油炸條件對雞胸肉中羧甲基賴氨酸和羧乙基賴氨酸含量的影響

于小慧，丁 麗，劉 偉*，余晶晶*

1.河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001 2.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，河南 鄭州 450001

油炸為食品原料提供了一個(gè)高溫加熱環(huán)境，在此條件下食品組分間發(fā)生一系列復(fù)雜的化學(xué)和物理變化，從而賦予油炸食品誘人的色澤和獨(dú)特的風(fēng)味[1-2]，但同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生晚期糖基化終產(chǎn)物(Advanced glycation end products，AGEs)等有害物質(zhì)[3]。隨著生活質(zhì)量的提高，人們對優(yōu)質(zhì)食品的需求不斷增加，消費(fèi)者不僅僅關(guān)注食品的色、香、味，更關(guān)注食品的營養(yǎng)、質(zhì)量和安全，因此食品行業(yè)關(guān)于AGEs的研究也逐漸開始受到學(xué)者的關(guān)注。

AGEs是還原糖和氨基化合物的游離氨基之間通過非酶反應(yīng)產(chǎn)生的一系列復(fù)雜化合物[4]。研究表明當(dāng)人體含有較高水平的AGEs，會(huì)增加糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、心血管疾病、腎病、衰老和阿爾茨海默病等多種慢性疾病發(fā)病的可能，而飲食是人體AGEs積累的重要來源[5-6]。Uribarri等[7]采用酶聯(lián)免疫法測定CML并建立了不同食品及其AGEs含量數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)高脂、高蛋白類食品中CML含量較高，高碳水化合物食品中CML含量較少。此外，雖然未經(jīng)加工的食物原料中也含有AGEs，但熱處理可顯著提高食品中AGEs的含量。食品中AGEs的形成途徑復(fù)雜多樣，美拉德反應(yīng)是其主要形成途徑[3]：美拉德反應(yīng)初期，還原糖與氨基化合物發(fā)生縮合反應(yīng)生成席夫堿(Schiff base)，隨后席夫堿重排形成相對穩(wěn)定的Amadori產(chǎn)物；Amadori產(chǎn)物通過脫水、重排一系列反應(yīng)進(jìn)一步形成高反應(yīng)活性的二羰基化合物，如3-脫氧葡萄糖醛酮(3-deoxyglucosone，3-DG)、乙二醛(Glyoxal，GO)、丙酮醛(methylglyoxal，MGO)等；最后，二羰基化合物與游離氨基反應(yīng)生成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的AGEs。此外，Amadori產(chǎn)物也可以通過有氧或無氧條件直接形成AGEs。除美拉德反應(yīng)途徑外，脂質(zhì)過氧化[8](Acetol 途徑)、還原糖自氧化[9](Wolff 途徑)以及席夫堿氧化裂解[10](Namiki途徑)也能生成二羰基化合物，從而進(jìn)一步形成AGEs。羧甲基賴氨酸(Nε-(carboxymethyl)lysine，CML)和羧乙基賴氨酸(Nε-(carboxyethyl)lysine，CEL)是2種比較典型的AGEs，廣泛存在于各種加工食品中，因其含量豐富且存在穩(wěn)定，常被用做食品中AGEs的標(biāo)記物[11-12]。

目前關(guān)于食品領(lǐng)域中AGEs的研究多集中于模擬體系中AGEs形成機(jī)制[13]、食品中AGEs含量的測定和調(diào)查[14-15]以及檢測方法[16-19]等方面，關(guān)于真實(shí)食品體系加工過程(如油炸、焙烤)中糖基化終產(chǎn)物的形成機(jī)制及影響因素的研究有待進(jìn)一步完善[20]。因此，探明油炸條件對雞肉中AGEs形成的影響對掌握真實(shí)食品體系中AGEs的含量水平和指導(dǎo)膳食健康具有重要意義。

本研究采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，以雞胸肉為原料，選擇不同的油炸條件對雞胸肉進(jìn)行熱處理，分析油炸雞胸肉中CML和CEL含量變化情況，以期揭示油炸條件對AGEs形成的影響，為科學(xué)了解CML和CEL在油炸食品中的形成提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

