模擬體系中谷維素檢測(cè)方法的建立

趙 晨，孫 聰，梁少華

河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001

谷維素是植物甾醇和三萜醇的阿魏酸酯混合物[1]，其中環(huán)木菠蘿烯醇阿魏酸酯、24-亞甲基環(huán)木菠蘿烯醇阿魏酸酯、菜油甾醇阿魏酸酯和β-谷甾醇阿魏酸酯約占谷維素含量95%[2]。谷維素中的阿魏酸酯各組分具有多種生理功能，如抗氧化、調(diào)節(jié)神經(jīng)[3]、降低血清膽固醇[4-5]、治療高血壓[6]等。另外，谷維素也可作為食品添加劑改善食品品質(zhì)[7]。

谷維素的檢測(cè)方法有許多種，如紫外分光光度法[8]、高效液相色譜法[9]、質(zhì)譜法[10]等。其中，紫外分光光度法和高效液相色譜氨基柱法[11]能測(cè)量谷維素總量，可將谷維素中各組分分離測(cè)定的方法主要是高效液相色譜C18柱法[12-13]。高效液相色譜法具有檢出限低、靈敏度高、重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[14]。由于阿魏酸基團(tuán)具有紫外吸收特性[15]，所以常采用高效液相色譜-紫外檢測(cè)法對(duì)谷維素進(jìn)行測(cè)定。張連成等[16]利用高效液相色譜C18柱法分析谷維素含量，流動(dòng)相選擇水-乙腈(體積比55∶45)，檢測(cè)波長(zhǎng)為231 nm，發(fā)現(xiàn)進(jìn)樣量與峰面積有良好的線(xiàn)性關(guān)系。Xu等[17]采用反相高效液相色譜C18柱法，以甲醇-乙腈-乙酸(體積比50∶47∶3)為流動(dòng)相，在檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm下分離出10種谷維素組分。但這些方法前處理過(guò)程均較煩瑣，易受到其他物質(zhì)的干擾。

谷維素在食品加工和日常烹飪中避免不了受到熱作用的影響，而不同種類(lèi)谷維素組分的熱穩(wěn)定性尚不清晰[18-19]。在研究不同種類(lèi)谷維素組分的熱穩(wěn)定性時(shí)，為了減少體系中其他物質(zhì)的干擾，常需采用干擾較小的模擬體系，如高溫下性質(zhì)穩(wěn)定的石蠟油-二苯醚(體積比1∶1)混合體系，但目前已有的檢測(cè)方法分離效果不太理想[20]，影響谷維素各組分的準(zhǔn)確定量。因此，作者建立了一種高效液相色譜-紫外檢測(cè)法對(duì)二苯醚-石蠟油(體積比1∶1)模擬體系中谷維素組分進(jìn)行分離檢測(cè)，利用外標(biāo)法對(duì)谷維素中4種主要組分進(jìn)行定量分析，為探究谷維素在模擬體系中的熱穩(wěn)定性提供檢測(cè)方法，同時(shí)為谷維素的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

γ-谷維素純品(純度93.1%)：山東匯康食品有限公司；γ-谷維素標(biāo)準(zhǔn)品(環(huán)木菠蘿烯醇阿魏酸酯23%、24-亞甲基環(huán)木菠蘿烯醇阿魏酸酯51%、菜油甾醇阿魏酸酯15%、β-谷甾醇阿魏酸酯10%)：日本W(wǎng)ako公司；二苯醚、乙腈(色譜級(jí))：上海麥克林生化科技有限公司；石蠟油：南昌白云藥業(yè)有限公司；成品米糠油：盤(pán)錦興旺油脂廠(chǎng)；異丙醇(色譜級(jí))、甲醇(色譜級(jí))：美國(guó)VBS有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1525高效液相色譜儀：美國(guó)Waters有限公司；DF101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；XW-80A渦旋振蕩器：海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司；BSA224S分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；HZT-A2000電子天平：鄭州華志科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)量5 mg谷維素標(biāo)準(zhǔn)品于5 mL容量瓶中，用色譜級(jí)異丙醇定容，配制成1 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，分別稀釋為500、200、100、50、20 μg/mL谷維素標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.3.2 樣品溶液的制備

將二苯醚和石蠟油按體積比1∶1混勻，稱(chēng)取1 g谷維素純品并按質(zhì)量比3%與混合溶劑混合。將混勻后的樣品超聲處理10 min后，于磁力攪拌器中以轉(zhuǎn)速600 r/min常溫下攪拌30 min。分別稱(chēng)取澄清的樣品0.1 g、0.5 g、0.75 g于3個(gè)25 mL容量瓶中，用色譜級(jí)異丙醇定容，制成低(120 μg/mL)、中(600 μg/mL)、高(900 μg/mL)質(zhì)量濃度的樣品溶液，混勻后取適量樣品溶液用0.22 μm聚丙烯濾膜過(guò)濾，轉(zhuǎn)移至樣品瓶中，進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定。

