米糠液態(tài)發(fā)酵紫色紅曲霉產(chǎn)色素的營(yíng)養(yǎng)因子優(yōu)化

夏欣欣，陳 迪，姜 凌，郭明偉，劉曼麗，孫晶晶，吳興泉

河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001

紅曲霉(Monascusspp.)是一種藥食兩用的絲狀真菌[1]，在中國(guó)、日本和東南亞國(guó)家用于食品發(fā)酵和藥物生產(chǎn)已有近2 000年的歷史[2]。紅曲霉可以產(chǎn)生多種有益次級(jí)代謝產(chǎn)物，通常具有聚酮結(jié)構(gòu)和生物活性，包括紅曲色素(MPs)[3]、莫納可林K(MK)[4]和γ-氨基丁酸等[5]。紅曲色素作為著色劑在食品領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，如腐乳[6]、肉制品[7]、紅曲黃酒[8]、紅曲面包[9]等。由于化學(xué)合成著色劑對(duì)健康的不利影響，微生物來(lái)源的天然食品著色劑相較來(lái)說(shuō)則更為安全，通過(guò)感官和生物安全性評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)紅曲色素具有食品著色劑的生物安全性和適用性[10]。紅曲色素是一種混合色素，其中主要的6種色素是紅色素(紅斑胺(rubropunctamine)[11]、紅曲紅胺(monascorubramine)[12])、橙色素(紅斑素(rubropunctatin)[13]、紅曲紅素(monascorubrin)[12])和黃色素(紅曲素(monascin)[14]、紅曲黃素(ankaflavin)[13])。紅曲色素的各個(gè)組分可以用于不同食品的著色。此外，紅曲色素還具有抗炎[15]、抗癌[16]、抑制肥胖[17]、降血糖[18]等功效。近年來(lái)紅曲色素已成為微生物源天然色素中發(fā)展速度最快的食品添加劑之一。

目前，發(fā)酵紅曲霉產(chǎn)紅曲色素的原料主要是大米，而大米作為世界第二大主糧，供給全球1/2人口，完全依賴大米為培養(yǎng)基質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)紅曲色素，無(wú)疑增加了紅曲色素的生產(chǎn)成本[19]。在大米加工過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物米糠，其含量可占糙米的5%～8%，全球年產(chǎn)量約2 930萬(wàn)t[19]。米糠是米粒的外層，主要由果皮、糊粉層、亞糊粉層和胚芽組成，其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，膳食纖維量大，抗氧化能力強(qiáng)，對(duì)多種代謝性疾病有一定的治療作用，但常被用作動(dòng)物飼料，或被當(dāng)作廢物扔掉[19]。若能將米糠作為紅曲色素的生產(chǎn)原料，可降低生產(chǎn)成本，提高農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物米糠的利用價(jià)值。

近年來(lái)利用農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物生產(chǎn)紅曲色素的研究報(bào)道越來(lái)越多，De Almeida等[20]以玉米麩皮為原料，采用深度發(fā)酵工藝優(yōu)化紅曲色素的生產(chǎn)工藝。Silva等[21]以農(nóng)業(yè)和工業(yè)廢渣(米粉和甘蔗糖蜜)為基質(zhì)生產(chǎn)紅曲霉色素。Liu等[22]用水稻秸稈添加葡萄糖為培養(yǎng)基提高了紅曲色素的色價(jià)。然而，以米糠為基質(zhì)添加外源營(yíng)養(yǎng)因子以提高紅曲色素產(chǎn)量的研究報(bào)道并不多見(jiàn)。吳雙雙等[23]以米糠為基質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)MPs和MK，發(fā)現(xiàn)米糠更適合紅曲霉產(chǎn)MK，且并未發(fā)現(xiàn)有效提高M(jìn)Ps產(chǎn)量的刺激物。

本試驗(yàn)以米糠為基質(zhì)，以色價(jià)為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選了不同碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽作為營(yíng)養(yǎng)因子，研究其對(duì)紫色紅曲霉M9產(chǎn)色素的影響，并采用響應(yīng)曲面分析得到了提高紅曲色素產(chǎn)量的最佳營(yíng)養(yǎng)組成，同時(shí)采用TLC和HPLC分析了優(yōu)化前后紅曲色素的組分變化，為綜合利用糧食副產(chǎn)物和提高紅曲色素產(chǎn)量提供了技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

從河南省原陽(yáng)市宴賓米業(yè)購(gòu)買(mǎi)糙米，經(jīng)碾米機(jī)打磨(1 060 r/min)得到米糠；試驗(yàn)使用菌株為實(shí)驗(yàn)室保藏菌種MonascuspurpureusM9(NO.CGMCC 3.19586)。