冷凍雞胸肉、高油酸葵花籽油(一級(jí)，浸出)、大豆油(一級(jí)，浸出)、葵花籽油(一級(jí)，壓榨)、花生油(一級(jí)，壓榨)、玉米油(一級(jí)，壓榨)、菜籽油(三級(jí)，壓榨)、棕櫚油(一級(jí)，凝固點(diǎn)23 ℃)均購于鄭州當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 主要試劑

CML、CEL、CML-d4和CEL-d4標(biāo)準(zhǔn)品：加拿大Toronto Research Chemicals公司；乙腈、甲醇和正己烷：HPLC級(jí)，美國Dikama公司；醋酸：HPLC級(jí)，美國Tedia公司；鹽酸、氫氧化鈉、硼酸、硼氫化鈉：分析純，國藥化學(xué)試劑北京有限公司；氨水：分析純，德國CNW科技公司；其他試劑均為分析純。CML、CEL、CML-d4、CEL-d4各0.1 mg/mL原液用純水制備，0 ℃冰箱保存。

1.3 儀器與設(shè)備

Fd-1A-50冷凍干燥機(jī):北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；WeighMax電炸鍋:湖北香江電器股份有限公司；TGL-16 M高速冷凍離心機(jī)：上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；氮?dú)獯禋鉂饪s儀:美國Caliper lifesciences Turbovap II公司；WGL-125B電熱鼓風(fēng)干燥箱:河南泰斯特儀器有限公司；多管渦旋器:德國Talboys公司；Agilent 1200高效液相色譜儀:美國Agilent公司；Triple Quad 4000質(zhì)譜儀:美國AB Sciex公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 樣品制備

選取清洗干凈、去除表面脂肪和筋膜的雞胸肉若干，用絞肉機(jī)絞碎，稱取(10.0±0.2)g肉糜，于直徑3 cm、高1 cm模具內(nèi)制成的肉餅，備用。

1.4.2 油炸試驗(yàn)

將1.0 L的植物油加入恒溫油炸鍋中，當(dāng)油溫升到預(yù)設(shè)溫度時(shí)，將制備好的雞胸肉油炸一定時(shí)間，油炸過程中用溫度計(jì)實(shí)時(shí)監(jiān)測溫度變化情況。油炸結(jié)束，將油炸雞肉瀝去多余油脂，冷卻至室溫后置于密封袋中于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 雞肉基本組分的測定

雞肉中水分、脂肪、蛋白質(zhì)、灰分含量的測定分別參照GB/T 5009.3—2016《食品中水分的測定》、GB/T 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》、GB/T 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》、GB/T 5009.4—2016《食品中灰分的測定》。

1.4.4 樣品中CML 和 CEL 含量的測定

參照Yu等[21]的方法并稍做修改。準(zhǔn)確稱取40 mg粉碎后的樣品于50 mL離心管中，用6 mL正己烷脫脂，重復(fù)3次。樣品脫脂后用氮?dú)獯蹈?，轉(zhuǎn)移到水解管中。加入1.5 mL硼酸鈉溶液(0.2 mol/L, pH 9.2)和1～3滴1-辛醇，再逐滴加入1 mL硼氫化鈉，4 ℃靜置過夜。然后加入2.6 mL 12 mol/L HCl，抽真空通氮?dú)庵脫Q3次后密封，將樣品在110 ℃下水解24 h。水解后的溶液過濾，濾液加水定容至10 mL。然后取1 mL濾液，加入1 mL水和100 μL內(nèi)標(biāo)，混勻后過陽離子交換固相萃取柱。陽離子交換固相萃取柱依次用2 mL甲醇和0.1 mol/L鹽酸溶液活化后上樣，再用2 mL水洗滌，最后用5 mL 5%氨水-甲醇溶液洗脫，洗脫液用氮?dú)獯蹈桑? mL水復(fù)溶，過0.22 μm水相濾膜，濾液置于色譜瓶中，進(jìn)行HPLC-MS/MS分析。

