超聲輔助酶重量法提取樹仔菜總膳食纖維

鄧愛妮 范瓊 周聰 趙敏

摘要：【目的】優(yōu)化超聲輔助酶重量法提取樹仔菜總膳食纖維工藝，為后續(xù)野生蔬菜膳食纖維研究工作提供技術(shù)參考?！痉椒ā恳詷渥胁藶樵?，通過單因素試驗(yàn)考察蛋白酶種類、酶添加量、溶液pH、超聲時(shí)間和超聲溫度對(duì)總膳食纖維提取率的影響，并在此基礎(chǔ)上采用正交試驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝?！窘Y(jié)果】蛋白酶種類對(duì)樹仔菜總膳食纖維提取率影響的排序?yàn)槟竟系鞍酌?中性蛋白酶>堿性蛋白酶>胰蛋白酶；超聲輔助酶重量法提取樹仔菜總膳食纖維的最佳工藝條件為：木瓜蛋白酶添加量0.60%、溶液pH 5.0、超聲時(shí)間50 min、超聲溫度65 ℃，對(duì)提取率影響程度排序?yàn)槟竟系鞍酌柑砑恿?超聲時(shí)間>超聲溫度>溶液pH；在優(yōu)化條件下，樹仔菜總膳食纖維提取率為45.0%，變異系數(shù)小于5.00%，測(cè)定結(jié)果與GB 5009.88-2014《食品中膳食纖維的測(cè)定》測(cè)定結(jié)果（44.8%）基本一致?！窘Y(jié)論】超聲輔助酶重量法提取樹仔菜總膳食纖維具有酶解時(shí)間短、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，可用于批量樣品總膳食纖維的提取。

關(guān)鍵詞： 樹仔菜；膳食纖維；酶重量法；超聲輔助

中圖分類號(hào)： TS201.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2017）06-1062-06

Extraction of total dietary fiber from Sauropus androgynus L. Merr by ultrasonic-assisted enzymatic-gravimetric method

Abstract：【Objective】The extraction process of total dietary fiber from Sauropus androgynus L. Merr by ultrasonic-assisted enzymetic-gravimetric method was optimized， in order to provide a theoretical reference for researching dietary fiber of wild vegetable. 【Method】Using S. androgynus L. Merr as materials， the effects of protease types， enzyme amount， solution pH， ultrasonic time and ultrasonic temperature on extraction rate of total dietary fiber from S. androgynus L. Merr were investigated by single-factor test. Meanwhile， based on the results of single-factor test， the extraction technology was optimized using orthogonal experiment. 【Result】Effects of protease types on extraction efficiency were ranked as follows： papain>neutral protease>alkaline protease>trypsin. The optimal technological parameters for ultrasound-assisted enzyma-

tic-gravimetric extraction of S. androgynus L. Merr total dietary fiber were as follows： papain amount 0.60%， solution pH 5.0， ultrasonic time 50 min and ultrasonic temperature 65 ℃. Extraction efficiency was effected by papain>ultrasonic time>ultrasonic temperature>solution pH. Under the above optimum conditions， the extraction rate of total dietary fiber from S. androgynus L. Merr reached up to 45.0%， which was close to the value（44.8%） of GB 5009.88-2014 Measurement of Dietary Fiber in Food. The coefficient of variation was less than 5.00%. 【Conclusion】The optimized extraction process by ultrasonic-assisted enzymetic-gravimetric method shortens enzymolysis time， and is easy to operate， hence it can be applied in scale extraction of total dietary fiber from samples.