1.2 儀器與設(shè)備

TM05C碾米機(jī)：佐竹(蘇州)機(jī)械有限公司；Spark酶標(biāo)儀：深圳市恩科生物科技有限公司；DK-S24水浴鍋：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；BBS-DDC超凈工作臺(tái)：濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司；QYC-200搖床：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；AGILENT 1260高效液相色譜儀：安捷倫(中國(guó))科技有限公司；DHP-500恒溫培養(yǎng)箱：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基配方

斜面培養(yǎng)基：麥芽汁糖化液(10度)加入3%瓊脂，于121 ℃滅菌20 min。滅菌完成后傾斜擺放，待凝固后備用。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖6.0 g，蛋白胨2.0 g，NaNO31.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41.0 g，用水定容至100 mL，121 ℃滅菌20 min。

米糠液態(tài)基本培養(yǎng)基：米糠2.5 g，用水定容至50 mL，121 ℃滅菌20 min。

大米液態(tài)基本培養(yǎng)基：大米2.5 g，用水定容至50 mL，121 ℃滅菌20 min。

碳源液態(tài)培養(yǎng)基：米糠2.5 g，外加一定質(zhì)量不同種類(lèi)碳源，用水定容至50 mL，121 ℃滅菌20 min。

氮源液態(tài)培養(yǎng)基：米糠2.5 g，外加一定質(zhì)量不同種類(lèi)氮源，用水定容至50 mL，121 ℃滅菌20 min。

無(wú)機(jī)鹽液態(tài)培養(yǎng)基：米糠2.5 g，外加一定質(zhì)量不同種類(lèi)無(wú)機(jī)鹽，用水定容至50 mL，121 ℃滅菌20 min。

1.3.2 液態(tài)發(fā)酵紅曲霉M9

刮取斜面菌絲接種于種子培養(yǎng)基，180 r/min培養(yǎng)(36～48 h)得到種子培養(yǎng)液，經(jīng)8層紗布過(guò)濾得到孢子懸液，無(wú)菌水調(diào)節(jié)孢子濃度達(dá)106個(gè)/mL，取孢子懸液接種于50 mL液體培養(yǎng)基中，接種量6.00%，在28 ℃，180 r/min條件下發(fā)酵5 d。

1.3.3 色素提取液的制備

參照薛原[24]使用的方法進(jìn)行色素液的提取。

1.3.4 色價(jià)的測(cè)定

參照薛原[24]使用的方法進(jìn)行胞內(nèi)色價(jià)的測(cè)定，于505 nm處測(cè)定吸光度，并代入下列公式計(jì)算：

式中：S為樣品的色價(jià)，U/g；A為稀釋液的吸光度；n為稀釋倍數(shù)；G為菌絲質(zhì)量，g。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

碳源選擇添加葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖、木糖、甘露醇、木糖醇、果糖，氮源選擇添加蛋白胨、尿素、谷氨酸鈉、(NH4)2SO4、NaNO3、NH4NO3，無(wú)機(jī)鹽選擇添加KH2PO4、MgSO4、ZnSO4、FeSO4、MnSO4。通過(guò)單因素試驗(yàn)考察外加碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽對(duì)米糠發(fā)酵產(chǎn)色素的影響。

1.3.6 最陡爬坡試驗(yàn)

通過(guò)單因素試驗(yàn)，確定對(duì)米糠產(chǎn)色素影響較大的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽，選取合適的水平及梯度進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)。

1.3.7 響應(yīng)面分析

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果，確定中心點(diǎn)，利用Design export 12進(jìn)行中心組合設(shè)計(jì)，并進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。再根據(jù)響應(yīng)面分析結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

1.3.8 TLC法初步分離紅曲色素

參照屈炯[25]使用的方法進(jìn)行薄層色譜分離發(fā)酵所產(chǎn)紅曲色素，分離得到紅、黃、橙等色素條帶。

1.3.9 高效液相色譜法測(cè)定紅曲色素組分

參照Chen等[26]使用的梯度洗脫方法進(jìn)行紅曲色素組分的測(cè)定。

1.3.10 橘霉素的測(cè)定

參照薛原[24]使用的高效液相方法進(jìn)行橘霉素的測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，利用Origin 9.0、SAS 9.0和Design export 12對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對(duì)紫色紅曲霉M9產(chǎn)紅曲色素色價(jià)的影響

