馬氏珠母貝細胞內(nèi)視黃酸結(jié)合蛋白表達及其與類胡蘿卜素的相關(guān)性分析

雷超 鄭哲 李俊輝 王慶恒 黃榮蓮 鄧岳文

摘要：【目的】明確細胞內(nèi)視黃酸結(jié)合蛋白（CRABP）對馬氏珠母貝吸收代謝類胡蘿卜素的影響，為培育富含類胡蘿卜素的馬氏珠母貝養(yǎng)殖新品系打下基礎?！痉椒ā坎捎肦ACE克隆馬氏珠母貝CRABP基因（PmCRABP）cDNA全長序列，并以實時熒光定量PCR檢測分析PmCRABP基因在各組織中的表達特征及其在黃白閉殼肌中的表達量?！窘Y(jié)果】PmCRABP基因cDNA全長1778 bp，開放閱讀框（ORF）長366 bp，編碼121個氨基酸，其5'非翻譯區(qū)（5'UTR）長125 bp，3'UTR長1287 bp。PmCRABP的分子量13.51 kD，理論等電點（pI）5.68，脂溶性系數(shù)62.81，不穩(wěn)定指數(shù)35.38，總平均親水性-0.517，其第5～120個氨基酸為Lipocalin家族的結(jié)構(gòu)域。PmCRABP氨基酸序列與新對蝦（Metapenaeus ensis）CRABP氨基酸序列的相似度最高，同屬于CRABP蛋白，且二者的空間結(jié)構(gòu)極其相似。PmCRABP基因在馬氏珠母貝肝胰腺中的表達量最高，其后依次是外套膜、鰓和閉殼肌，各組織的表達量差異顯著（P<0.05，下同）。黃白閉殼肌個體的類胡蘿卜素含量與PmCRABP基因相對表達量存在顯著差異，且二者間呈明顯的正相關(guān)?！窘Y(jié)論】PmCRABP參與了馬氏珠母貝的類胡蘿卜素代謝。

關(guān)鍵詞： 馬氏珠母貝；細胞內(nèi)視黃酸結(jié)合蛋白（CRABP）；類胡蘿卜素；克??；表達

中圖分類號： S968.316.1 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）06-1086-07

Abstract：【Objective】Effects of intracellular retinoic acid-binding protein（CRABP） on absorption and metabolism of carotenoid in Pinctada fucata martensii were investigated to lay a foundation for breeding carotenoid-rich strains. 【Method】In this study， cDNA full length sequence of PmCRABP was obtained using RACE technology. Expression cha-

racters of PmCRABP gene in different tissues and its expression in white and yellow colored adductor muscle were detected by real-time fluorescence quantitative PCR. 【Result】The full length of PmCRABP gene was 1778 bp， including 366 bp of open reading frame（ORF）， encoded 121 amino acids， a 5'untranslated region（5'UTR） of 125 bp and a 3'UTR of 1287 bp. The molecular weight was 13.51 kD， theoretical isoelectric point（pI） was 5.68， aliphatic index was 62.81 ，instability index was 35.38 and the grand average of hydropathicity（GRAVY） was -0.517. The 5th to the 120th amino acids of the PmCRABP protein were the domains of Lipocalin family. Comparative analysis between amino acid sequence of PmCRABP and that of CRABP of other species indicated that， the similarity between PmCRABP and Metapenaeus ensis CRABP was the highest. Expression of PmCRABP gene in hepatopancreas of P. fucata martensii was the highest， and followed by mantle， gill and adductor muscle. There was significant difference between expressions in different tissues（P<0.05，the same beow）. Carotenoid contents and PmCRABP gene expression in yellow and white adductor muscles were significantly different， and there was a significant positive correlation between carotenoid content and PmCRABP expression. 【Conclusion】The results showed that PmCRABP gene is involved in carotenoid metabolism of P. fucata martensii.

Key words： Pinctada fucata martensii； intracellular retinoic acid-binding protein（CRABP）； carotenoid； cloning； expression