液相色譜條件如下。儀器為Agilent 1200；色譜柱: Agilent Proshell 120 SB C18柱(3.0 mm×150 mm, 2.7 μm)；柱溫35 ℃；流速 0.3 mL/min；進(jìn)樣量 10 μL；流動(dòng)相 A 為 0.3%乙酸水溶液，B 為 0.3%醋酸-乙腈溶液，梯度洗脫條件：0～5.0 min，100% A～80% A；5.1～10.0 min，80% A～10% A；10.1～15 min，100% A。

質(zhì)譜條件如下。電離方式：正離子模式(ESI+)；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，參數(shù)如表1所示；離子噴霧電壓5.0 kV；離子源溫度550 ℃；氣簾氣氮?dú)猓?0 psi；霧化氣70 psi，輔助氣，70 psi。

表1 HPLC-MS 多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)參數(shù)

1.5 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)，數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示；SPSS 19軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；Analyst Software 用于AGEs數(shù)據(jù)分析；Origin 2021用于繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 原料基本組分及CML和CEL含量

雞胸肉的基本組分含量如表2所示，水分含量為72.43%，蛋白含量為21.78%，脂肪含量為2.36%，灰分含量為1.52%。為了解油炸對雞胸肉中AGEs含量的影響，對原料雞胸肉中CML、CEL含量進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)未經(jīng)加工的雞胸肉中CML、CEL含量分別為(144.50±14.14)mg/kg、(9.38±0.14)mg/kg，AGEs含量較低。Zhu等[22]在未經(jīng)煎炸的雞胸肉中也檢測到較低含量的CML和CEL。這可能是因?yàn)樵诟叩鞍住⒏咧镜娜忸愺w系中，美拉德反應(yīng)和脂質(zhì)氧化在常溫條件下緩慢進(jìn)行，從而導(dǎo)致生肉中能夠積累少量的AGEs。

表2 原料基本組分及CML和CEL含量

2.2 植物油種類對油炸雞胸肉中CML和CEL含量的影響

在油炸溫度為180 ℃、油炸時(shí)間為5 min條件下，研究了大豆油、花生油、玉米油、葵花籽油、高油酸葵花籽油、棕櫚油、菜籽油7種植物油脂對油炸雞胸肉中CML和CEL含量的影響。由圖1可以看出，經(jīng)不同種類的油脂在180 ℃條件下油炸5 min的雞胸肉中CML含量為218.40～311.20 mg/kg，CEL含量為43.38～64.00 mg/kg，油炸加工顯著增加了雞胸肉中CML和CEL含量。不同種類的植物油脂油炸雞胸肉中CML存在較大差異，采用不同油脂油炸的雞胸肉中CML含量的由高到低：大豆油>花生油>玉米油≈葵花籽油>棕櫚油>菜籽油>高油酸葵花籽油，高油酸葵花籽油和菜籽油油炸雞胸肉中CML含量較低，分別為218.40、226.40 mg/kg，顯著低于其他5種油脂(P<0.05)。對于CEL而言，棕櫚油油炸雞胸肉中CEL含量較高，為64.00 mg/kg，但整體而言，不同植物油油炸雞胸肉中CEL含量差異不明顯(P>0.05)。高油酸葵花籽油油酸含量大約為85%，多不飽和脂肪酸含量相對較低，較傳統(tǒng)植物油而言具有較高的氧化穩(wěn)定性；菜籽油為三級(jí)成品油，可能含有較高含量的天然抗氧化物質(zhì)，在熱加工過程中可以在一定程度上抑制脂質(zhì)氧化。脂質(zhì)氧化是形成AGEs中間物質(zhì)的一個(gè)重要途徑，因此高油酸葵花籽油和菜籽油油炸雞胸肉中AGEs含量較低的原因可能是，二者在熱加工過程中脂質(zhì)氧化程度較其他幾種植物油低。由此可見，在油炸食品過程中選用合適的油脂對控制食品中的AGEs具有重要意義。大豆油作為一種大宗油料，價(jià)格較低，在我國食用油中年消費(fèi)量最大[23]，日常生活中使用廣泛，因此選用大豆油作為煎炸油進(jìn)行后續(xù)研究。