由圖1可知：隨著葡萄糖及半乳糖添加量的增加，色價(jià)都呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，當(dāng)葡萄糖添加量為4.00%時(shí)，色價(jià)最高可達(dá)703.90 U/g；半乳糖添加量為3.00%時(shí)，色價(jià)最大，為67.90 U/g；添加蔗糖和麥芽糖時(shí)，色價(jià)呈現(xiàn)波浪狀的變化趨勢(shì)，添加蔗糖的最高色價(jià)僅達(dá)83.32 U/g，而添加麥芽糖的最高色價(jià)可達(dá)555.80 U/g。上述4種碳源中，添加半乳糖和蔗糖的最高色價(jià)甚至低于純米糠發(fā)酵的色價(jià)(106.15 U/g)，表明半乳糖和蔗糖對(duì)米糠發(fā)酵產(chǎn)紅曲色素沒(méi)有提升作用。添加木糖、木糖醇、甘露醇及果糖后，色價(jià)呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，其中添加甘露醇的色價(jià)最高，可達(dá)1 138.90 U/g(5.00%)；添加果糖的色價(jià)次之，可達(dá)981.30 U/g；添加木糖的色價(jià)(707.50 U/g)和木糖醇的色價(jià)(719.00 U/g)不僅趨勢(shì)相似，最高色價(jià)也接近。由此可見(jiàn)，以米糠為基質(zhì)添加碳源能顯著提高紅曲色素的色價(jià)，其中甘露醇效果最顯著，色價(jià)是純米糠發(fā)酵的(106.15 U/g)10.73倍，其次是果糖。

2.2 氮源對(duì)紫色紅曲霉M9產(chǎn)紅曲色素色價(jià)的影響

如圖2所示，隨著氮源添加量的增加，其中添加尿素、谷氨酸鈉、蛋白胨的色價(jià)均呈現(xiàn)一直下降的趨勢(shì)。尿素的最高色價(jià)可達(dá)105.60 U/g，谷氨酸鈉的最高色價(jià)僅有95.76 U/g，蛋白胨的最高色價(jià)也只有132.64 U/g，尿素、谷氨酸鈉及蛋白胨的添加并沒(méi)有顯著提升米糠的色價(jià)。隨著硫酸銨添加量的增加，紅曲色素的色價(jià)先上升后下降再有所回升，于1.50%處達(dá)最高色價(jià)(172.64 U/g)。NaNO3和NH4NO3隨著添加量的增加，色價(jià)均先上升后下降，NaNO3和NH4NO3的最高色價(jià)分別可達(dá)154.92 U/g、252.64 U/g，添加NH4NO3的色價(jià)是純米糠色價(jià)(106.15 U/g)的2.38倍。綜上所述，所選氮源中NH4NO3對(duì)米糠發(fā)酵產(chǎn)色素的能力提升最為顯著，后續(xù)試驗(yàn)選擇NH4NO3進(jìn)一步優(yōu)化。

2.3 無(wú)機(jī)鹽對(duì)紫色紅曲霉M9產(chǎn)紅曲色素色價(jià)的影響

由圖3可知：隨著FeSO4添加量的增加，色價(jià)先下降再升高，最高色價(jià)可達(dá)229.44 U/g；MnSO4添加后色價(jià)呈起伏式變化，當(dāng)添加量為0.20%時(shí)，色價(jià)達(dá)最高值(234.44 U/g)；添加KH2PO4后色價(jià)整體呈上升趨勢(shì)，于0.30%處達(dá)最高色價(jià)(260.84 U/g)；添加MgSO4和ZnSO4后色價(jià)呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，MgSO4的添加量為0.20%時(shí)，色價(jià)最高，為196.80 U/g，當(dāng)ZnSO4添加量為0.40%時(shí)，發(fā)酵所得色素的色價(jià)(396.00 U/g)是純米糠的(106.15 U/g)3.73倍。添加ZnSO4能顯著提高米糠發(fā)酵產(chǎn)色素的能力，故選擇ZnSO4作為下一步優(yōu)化的因素之一。

2.4 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，碳源選取甘露醇、氮源選取NH4NO3、無(wú)機(jī)鹽選取ZnSO4，并選擇合適的坡度進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。由表1可知，第2組(甘露醇添加量為5.00%、ZnSO4添加量為0.40%、NH4NO3添加量為1.00%)的色價(jià)最高(1 209.60 U/g)，以這個(gè)添加量為中心點(diǎn)進(jìn)行下一步響應(yīng)面優(yōu)化。

表1 最陡爬坡試驗(yàn)