Key words： Sauropus androgynus L. Merr； dietary fiber； enzymetic-gravimetric method； ultrasonic-assisted

0 引言

【研究意義】樹仔菜又稱五指山野菜、越南菜、天綠香等，為守宮木屬灌木，原產(chǎn)于東南亞熱帶雨林，在我國海南、廣東、云南等地有較大面積栽培。樹仔菜營養(yǎng)豐富，含有蛋白質(zhì)5.08%、不溶性膳食纖維2.18%（周聰?shù)龋?010）、維生素C 138 mg/100 g（鄧愛妮等，2014）等。膳食纖維作為第七大營養(yǎng)素，素有腸道清潔夫之稱（Topping and Lockett，2016），是一類不為人體消化和利用的非淀粉多糖，主要有吸水、黏滯、結(jié)合有機(jī)化合物、交換陰離子等作用，按溶解能力可分為可溶性膳食纖維和不溶性膳食纖維。膳食纖維具有降血壓、預(yù)防便秘、排毒等保健功能，添加到食品中還可影響產(chǎn)品的風(fēng)味、顏色、穩(wěn)定性、保水性和保油性，目前已被廣泛應(yīng)用于食品、保健品和藥品中（趙麗等，2014）。因此，研究樹仔菜中膳食纖維含量，可進(jìn)一步提高其深加工產(chǎn)品的附加值，延長樹仔菜等野生蔬菜加工的產(chǎn)業(yè)鏈?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】膳食纖維測(cè)定常用方法有洗滌法、酶化學(xué)法（Zhang and Wang，2013）、儀器法（趙麗等，2014）和酶重量法（張春華等，2015；Ma et al.，2015）。酶重量法是目前國際公認(rèn)的測(cè)定方法，具有操作簡單、易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，但也存在耗時(shí)長等缺點(diǎn)。Chen等（2011）研究發(fā)現(xiàn)，利用超聲輔助酶重量法可加快樣品中蛋白質(zhì)和淀粉的水解過程，縮短膳食纖維提取時(shí)間，目前此法已應(yīng)用于多種植物膳食纖維的提取。如苗敬芝等（2011）分別采用超聲水提法和超聲結(jié)合酶法提取生姜中水溶性膳食纖維，超聲時(shí)間均為25 min，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲結(jié)合酶法得到的提取率比超聲水提法提高38.2%；劉靜等（2014）采用超聲協(xié)同酶法提取香椿老葉可溶性膳食纖維，結(jié)果表明，在纖維素酶添加量0.50%、超聲溫度60.0 ℃、超聲時(shí)間53.0 min、pH 6.0條件下產(chǎn)品雜質(zhì)含量低，可溶性膳食纖維提取率為7.11%；趙泰霞和張明玉（2016）采用超聲輔助酶解法提取紅豆中的膳食纖維，通過單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化工藝，將酶解時(shí)間縮至60 min，得到膳食纖維提取率43.68%。關(guān)于樹仔菜中膳食纖維含量測(cè)定的研究報(bào)道極少，僅見于一些野生蔬菜營養(yǎng)成分測(cè)定的文獻(xiàn)資料中（周聰?shù)龋?010）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前尚無利用超聲輔助酶重量法提取樹仔菜中膳食纖維的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以樹仔菜為原料，利用超聲輔助酶重量法提取樹仔菜中總膳食纖維，優(yōu)化酶解條件，包括酶種類、酶添加量、溶液pH、超聲時(shí)間和超聲溫度等，提高總膳食纖維的提取效率，以期為后續(xù)野生蔬菜膳食纖維含量的研究提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

樹仔菜采自五指山市南圣樹仔菜試驗(yàn)基地，采集可食用嫩莖和葉片部位。耐高溫α-淀粉酶（生物試劑）、糖化酶（100000 U/mL）、木瓜蛋白酶（≥3 U/mg）、中性蛋白酶（≥4 U/mg）和胰蛋白酶（≥2500 U/mg）均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；堿性蛋白酶（生物試劑）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇、乙酸、氫氧化鈉、丙酮等均為國產(chǎn)分析純，購自廣州化學(xué)試劑廠。MES-TRIS緩沖液：稱取9.76 g 2-（N-嗎啉代）乙烷磺酸和6.10 g三羥甲基氨基甲烷，溶于850 mL蒸餾水中，用6 mol/L氫氧化鈉溶液于24 ℃調(diào)pH至8.2，加蒸餾水稀釋至1 L。

