。

1. 2. 2. 4 培養(yǎng)基初始水含量對固態(tài)發(fā)酵制備紅曲淮山的影響 分別將無硫淮山粒浸泡于自來水中1/6、1/2、1、15和24 h，使復水后的無硫淮山粒水含量為40%、45%、50%、55%和60%，常壓將其蒸至熟而不爛，冷卻后與0.5%紅曲粉混勻，取55 g混合物裝入250 mL三角瓶中，置于溫度32 ℃、濕度65%的培養(yǎng)箱中發(fā)酵12 d，然后60 ℃烘干，使紅曲淮山水含量在10%以下，打粉并測定色價。

1. 2. 3 正交試驗設計 在單因素試驗的基礎上，研究影響固態(tài)發(fā)酵制備紅曲淮山的發(fā)酵時間、底物量、接種量和培養(yǎng)基初始水含量4個因素，按L9（34）正交表設計試驗。因素水平如表1所示。

1. 2. 4 紅曲淮山成分測定 按1.2.1方法制備無硫淮山粒，并采用正交試驗得出的最優(yōu)工藝條件進行固態(tài)發(fā)酵制備紅曲淮山，測定紅曲淮山中的功能成分及其含量，與未以淮山為底物發(fā)酵的紅曲進行對比。參照GB 4926-2008《食品添加劑 紅曲米（粉）》測定色價；參照QB/T 2847-2007《功能性紅曲米（粉）》測定莫納科林K含量；參照GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的測定》測定γ-氨基丁酸含量。

1. 2. 5 無菌操作 試驗用的所有三角瓶、燒杯、鑰匙等小器皿均置于121 ℃高壓鍋中滅菌15 min；移液槍、稱量紙等不適宜高壓鍋滅菌的物品均置于無菌操作臺上紫外滅菌30 min；所有操作均在無菌操作室中進行。

1. 3 統(tǒng)計分析

所有試驗均重復3次。采用SPSS 22.0對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 固態(tài)發(fā)酵制備紅曲淮山的單因素試驗結(jié)果

2. 1. 1 發(fā)酵時間對固態(tài)發(fā)酵制備紅曲淮山的影響

由圖1可知，發(fā)酵前12 d，隨著發(fā)酵時間的延長，紅曲淮山色價不斷顯著提高（P<0.05，下同），發(fā)酵12 d后，色價升高不顯著（P>0.05，下同），趨于平緩，紅曲淮山發(fā)酵基本完成。因此，從經(jīng)濟角度和時間效率考慮，確定12 d為最佳發(fā)酵時間。

2. 1. 2 底物量對固態(tài)發(fā)酵制備紅曲淮山的影響 由圖2可知，隨著底物量的增加，紅曲淮山色價整體呈先升高后降低的變化趨勢，底物量為55 g時達最大值；當?shù)孜锪砍^55 g后，紅曲淮山色價不僅顯著降低，在發(fā)酵過程中還伴有淮山結(jié)塊和異味產(chǎn)生現(xiàn)象。說明試驗采用的250 mL三角瓶空間有限，底物量的過度增加，會阻止紅曲霉呼吸氧氣，產(chǎn)生厭氧發(fā)酵，使其產(chǎn)色能力降低。因此，確定最佳底物量為55 g。

2. 1. 3 接種量對固態(tài)發(fā)酵制備紅曲淮山的影響 從圖3可看出，接種量為0.3%～0.5%時，隨著接種量的增加，紅曲淮山色價顯著升高；當接種量超過0.5%后，隨著接種量的繼續(xù)增加，紅曲淮山色價顯著下降。說明開始時紅曲霉菌接種量小、生長緩慢，發(fā)酵起動所需時間長，發(fā)酵產(chǎn)物積累較少；當接種量超過0.5%時，紅曲霉菌會大量消耗發(fā)酵底物中的營養(yǎng)物質(zhì)用于自身繁殖，使單位體積內(nèi)的養(yǎng)料和溶氧不足，同時伴有大量代謝廢物產(chǎn)生，干擾了自身的正常代謝，而不利于獲得所需的次級代謝產(chǎn)物。接種量過高或過低，均不利于紅曲淮山的發(fā)酵，故確定最佳接種量為0.5%。

2. 1. 4 培養(yǎng)基初始水含量對固態(tài)發(fā)酵制備紅曲淮山的影響 從圖4可看出，培養(yǎng)基不同初始水含量影響紅曲淮山色價，隨著培養(yǎng)基初始水含量的增加，紅曲淮山色價呈先升高后降低的變化趨勢，在培養(yǎng)基初始水含量為55%時達最大值。說明在固態(tài)發(fā)酵時，孢子萌發(fā)及菌絲生長均需適宜的水分，而固態(tài)發(fā)酵的最大特點是無游離水，因此發(fā)酵底物水含量的變化對微生物的生長及代謝能力會產(chǎn)生重要影響。當發(fā)酵培養(yǎng)基初始水含量低時，隨著紅曲霉菌的生長，產(chǎn)熱量增大，淮山粒更加干燥，致使紅曲霉菌難以生長，影響發(fā)酵效果；當發(fā)酵培養(yǎng)基初始水含量過高時，淮山粒易產(chǎn)生黏結(jié)成塊現(xiàn)象，導致淮山顆粒間的空隙變小，直接影響到基質(zhì)中的氣體交換，從而抑制紅曲霉菌在淮山粒上的生長，同時通氣不足會導致發(fā)酵前期產(chǎn)生較多的乙醇，有明顯的酒味。因此，最適的培養(yǎng)基初始水含量為55%。