0 引言

【研究意義】馬氏珠母貝（Pinctada fucata martensii）是我國廣東、廣西和海南地區(qū)的重要經(jīng)濟養(yǎng)殖貝類，主要用于生產(chǎn)有核珍珠（王大鵬等，2011）。除了生產(chǎn)海水珍珠外，馬氏珠母貝還是一種營養(yǎng)價值較高的貝類，富含?；撬帷o機鹽及微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)，其貝肉中的糖胺聚糖成分具有抑瘤、抗凝血等功效（郝瑞娟等，2015；陳雪欣等，2016），?；撬峋哂锌蛊?、抑制血小板凝集、降血壓血脂、降低膽固醇、保護視力及促進大腦發(fā)育等生理功能（孔曉榮，1993）。因此，培育富含營養(yǎng)成分的馬氏珠母貝養(yǎng)殖新品系，是促進馬氏珠母貝養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)發(fā)展的新路徑。【前人研究進展】視黃酸（Retinoic acid，RA）是維生素A的活性衍生物，屬于一種低分子量的脂溶性信號分子（Balling，1991）。RA對脊椎動物的正常發(fā)育、組織細胞增生等起重要作用（黃蓓，1994；Sharma et al.，2003）。如RA會影響斑馬魚胚胎心臟房室分化（張立鳳等，2007），是受孕期間及整個妊娠過程中決定胚胎是否能良好發(fā)育的一個重要因素（李艷敏等，2014）。RA含有共軛雙鍵，極易被氧化劑氧化，必須在體內(nèi)與細胞視黃酸結(jié)合蛋白（Cellular retinoic acid-binding protein，CRABP）結(jié)合以維持其穩(wěn)定性（齊焰和謝院生，2015），即CRABP參與RA代謝。依據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分類數(shù)據(jù)庫分類，CRABP屬于脂質(zhì)運載蛋白超家族成員，該蛋白家族成員均包含6或8個β桶，作為三級結(jié)構(gòu)和高度保守結(jié)構(gòu)域的一部分（Zhang et al.，2012），其主要功能是運載類固醇、類胡蘿卜素、類維生素A及其他小疏水性分子（Yang et al.，2011）。CRABP可分為CRABP1和CRABP2，其中，CRABP1能增強P450氧化酶而抑制RA在細胞中的功能作用，CRABP2則是將RA從細胞質(zhì)攜帶進入細胞核的關(guān)鍵因子（楊芳，2011；李華等，2012）。目前，有關(guān)CRABP的研究主要集中在脊椎動物上，Lee等（2006）對豬的CRABP1基因進行了定位，楊艷萍等（2013）研究了小鼠胚胎CRABP1陽性神經(jīng)嵴細胞的時空分布與功能?！颈狙芯壳腥朦c】明確CRABP在貝類胡蘿卜素代謝中的作用，可為培育富含類胡蘿卜素的貝類新品系打下基礎，但至今有關(guān)CRABP在貝類上的研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用RACE克隆馬氏珠母貝CRABP基因（PmCRABP）的cDNA全長序列，分析PmCRABP基因在各組織中的表達特征及其在黃白閉殼肌中的表達量，明確PmCRABP對馬氏珠母貝吸收代謝類胡蘿卜素的影響，為培育富含類胡蘿卜素的養(yǎng)殖新品系打下基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試馬氏珠母貝來源于基礎群體，均為2齡貝，養(yǎng)殖在廣東湛江市徐聞縣大井村海區(qū)，選取規(guī)格較一致（38.01±4.13 g）的個體進行試驗。剪取其外套膜、肝胰腺、閉殼肌和鰓用于基因克隆與組織定量表達分析；同時選取黃色與白色閉殼肌個體，取閉殼肌用于類胡蘿卜素含量與基因表達量分析。采集的樣品均置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。總RNA提取試劑Trizol購自美國Invitrogen公司，pMD19-T載體、DNA Marker、LA Taq DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒等購自寶生物工程（大連）有限公司，實時熒光定量PCR試劑盒購自Thermo Fisher Scientific公司，RACE試劑盒購自Clontech公司。

1. 2 PmCRABP基因全長cDNA克隆及序列分析

1. 2. 1 總RNA提取及第一鏈cDNA合成 采用Trizol提取不同組織和黃白閉殼肌的總RNA，以10 mg/mL瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性、SimpliNano核酸蛋白定量儀檢測RNA濃度及純度。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成中間片段cDNA模板，5'RACE和3'RACE模板的制備參照RACE試劑盒說明。

1. 2. 2 引物設計與合成 從本課題組已建立的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選出與PmCRABP基因相似度較高的unigene片段，并以Primer Premier 5.0設計特異性引物（表1）。

1. 2. 3 PmCRABP基因片段克隆 PCR反應體系及擴增程序參照LA Taq DNA聚合酶說明進行操作，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測為目的條帶后，純化并連接至pMD19-T載體，再轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α，菌液培養(yǎng)1 h后涂布于含Amp+的固體培養(yǎng)基上37 ℃倒置培養(yǎng)12 h，挑取陽性克隆進行PCR檢測，并將目的基因送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。同時，采用巢式PCR對PmCRABP基因的3'端和5'端進行RACE擴增。