主要儀器設(shè)備：DGX-9143BC-1型鼓風(fēng)干燥箱（上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；kjeltec8420凱氏定氮儀（瑞典FOSS公司）；SXL-1030程控箱式爐（杭州卓馳儀器有限公司）；HR5026家用多功能粉碎機(jī)[飛利浦（中國）投資有限公司]。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 樹仔菜預(yù)處理 將樹仔菜樣品混勻后，稱取適量試樣置于（70±1）℃干燥至恒重，反復(fù)粉碎至完全過篩（篩板孔徑0.3 mm），置于干燥器中待用。

1. 2. 2 總膳食纖維提取 稱取1.0 g干燥后的樹仔菜樣品，加入40 mL MES-TRIS緩沖液，用磁力攪拌直至試樣完全分散在緩沖液中，調(diào)節(jié)溶液pH至5.0，添加0.60%木瓜蛋白酶、50 μL耐高溫α-淀粉酶和100 μL糖化酶，固定超聲功率100 W，于65 ℃超聲處理50 min，后續(xù)操作參照GB 5009.88-2014《食品中膳食纖維的測(cè)定》對(duì)試樣殘?jiān)M(jìn)行沉淀、抽濾和洗滌，沉淀物干燥稱重，即為總膳食纖維殘?jiān)?，并通過蛋白質(zhì)和灰分含量進(jìn)行校正，得到樣品總膳食纖維含量，計(jì)算總膳食纖維提取率，結(jié)果以干粉計(jì)。

總膳食纖維含量（g）=mR-mP-mA

總膳食纖維提取率（%）=總膳食纖維含量/樣品質(zhì)量×100

式中，mR為兩份樣品殘?jiān)|(zhì)量均值（g），mP為蛋白質(zhì)質(zhì)量（g），mA為灰分質(zhì)量（g）。

1. 2. 3 蛋白酶類篩選 取4份干燥后的樹仔菜樣品，分別加入木瓜蛋白酶（pH 5.7，55 ℃）、中性蛋白酶（pH 7.0，45 ℃）、堿性蛋白酶（pH 8.0，60 ℃）和胰蛋白酶（pH 8.0，50 ℃），并在各自最適酶解條件下酶解（豆康寧等，2009），后續(xù)操作參照1.2.2。

1. 2. 4 單因素試驗(yàn) 在1.2.3的基礎(chǔ)上，考察蛋白酶和淀粉酶添加量、溶液pH、超聲時(shí)間、超聲溫度等因素對(duì)樹仔菜總膳食纖維提取率的影響。固定其他條件，每個(gè)因素分別設(shè)5個(gè)水平，其中，木瓜蛋白酶添加量分別為0.25%、0.50%、0.60%、0.70%和0.80%；耐高溫α-淀粉酶添加量分別為30、40、50、60和70 μL；溶液pH分別為4.0、4.5、5.0、6.0和7.0；超聲時(shí)間分別為20、30、40、50和60 min；超聲溫度分別為45、55、65、75和85 ℃。

1. 2. 5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，固定其他條件，以木瓜蛋白酶添加量、溶液pH、超聲時(shí)間和超聲溫度為考察因素，按L9（34）正交試驗(yàn)法設(shè)置正交試驗(yàn)因素水平（表1）。

1. 2. 6 驗(yàn)證性試驗(yàn) 根據(jù)正交試驗(yàn)得到的樹仔菜總膳食纖維最佳提取工藝條件，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，計(jì)算提取率，與采用GB 5009.88-2014《食品中膳食纖維的測(cè)定》方法測(cè)得結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2007對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 蛋白酶種類對(duì)樹仔菜總膳食纖維提取率的影響

木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)樹仔菜總膳食纖維提取率的影響結(jié)果見表2，其排序?yàn)槟竟系鞍酌?中性蛋白酶>堿性蛋白酶>胰蛋白酶，以木瓜蛋白酶的總膳食纖維提取率最高，故選用木瓜蛋白酶進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2. 2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2. 2. 1 酶添加量對(duì)樹仔菜總膳食纖維提取率的影響