2. 2 固態(tài)發(fā)酵制備紅曲淮山正交試驗結(jié)果

由表2的R值可知，4個因素對固態(tài)發(fā)酵制備紅曲淮山影響程度依次為B>D>A>C，即底物量的影響最大，其次為培養(yǎng)基初始水含量和發(fā)酵時間，接種量的影響相對較小。直觀比較表2的9組試驗結(jié)果可看出，A3B2C1D3組合發(fā)酵所得的紅曲淮山色價最高，而比較表2中各因素的K值得出最優(yōu)工藝組合為A3B1C1D3。此外，由表3可知，各因素對紅曲淮山色價的影響均不顯著。

將組合A3B2C1D3和A3B1C1D3分別進行多次重復試驗，得到紅曲淮山色價均值分別為980.23和1205.42 u/g，可確定固態(tài)發(fā)酵制備紅曲淮山的最優(yōu)工藝組合為A3B1C1D3，即最佳工藝條件為發(fā)酵時間13 d、底物量45 g、接種量0.4%、培養(yǎng)基初始水含量60%。

2. 3 紅曲淮山功能成分分析結(jié)果

參照QB/T 2847-2007《功能性紅曲米（粉）》和GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的測定》標準，對采用正交試驗優(yōu)化的固態(tài)發(fā)酵工藝制備的紅曲淮山和未以淮山為底物發(fā)酵的紅曲分別進行功能成分分析，檢測結(jié)果如表4所示。通過對比發(fā)現(xiàn)，以淮山為底物經(jīng)發(fā)酵后所得的紅曲淮山中莫納科林K和γ-氨基丁酸含量分別為80.00和31.74 mg/100 g，是發(fā)酵前紅曲的10.00倍和10.58倍。說明淮山營養(yǎng)物質(zhì)豐富，作為發(fā)酵底物可很好地保證紅曲霉菌快速繁殖所需的營養(yǎng)供給，而產(chǎn)生更多次級代謝產(chǎn)物（莫納科林K和γ-氨基丁酸等）。

3 討論

自20世紀80年代以來，發(fā)達國家已采用厚層通風制曲和液態(tài)發(fā)酵法結(jié)合生產(chǎn)紅曲，實現(xiàn)了紅曲生產(chǎn)的機械化、連續(xù)化和自動化，但此方法首期投入性大，技術要求高，在我國尚未大規(guī)模推廣應用（劉穎，2006）。目前國內(nèi)的紅曲米生產(chǎn)大多仍采用傳統(tǒng)的固態(tài)發(fā)酵工藝，其具有設備構造簡單、資本投入小、過程易操作，水活度低、酶系豐富且活力高，發(fā)酵過程中不需嚴格的無菌條件，后處理簡便、基本無廢水及污染物排放等優(yōu)點（姜冰潔，2015）。隨著時代的發(fā)展和科技的進步，人們對紅曲的研究日漸廣泛且深入，開發(fā)高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基配方及彌補傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵技術的不足已成為研究新方向（程哲灝等，2011）。

本研究以淮山代替秈米作為紅曲霉的發(fā)酵底物，單因素試驗結(jié)果表明，紅曲淮山色價隨著發(fā)酵時間的延長不斷顯著升高，12 d后趨于平緩；而隨著底物量、接種量和培養(yǎng)基初始水含量的增加，均呈先升高后降低的變化趨勢。通過正交試驗優(yōu)化得到固態(tài)發(fā)酵制備紅曲淮山的最佳工藝條件為：發(fā)酵時間13 d、底物量45 g（置于250 mL三角瓶中）、接種量0.4%、培養(yǎng)基初始水含量60%，在此條件下得到紅曲淮山色價均值為1205.42 u/g，符合GB 4926-2008《食品添加劑 紅曲米（粉）》中對于色價的要求。分析4個因素對固態(tài)發(fā)酵制備紅曲淮山的影響程度，發(fā)現(xiàn)底物量是主要因素，其次是培養(yǎng)基初始水含量和發(fā)酵時間，而接種量影響相對較小。莫納科林K和γ-氨基丁酸是紅曲中的關鍵活性物質(zhì)，其中莫納科林K具有調(diào)節(jié)血脂、抑制膽固醇、調(diào)節(jié)人體免疫功能、抑瘤抗癌等功效（熊曉輝等，2004；黃群等，2011）；γ-氨基丁酸具有延緩神經(jīng)細胞衰老、降血壓、治療精神疾病、預防老年癡呆、抗焦慮、活化腎功能、改善肝功能、防止肥胖等重要的生理功能（胡珊等，2011；黨娟等，2015；楊濤等，2015）。本研究制得的紅曲淮山中莫納科林K和γ-氨基丁酸含量均高于未以淮山為底物發(fā)酵前的紅曲，分別是發(fā)酵前紅曲的10.00倍和10.58倍。 可見，以淮山代替秈米作為紅曲霉的發(fā)酵底物具有可行性，不僅能使淮山資源得到充分利用，還可充分發(fā)揮淮山和紅曲的雙重保健功效。

4 結(jié)論

淮山代替秈米作為紅曲霉的發(fā)酵底物，發(fā)酵得到的紅曲淮山功效成分含量高，為淮山資源的充分利用提供一條新途徑。

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（責任編輯 羅 麗）