2.3 油炸溫度對油炸雞胸肉中CML和CEL含量的影響

溫度是影響糖基化終產(chǎn)物形成的一個(gè)關(guān)鍵因素。以大豆油炸雞胸肉，設(shè)定油炸時(shí)間為5 min，研究不同溫度對油炸雞胸肉中CML和CEL含量的影響。由圖2可以看出，在140～220 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的增加CML、CEL含量不斷增加，溫度越高，樣品中CML、CEL含量越高、生成速率越快。在220 ℃條件下油炸5 min的雞胸肉中CML、CEL的生成速率分別為34.62、49.47 mg/kg·min-1，分別為140 ℃條件下的2.53倍、19.02倍；在140～180 ℃范圍內(nèi)，CML的增長速率顯著高于CEL，而在180～200 ℃之間，CML增長緩慢，CEL含量急劇增長，CML和CEL的含量增長速率存在顯著差異，這可能是與CML和CEL的生成途徑不同有關(guān)。吳帥[24]研究了雞蛋蛋白在熱加工過程中CML和CEL的生成規(guī)律，發(fā)現(xiàn)二者生成的活化能分別為100.89 kJ/mol和122.39 kJ/mol，表明CEL比CML較難生成，因此較低溫度(140～180 ℃)條件下CEL的生成速率要小于CML。因此，在140～220 ℃油炸溫度范圍內(nèi)，溫度越高，油炸雞胸肉中CML和CEL含量越高，油炸時(shí)在保證食物營養(yǎng)、風(fēng)味、色澤和生產(chǎn)效率的同時(shí)，要盡可能選擇較低的油炸溫度。

2.4 油炸時(shí)間對雞胸肉中CML和CEL含量的影響

在180 ℃條件下，采用大豆油對雞胸肉進(jìn)行油炸，研究不同油炸時(shí)間對雞胸肉中CML和CEL含量的影響，結(jié)果如圖3所示。在相同溫度條件下，0～11 min隨著油炸時(shí)間的延長，雞胸肉中CML和CEL含量不斷增加。其中CML含量從初始含量144.50 mg/kg增長至347.50 mg/kg，約為生肉中的2.40倍；CEL從9.38 mg/kg增加到93.25 mg/kg，增加了8.94倍；油炸時(shí)間越長，雞胸肉中CML和CEL 含量水平越高。0～3 min食品體系內(nèi)反應(yīng)底物充足，CML、CEL快速大量積累；繼續(xù)延長油炸時(shí)間，食品中反應(yīng)底物逐漸被消耗，導(dǎo)致CML和CEL含量增長速率有所下降。在180 ℃油炸條件下，相較于CEL，雞胸肉中CML更容易在較短時(shí)間內(nèi)得到大量積累。油炸時(shí)間為7、9、11 min時(shí)，油炸雞胸肉中CML含量分別為332.50、336.38、347.50 mg/kg，較為相近。由此可見，在一定范圍內(nèi)油炸時(shí)間對雞胸肉中CML含量影響并不顯著，可以采取在較低溫度條件下通過適當(dāng)延長油炸時(shí)間保障食品風(fēng)味及色澤的同時(shí)降低AGEs含量。

2.5 油炸次數(shù)對雞胸肉中CML和CEL含量的影響

通常在制作油炸食品時(shí)，植物油會(huì)反復(fù)加熱使用。Chhabra等[25]曾報(bào)道，經(jīng)多次重復(fù)加熱使用的油脂其油炸樣品中熒光性AGEs含量要高于新鮮油脂的油炸樣品。如圖4所示，在180 ℃、5 min油炸條件下，研究了大豆油的油炸次數(shù)對雞胸肉中CML和CEL含量的影響。總體而言，隨著大豆油反復(fù)使用次數(shù)的增加，CEL含量變化不明顯，CML含量有所下降。這可能是因?yàn)殡S著油脂不斷進(jìn)行加熱和反復(fù)油炸食物時(shí)，油脂發(fā)生氧化降解，生成的中間體物質(zhì)GO、MGO進(jìn)入食物體系內(nèi)參與CML和CEL的形成而不斷被消耗，導(dǎo)致食品體系內(nèi)參與CML和CEL反應(yīng)的GO、MGO含量下降，從而導(dǎo)致其含量降低。此外，油炸次數(shù)相近的雞胸肉樣品中，CML、CEL含量相差不大，表明在相對較短時(shí)間內(nèi)油脂重復(fù)使用并不足以引起AGEs含量發(fā)生顯著變化。