由圖1可知，在固定溶液pH 5.0、超聲時(shí)間50 min、超聲溫度65 ℃的條件下，酶解初期，隨著木瓜蛋白酶添加量的增加，蛋白酶不斷水解總膳食纖維中的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)含量下降，樹仔菜總膳食纖維提取率呈降低趨勢(shì)，木瓜蛋白酶添加量大于0.50%時(shí)，總膳食纖維提取率有較大幅度降低；當(dāng)木瓜蛋白酶添加量由0.60%增加至0.70%時(shí)，總膳食纖維提取率略有升高，僅提高了0.25%，變化不明顯，說明樣品中蛋白質(zhì)水解趨于完全。

圖2為耐高溫α-淀粉酶添加量對(duì)樹仔菜總膳食纖維提取率的影響結(jié)果。隨著耐高溫α-淀粉酶添加量的增加，樹仔菜總膳食纖維提取率呈先升高后降低的變化趨勢(shì)。耐高溫α-淀粉酶添加量小于50 μL時(shí)，總膳食纖維提取率呈上升趨勢(shì)；添加量大于50 μL后，總膳食纖維提取率呈下降趨勢(shì)。因此，耐高溫α-淀粉酶的最佳添加量為50 μL。

2. 2. 2 溶液pH對(duì)樹仔菜總膳食纖維提取率的影響

由圖3可知，在固定木瓜蛋白酶添加量0.60%、耐高溫α-淀粉酶添加量50 μL、超聲時(shí)間50 min、超聲溫度65 ℃的條件下，樹仔菜總膳食纖維提取率隨溶液pH的增大總體呈逐漸降低趨勢(shì)。其中，溶液pH在4.5～5.0范圍內(nèi)，樹仔菜總膳食纖維提取率基本維持不變，說明此時(shí)樹仔菜樣品中蛋白和淀粉的去除趨于充分；溶液pH大于5.0后，總膳食纖維提取率逐漸降低，可能是pH對(duì)木瓜蛋白酶活性和可溶性膳食纖維影響的結(jié)果。因此，選擇pH 5.0為宜。

2. 2. 3 超聲時(shí)間對(duì)樹仔菜總膳食纖維提取率的影響

從圖4可看出，在固定木瓜蛋白酶添加量0.60%、耐高溫α-淀粉酶添加量50 μL、pH 5.0、超聲溫度65 ℃的條件下，樹仔菜總膳食纖維提取率在超聲時(shí)間為20～50 min的范圍內(nèi)逐漸升高，超過50 min后，提取率逐漸下降?？赡苁浅暡ㄔ谖锪蟽?nèi)部產(chǎn)生強(qiáng)烈振動(dòng)、極高的加速度和強(qiáng)大的空化效應(yīng)（郭希娟等，2012），對(duì)植物細(xì)胞和分子間的作用明顯，加速酶解過程，提高酶解效率；延長超聲時(shí)間，總膳食纖維結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致總膳食纖維提取率下降。故選擇超聲時(shí)間50 min為宜。

2. 2. 4 超聲溫度對(duì)樹仔菜總膳食纖維提取率的影響 由圖5可知，在固定木瓜蛋白酶添加量0.60%、耐高溫α-淀粉酶添加量50 μL、pH 5.0、超聲時(shí)間50 min的條件下，樹仔菜總膳食纖維提取率隨超聲溫度的升高逐漸上升，于65 ℃時(shí)達(dá)最大值（40.8%）。但超聲溫度超過65 ℃后，總膳食纖維提取率緩慢下降，可能是溫度過高會(huì)使溶劑汽化，不利于總膳食纖維的提取。故選擇65 ℃為最佳超聲溫度。

2. 2. 5 各因素與總膳食纖維提取率的方差分析結(jié)果

利用Excel 2007對(duì)不同提取條件的樹仔菜總膳食纖維提取率進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。木瓜蛋白酶添加量和超聲時(shí)間對(duì)樹仔菜總膳食纖維提取率有極顯著影響（P<0.01），溶液pH和超聲溫度對(duì)提取率有顯著影響（P<0.05），耐高溫α-淀粉酶添加量對(duì)提取率影響不顯著（P>0.05）。

2. 3 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表4可知，超聲輔助酶重量法提取樹仔菜總膳食纖維的最佳工藝組合為A1B2C2D2，即木瓜蛋白酶添加量0.60%、溶液pH 5.0，超聲時(shí)間50 min、超聲溫度65 ℃。4個(gè)因素對(duì)提取率影響程度的排序：木瓜蛋白酶添加量>超聲時(shí)間>超聲溫度>溶液pH。