1.3.3 高效液相色譜測(cè)定條件

色譜柱：Waters Symmetry C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫40 ℃；等度洗脫流速為0.8 mL/min；流動(dòng)相為甲醇-乙腈(體積比1∶1)；檢測(cè)時(shí)間50 min；進(jìn)樣量10 μL；紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)325 nm。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

取1.3.1不同質(zhì)量濃度的2 mL谷維素標(biāo)準(zhǔn)品溶液用0.22 μm聚丙烯濾膜過(guò)濾，轉(zhuǎn)移至樣品瓶中，按照1.3.3 高效液相條件進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)測(cè)定2次，取平均值。以谷維素各組分質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積(y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.3.5 測(cè)定方法的考察

1.3.5.1 儀器精密度試驗(yàn)

制備2 mL 446 μg/mL谷維素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，經(jīng)0.22 μm聚丙烯濾膜過(guò)濾后轉(zhuǎn)移至樣品瓶中，按照1.3.3高效液相色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄每次測(cè)定的峰面積與保留時(shí)間，分別計(jì)算峰面積和保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

1.3.5.2 樣品重復(fù)性試驗(yàn)

按照1.3.2制備待測(cè)樣品溶液，按照1.3.3 高效液相色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄每次測(cè)定的峰面積與保留時(shí)間，分別計(jì)算峰面積和保留時(shí)間的RSD。

1.3.5.3 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)

1.3.5.3.1 日內(nèi)穩(wěn)定性

按1.3.2方法制成低(120 μg/mL)、中(600 μg/mL)、高(900 μg/mL)質(zhì)量濃度的樣品溶液，分別于2、4、6、8、10、12 h進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算各樣品的峰面積和保留時(shí)間的RSD。

1.3.5.3.2 日間穩(wěn)定性

移取上述1.3.5.3.1的低(120 μg/mL)、中(600 μg/mL)、高(900 μg/mL)質(zhì)量濃度的樣品溶液，分別于第1、2、3、4、5、6天測(cè)定樣品中谷維素的含量，計(jì)算各樣品的峰面積和保留時(shí)間的RSD。

1.3.5.4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

準(zhǔn)備3組已知谷維素含量的樣品，分別加入188.99 μg、274.55 μg、377.99 μg谷維素標(biāo)準(zhǔn)品(各3份)。按照1.3.3色譜條件測(cè)定谷維素4種主要組分及總量的含量，計(jì)算樣品的加標(biāo)回收率。

1.3.5.5 在米糠油樣品中的應(yīng)用

將已知谷維素含量的成品米糠油樣品分為3組，分別加入501.08 μg、1 355.64 μg、2 033.45 μg谷維素標(biāo)準(zhǔn)品(各3份)。按照1.3.3色譜條件測(cè)定谷維素4種主要組分含量及總含量，通過(guò)計(jì)算米糠油樣品的加標(biāo)回收率和RSD對(duì)該檢測(cè)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷維素標(biāo)準(zhǔn)品4種組分的線(xiàn)性方程

所用液相條件對(duì)于谷維素標(biāo)準(zhǔn)品4種組分具有較好的分離效果，出峰時(shí)間從前至后依次為環(huán)木菠蘿烯醇阿魏酸酯(33.498 min)、24-亞甲基環(huán)木菠蘿烯醇阿魏酸酯(36.003 min)、菜油甾醇阿魏酸酯(40.096 min)和β-谷甾醇阿魏酸酯(43.527 min)。表1為谷維素標(biāo)準(zhǔn)品4種組分的線(xiàn)性方程，在20～1 000 μg/mL范圍內(nèi)，4種組分的質(zhì)量濃度與峰面積存在良好的線(xiàn)性關(guān)系。

表1 谷維素標(biāo)準(zhǔn)品4種組分的線(xiàn)性方程

2.2 測(cè)定方法的考察

2.2.1 儀器精密度

谷維素標(biāo)準(zhǔn)溶液中4種主要組分的保留時(shí)間和峰面積見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，4種主要組分的保留時(shí)間和峰面積的RSD均小于5%，表明該方法所用儀器精密度良好，可靠性高，可用于谷維素的定量分析。