2.5 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素及最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果，選取合適的因素(甘露醇添加量、ZnSO4添加量、NH4NO3添加量)及水平進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。響應(yīng)面水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3。利用Design-Expert 12 軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)及回歸分析，以505 nm處的色價(jià)為響應(yīng)值，建立有關(guān)色價(jià)的回歸方程如下：

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)水平與編碼

表3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

色價(jià)=1 243.09-30.81A-108.22B-136.96C+21.11AB+11.64AC-108.92BC-114.83A2-156.76B2-118.90C2。

表4 響應(yīng)面方差分析結(jié)果

2.6 優(yōu)化前后培養(yǎng)基與大米培養(yǎng)基對(duì)比分析

為了進(jìn)一步考察營(yíng)養(yǎng)因子優(yōu)化后所產(chǎn)紅曲色素的特性，采用薄層色譜法分析了優(yōu)化前后色素的組成和種類(lèi)，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，純米糠發(fā)酵色素經(jīng)薄層展開(kāi)未得到清晰條帶，優(yōu)化后發(fā)酵的色素有兩條清晰的紅色素條帶(Rf=0.20、Rf=0.25)，兩條明顯的橙色素條帶(Rf=0.69、Rf=0.76)，黃色素條帶(Rf=0.88、Rf=0.93)顏色較淺。對(duì)比純米糠培養(yǎng)基、優(yōu)化后培養(yǎng)基及普通大米培養(yǎng)基(505 nm)的色價(jià)，如圖4所示，純米糠發(fā)酵的色價(jià)最低，僅為106.15 U/g(505 nm)；普通大米發(fā)酵后的色價(jià)最高，可達(dá)1 751.74 U/g；優(yōu)化后所得色價(jià)比優(yōu)化前顯著提升，可達(dá)1 250.83 U/g，且優(yōu)化后所得色價(jià)為普通大米培養(yǎng)基的71.41%。

HPLC色譜結(jié)果(圖5)表明，純米糠發(fā)酵色素響應(yīng)值很低，幾乎未見(jiàn)色素產(chǎn)生。普通大米發(fā)酵后黃色素和橙色素占比較高，紅色素含量較低。優(yōu)化后的米糠培養(yǎng)基發(fā)酵后出現(xiàn)6種色素峰，分別是2種橙色素：紅斑素(rubropunctatin)、紅曲紅素(monascorubrin)，2種紅色素：紅斑胺(rubropunctamine)、紅曲紅胺(monascorubramine)，2種黃色素：紅曲素(monascin)、紅曲黃素(ankaflavin)，其中2種紅色素相對(duì)峰面積最大，其次是橙色素，黃色素較低，HPLC分析結(jié)果與TLC結(jié)果一致。對(duì)3種培養(yǎng)基發(fā)酵后樣品橘霉素毒素含量進(jìn)行了高效液相分析，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，普通大米發(fā)酵所得橘霉素最高，可達(dá)143.02 μg/g，是優(yōu)化后培養(yǎng)基發(fā)酵的(37.37 μg/g)3.82倍，是純米糠發(fā)酵的(2.42 μg/g)59.10倍。純米糠發(fā)酵所產(chǎn)橘霉素最少，優(yōu)化后培養(yǎng)基所產(chǎn)橘霉素是純米糠的15.44倍。綜上所述，優(yōu)化后發(fā)酵所產(chǎn)紅曲色素的色價(jià)及橘霉素含量均有顯著提升，但都低于大米發(fā)酵二者的水平。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以米糠為基質(zhì)液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)紅曲色素，選取多種碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽，考察不同營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)紅曲色素產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)甘露醇、ZnSO4和NH4NO3顯著提高了紅曲色素的色價(jià)。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，確定中心點(diǎn)(甘露醇添加量5.00%、ZnSO4添加量0.40%、NH4NO3添加量1.00%)。經(jīng)過(guò)響應(yīng)曲面優(yōu)化，確定以甘露醇5.10%、ZnSO40.40%、NH4NO31.00%加入米糠培養(yǎng)基，得到色價(jià)(505 nm處)最高為1 250.83 U/g，與預(yù)測(cè)值十分接近，模型擬合度較高。優(yōu)化后培養(yǎng)基發(fā)酵所得紅曲色素的色價(jià)可達(dá)大米培養(yǎng)基的71.41%，橘霉素含量則為大米的26.13%(37.37 μg/g)，并通過(guò)TLC和HPLC分析色素特性，發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后得到了6種主要紅曲色素，其中2種紅色素含量最高，其次是2種橙色素和少量黃色素。