2. 4 驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)2.3的最佳提取工藝條件，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得到樹仔菜總膳食纖維提取率為45.0%（變異系數(shù)1.89%，蛋白質(zhì)含量0.33%），與采用GB 5009.88-2014《食品中膳食纖維的測(cè)定》的測(cè)定結(jié)果44.8%（變異系數(shù)1.42%，蛋白質(zhì)含量12.47%）進(jìn)行對(duì)比，兩種方法的測(cè)定結(jié)果基本一致。

3 討論

樹仔菜蛋白質(zhì)含量是普通蔬菜的2～4倍，而脂肪、多糖等成分含量較低，因此去除蛋白質(zhì)是提取膳食纖維的重要工序。在酶工藝中，酶的選擇原理是依據(jù)其特異性，根據(jù)酶作用位點(diǎn)的不同，影響蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。食品膳食纖維測(cè)定中，常用于水解植物蛋白質(zhì)的酶有胰蛋白酶（孫靜亞和田麗，2010）、堿性蛋白酶（杜欣悅，2014）、中性蛋白酶（韋琴和黃婉星，2014）、木瓜蛋白酶（趙泰霞和張明玉，2016）等，其中木瓜蛋白酶來源于植物，中性蛋白酶和堿性蛋白酶來源于微生物，胰蛋白酶來源于動(dòng)物。本研究選擇這4種蛋白酶用于樹仔菜總膳食纖維提取，結(jié)果表明，木瓜蛋白酶更有利于樹仔菜總膳食纖維的提取，提取率最高，而胰蛋白酶作用下的樹仔菜總膳食纖維提取率最低，可能與木瓜蛋白酶水解蛋白質(zhì)的溶液pH和溫度范圍較寬有關(guān)（宋海瓊等，2012）。

酶重量法是利用酶去除淀粉和蛋白質(zhì)，用乙醇沉淀水溶性膳食纖維，將過濾的膳食纖維殘?jiān)Q重，并通過蛋白質(zhì)和灰分含量進(jìn)行校正（Dhingra et al.，2012）。GB 5009.88-2014《食品中膳食纖維的測(cè)定》規(guī)定了酶重量法為食品中膳食纖維的測(cè)定方法，其酶解過程通常反應(yīng)95 min。本研究在GB 5009.88-2014方法基礎(chǔ)上，利用超聲輔助樹仔菜總膳食纖維提取過程，超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動(dòng)使樹仔菜組織各成分得到更有效地分離，酶解過程耗時(shí)控制在60 min內(nèi)，縮短了酶解時(shí)間，在一定程度上提高了提取效率。利用優(yōu)化工藝提取樹仔菜總膳食纖維的提取率45.0%，與GB 5009.88-2014的測(cè)定結(jié)果（44.8%）基本一致，變異系數(shù)小于5.00%。

目前，有關(guān)超聲輔助技術(shù)結(jié)合酶重量法提取樹仔菜等野生蔬菜膳食纖維的應(yīng)用報(bào)道極少，影響因素的探討及功能性質(zhì)的分析仍需不斷完善和解決，如超聲功率的影響，提取出的膳食纖維組成成分、持水力、膨脹力、持油力、陽離子交換能力等的分析。下一步將對(duì)樹仔菜總膳食纖維的持水力、膨脹力等功能性質(zhì)進(jìn)行研究，以便積累更多的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，為后續(xù)野生蔬菜膳食纖維含量研究工作打下基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化得到超聲輔助酶重量法提取樹仔菜總膳食纖維的工藝條件為：木瓜蛋白酶添加量0.60%、溶液pH 5.0、超聲時(shí)間50 min、超聲溫度65 ℃，在此條件下的樹仔菜總膳食纖維提取率為45.0%。超聲輔助酶重量法提取樹仔菜總膳食纖維具有酶解時(shí)間短、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，具有較高的可行性，可用于批量樣品總膳食纖維的提取。

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（責(zé)任編輯 羅 麗）