表2 儀器精密度

2.2.2 樣品重復(fù)性

谷維素樣品中4種主要組分的保留時(shí)間和峰面積見(jiàn)表3。由表3可以看出，在模擬體系中谷維素4種主要組分的出峰時(shí)間和峰面積的RSD都小于5%，表明在該液相條件下，模擬體系中石蠟油和二苯醚對(duì)4種主要組分的分離和定量影響較小，谷維素樣品進(jìn)樣保持著較好的準(zhǔn)確性和較低的誤差。

表3 樣品重復(fù)性

2.2.3 樣品穩(wěn)定性

2.2.3.1 樣品日內(nèi)穩(wěn)定性

樣品日內(nèi)穩(wěn)定性結(jié)果如表4所示。由表4可知，樣品中谷維素4種主要組分的保留時(shí)間和峰面積的RSD分別為0.05%～0.26%、0.41%～3.12%，均小于5%。表明在12 h內(nèi)對(duì)樣品中谷維素4種主要組分的檢測(cè)結(jié)果較為準(zhǔn)確。

表4 日內(nèi)穩(wěn)定性

2.2.3.2 樣品日間穩(wěn)定性

樣品日間穩(wěn)定性結(jié)果如表5所示。由表5可知，樣品中谷維素4種主要組分的保留時(shí)間和峰面積的RSD均小于5%。表明在6 d內(nèi)對(duì)樣品中谷維素4種主要組分的檢測(cè)結(jié)果較為準(zhǔn)確。但當(dāng)樣品質(zhì)量濃度較高時(shí)，環(huán)木菠蘿烯醇阿魏酸酯峰面積的RSD為4.85%，菜油甾醇阿魏酸酯峰面積的RSD為4.52%，說(shuō)明放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致環(huán)木菠蘿烯醇阿魏酸酯和菜油甾醇阿魏酸酯的峰面積檢測(cè)準(zhǔn)確性降低。主要原因可能是機(jī)器誤差造成的，也可能是由于放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，谷維素受到光照或氧化等原因發(fā)生降解造成損失，使檢測(cè)結(jié)果誤差增大。

表5 日間穩(wěn)定性

2.2.4 加標(biāo)回收率

樣品加標(biāo)回收率結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可知，3組谷維素樣品的總量及4種主要組分的加標(biāo)回收率平均值分別為92.27%～110.87%、83.25%～119.74%，RSD均小于5%，這與朱琳等[21]測(cè)定米糠油中谷維素含量結(jié)果相近，表明該方法在測(cè)定谷維素主要的4種組分時(shí)準(zhǔn)確性較高，結(jié)果較為可靠。

表6 樣品加標(biāo)回收率

2.2.5 在米糠油樣品中的應(yīng)用

為了評(píng)估本方法在實(shí)際樣品中的適用性，采用成品米糠油進(jìn)行加標(biāo)回收評(píng)價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表7。由表7可知，該方法在檢測(cè)米糠油樣品時(shí)總量和各組分加標(biāo)回收率的RSD均小于5%。表明該檢測(cè)方法在測(cè)定米糠油樣品時(shí)準(zhǔn)確性好，誤差小。綜上所述，該檢測(cè)方法在米糠油樣品中同樣適用，對(duì)于米糠油中谷維素總量及各組分含量的測(cè)定較為準(zhǔn)確，應(yīng)用在米糠油中與模擬體系有相似的效果。

表7 米糠油加標(biāo)回收率

3 結(jié)論

建立了反相高效液相色譜-紫外檢測(cè)法測(cè)定了模擬體系中谷維素4種主要組分的含量。在谷維素20～1 000 μg/mL范圍內(nèi)，4種組分的線(xiàn)性方程分別為y=34 889x-63 757、y=34 813x-112 228、y=36 565x-67 528、y=35 601x-32 177，R2為0.998 6～0.999 5。該方法中4種組分的檢出限為0.15～0.23 μg/mL，定量限為0.49～0.76 μg/mL。在儀器精密度和樣品重復(fù)性試驗(yàn)中，谷維素4種主要組分保留時(shí)間和峰面積的RSD均小于5%，在樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)中，谷維素4種主要組分保留時(shí)間和峰面積RSD均小于5%。樣品總量加標(biāo)回收率為92.27%～110.87%，谷維素4種主要組分加標(biāo)回收率為83.25%～119.74%。該方法在檢測(cè)米糠油樣品加標(biāo)回收率時(shí)的RSD均小于5%。綜上所述，該檢測(cè)方法的測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可用于模擬體系中谷維素的定量分析。經(jīng)初步研究，其在米糠油中的應(yīng)用與模擬體系有相似的效果。