1. 2. 4 序列分析 利用DNAMAN將測序片段進行拼接，以獲得PmCRABP基因cDNA全長。同時，采用NCBI（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中的BLAST程序進行序列同源性比對和相似性分析，采用ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi）對PmCRABP基因進行開放閱讀框（ORF）和蛋白序列預測，采用DNAMAN中的Phylogenetic tree構(gòu)建基于CRABP的系統(tǒng)發(fā)育進化樹，采用MUSCLE（http：//

www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/）對PmCRABP氨基酸序列與其他物種CRABP氨基酸序列進行同源性比對分析，使用SMART程序預測分析PmCRABP蛋白結(jié)構(gòu)域，分別以ExPASy（http：//web. expasy.org/ vg/index/

protein）和SignalP4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/

Signal/）對其氨基酸序列的理化性質(zhì)進行分析和信號肽預測，采用TMHMM Server v.2.0預測PmCRABP蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，采用Motif Scan（http：//myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan）對PmCRABP蛋白進行功能位點檢測，并以SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.

fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）預測PmCRABP蛋白的二級結(jié)構(gòu)、SWISS-MODEL（http：//

swissmodel.expasy.org/）預測PmCRABP蛋白的三級結(jié)構(gòu)。

1. 3 黃白閉殼肌類胡蘿卜素的提取與測定

參考吳小芬等（2016）的方法進行黃白閉殼肌類胡蘿卜素含量測定分析，即分別準確稱量黃白閉殼肌0.1 g，加入等量無水硫酸鈉和5 mL丙酮（分析純）充分勻漿，另加入5 mL丙酮潤洗勻漿器2次，然后一并轉(zhuǎn)入10 mL的具塞試管中，用錫紙避光密封，4 ℃下保存3 d后4000 r/min離心10 min，取上清液，以紫外分光光度計在480 nm 處測定吸光值。

總類胡蘿卜素含量（μg/g）= A×K×V/E×G

式中，A為吸光值，K為常數(shù)（104），V為提取液體積（mL），E為摩爾消光系數(shù)（2500），G為樣品質(zhì)量（g）。

1. 4 不同組織中的PmCRABP基因差異表達

采用實時熒光定量PCR分別檢測馬氏珠母貝鰓、外套膜、閉殼肌、肝胰腺和黃白閉殼肌的PmCRABP基因表達情況，通過2-ΔΔCt計算其相對表達量，并以SPSS 19.0進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 PmCRABP基因的克隆與序列分析結(jié)果

通過RACE擴增分別獲得PmCRABP基因的5'非翻譯區(qū)（5'UTR）和3'UTR，其中，5'UTR長125 bp，3'UTR長1287 bp。利用DNAMAN將測序片段進行拼接后，得到PmCRABP基因cDNA全長1778 bp，其開放閱讀框（ORF）366 bp，編碼121個氨基酸（圖1）。

2. 2 PmCRABP的理化性質(zhì)分析結(jié)果

經(jīng)相關(guān)在線軟件預測發(fā)現(xiàn)，PmCRABP的分子量13.51 kD，理論等電點（pI）5.68，脂溶性系數(shù)62.81，不穩(wěn)定指數(shù)35.38，屬于穩(wěn)定蛋白（圖2）；總平均親水性-0.517，屬于疏水性蛋白。SignalP4.1預測結(jié)果顯示，PmCRABP不含信號肽，屬于非分泌蛋白。經(jīng)SMART分析得知，PmCRABP的第5～120個氨基酸為Lipocalin家族結(jié)構(gòu)域。PmCRABP功能位點檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該蛋白有1個cAMP和cGMP依賴性的蛋白激酶磷酸化位點、2個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點、2個N-豆蔻?；稽c、3個蛋白激酶C磷酸化位點和1個胞質(zhì)脂肪酸結(jié)合蛋白信號位點。

2. 3 PmCRABP與其他物種的同源性比對分析結(jié)果

利用DNAMAN中的Phylogenetic tree對不同物種的視黃醇類蛋白（表1）進行聚類分析，結(jié)果顯示，CRABP蛋白、CRBP蛋白和RBP蛋白各自分開形成一簇（圖3）。其中，馬氏珠母貝與新對蝦聚在同一亞支上，同屬于CRABP蛋白，說明它們起源于同一祖先的基因復制。

采用MUSCLE對小家鼠（M. domesticus，CAA-

36011.1）、新對蝦（M. ensis，AAL68638.1）、煙草天蛾（M. sexta，AAC24317.1）、家蠶（B. mori，NP_0010373-

64.1）和PmCRABP氨基酸序列進行同源比對分析，結(jié)果（圖4）表明，PmCRABP與小家鼠、煙草天蛾和家蠶的CRABP氨基酸序列同源性不高，但與新對蝦的同源性較高。