2.6 油脂連續(xù)加熱時(shí)間對雞胸肉中CML和CEL含量的影響

為進(jìn)一步了解油脂在油炸過程中對雞胸肉中AGEs含量的影響，選用大豆油，在180 ℃、5 min的油炸條件下，研究了油脂連續(xù)加熱時(shí)間對雞胸肉中CML和CEL含量的影響。將油溫升至180 ℃的時(shí)間點(diǎn)記為0 h，在0～12 h內(nèi)取點(diǎn)對雞胸肉進(jìn)行油炸，雞胸肉中CML、CEL含量變化情況如圖5所示。0 h時(shí)，油炸雞胸肉中CML含量為325.00 mg/kg，CEL含量為51.63 mg/kg；當(dāng)大豆油在180 ℃條件下連續(xù)加熱12 h后，樣品中CML含量為252.50 mg/kg，CEL含量為39.125 mg/kg；隨著油脂連續(xù)加熱時(shí)間的延長，雞胸肉中CML和CEL含量有所下降。這可能是因?yàn)橛椭B續(xù)加熱過程前期，進(jìn)入到食品體系的油脂在高溫條件下氧化形成CML和CEL的中間體物質(zhì)GO和MGO，參與并促進(jìn)了CML和CEL的形成。當(dāng)油脂在較高溫度下加熱較長時(shí)間后，一方面中間體物質(zhì)GO、MGO不斷被消耗，導(dǎo)致參與形成CML和CEL的量降低；另一方面油脂在高溫條件下發(fā)生氧化和水解反應(yīng)，產(chǎn)生游離脂肪酸和部分小分子酸性物質(zhì)，而Kong等[26]的研究表明酸性增強(qiáng)可延緩體系中AGEs的形成。所以隨著油脂連續(xù)加熱時(shí)間的不斷延長，油炸雞胸肉中CML和CEL含量有所下降。

3 結(jié)論

研究了不同油炸條件對雞胸肉中CML和CEL含量的影響，結(jié)果表明：生肉中CML和CEL的含量分別為144.50 mg/kg和9.38 mg/kg，采用不同植物油在180 ℃條件下油炸5 min的雞胸肉中CML含量為218.40～311.20 mg/kg，CEL含量為43.38～64.00 mg/kg，油炸加工顯著增加了雞胸肉中CML和CEL含量。不同種類的植物油脂油炸雞胸肉中CML存在較大差異，高油酸葵花籽油和菜籽油油炸雞胸肉中CML含量較低，分別為218.40、226.40 mg/kg，顯著低于其他5種油脂，對于CEL而言，油脂種類對其含量的影響不明顯；CML和CEL含量隨油炸溫度的升高和油炸時(shí)間的延長呈不斷增加趨勢，溫度越高，CML和CEL的生成速率越快，在220 ℃條件下油炸5 min的雞胸肉中CML和CEL的生成速率分別為34.62、49.47 mg/kg·min-1，分別為140 ℃條件下油炸雞胸肉的2.53倍和19.02倍；隨油炸次數(shù)的增加，CML含量略有下降，CEL含量整體變化不明顯；隨油脂連續(xù)加熱時(shí)間的延長，油炸雞胸肉中CML和CEL的含量略有下降，CML和CEL的含量均在初始時(shí)間油炸時(shí)取得最大值，分別為325.00、51.63 mg/kg。因此，在對食品進(jìn)行油炸加工時(shí)，可以通過優(yōu)化油炸條件調(diào)控油炸食品中AGEs的含量，本研究對指導(dǎo)油炸食品中風(fēng)險(xiǎn)因子的防控有一定參考意義。