SOPMA二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果表明，PmCRABP的α螺旋占22.31%、β轉(zhuǎn)角占14.88%、無規(guī)則卷曲占30.58%、延伸鏈占32.23%。利用SWISS-MODEL對PmCRABP和新對蝦CRABP蛋白進行三級結(jié)構(gòu)預測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者的空間結(jié)構(gòu)極其相似（圖5）。以TMHMM Server v.2.0預測PmCRABP的跨膜結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示PmCRABP無跨膜結(jié)構(gòu)，即符合PmCRABP為胞內(nèi)蛋白的特點。

2. 4 黃白閉殼肌個體的總類胡蘿卜素含量及PmCRABP基因表達量

采用丙酮萃取法對馬氏珠母貝的黃白閉殼肌進行總類胡蘿卜素提取，并以實時熒光定量PCR檢測PmCRABP基因在黃白閉殼肌中的表達量。結(jié)果表明，黃色閉殼肌中的總類胡蘿卜素含量（圖6）及PmCRABP基因表達量（圖7）均顯著高于白色閉殼?。≒<0.05，下同），且總類胡蘿卜素含量與PmCRABP基因表達量呈明顯的正相關(guān)。

2. 5 Pm-CRABP基因的組織表達差異分析結(jié)果

以實時熒光定量PCR檢測馬氏珠母貝鰓部、外套膜、閉殼肌、肝胰臟PmCRABP基因的相對表達量，結(jié)果表明，PmCRABP基因在以上組織均有表達，且在肝胰臟的相對表達量顯著高于其他組織（圖8）。

3 討論

本研究利用RACE克隆獲得PmCRABP基因序列，其cDNA全長1778 bp，共編碼121個氨基酸。經(jīng)NCBI中的BLAST分析，發(fā)現(xiàn)PmCRABP含有Lipocalin結(jié)構(gòu)域，即屬于Lipocalin超家族。PmCRABP是一種低分子量的細胞內(nèi)結(jié)合蛋白，在體內(nèi)負責結(jié)合視黃酸和其他相關(guān)脂肪酸（Gu et al.，2002）。經(jīng)相關(guān)在線軟件預測發(fā)現(xiàn)，PmCRABP的分子量13.51 kD，符合該類蛋白分子量低的特點。在動物體內(nèi)，RA是維生素A最終的活性代謝產(chǎn)物（齊焰和謝院生，2015），而維生素A是一種動物機體必需的脂溶性維生素，機體無法自行合成而必須從食物中獲取，其主要來源為植物中的類胡蘿卜素和動物中的視黃酯（李艷敏等，2014）。自然界中存在600多種類胡蘿卜素，其中約50種具有活性，以β-胡蘿卜素活性最高（王二玲，2009）。被動物攝取的β-胡蘿卜素在腸道內(nèi)經(jīng)β-胡蘿卜素-15，15'-加氧酶（βCMOOX）氧化生成2個分子的視黃醇（維生素A），接著被吸收入體內(nèi)氧化成視黃醛，再進一步被氧化成RA（Mezaki et al.，2012）。王二玲（2009）研究發(fā)現(xiàn)，全反式視黃酸能顯著降低肉仔雞十二指腸、空腸和腎臟內(nèi)的βCMOOX活性，且抑制作用與其濃度（0～4 μmol/L）呈正比。由此推測，在馬氏珠母貝體內(nèi)PmCRABP是通過結(jié)合RA來參與類胡蘿卜素代謝。

RA的生物轉(zhuǎn)化過程在CRABP、視黃醇結(jié)合蛋白（RBR）和細胞內(nèi)視黃醇結(jié)合蛋白（CRBP）的協(xié)助下依次在小腸、肝臟和目標細胞中完成（Das et al.，2014）。為比較PmCRABP基因在馬氏珠母貝不同組織中的表達量，本研究采用實時熒光定量PCR對馬氏珠母貝閉殼肌、鰓、肝胰臟和外套膜4個組織中的PmCRABP基因進行檢測，結(jié)果顯示在肝胰腺的相對表達量最高，但具體轉(zhuǎn)運機制有待進一步探究。CRABP作為結(jié)合RA的特定蛋白，主要存在于RA含量較高的組織中（Balling，1991），而RA對β-胡蘿卜素又有反饋調(diào)控作用（王二玲，2009）。本研究也發(fā)現(xiàn)，基礎群體黃白閉殼肌個體的總類胡蘿卜素含量存在顯著差異，對應的PmCRABP基因表達量也存在顯著差異，且總類胡蘿卜素含量與PmCRABP基因表達量呈明顯的正相關(guān)，進一步說明PmCRABP是通過結(jié)合RA來參與類胡蘿卜素代謝。

4 結(jié)論

馬氏珠母貝黃白閉殼肌個體的總類胡蘿卜素含量和PmCRABP基因相對表達量均存在顯著差異，且二者間呈明顯的正相關(guān)，說明PmCRABP參與了馬氏珠母貝的類胡蘿卜素代謝。

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（責任編輯 蘭宗寶）