米糠油體的酶法提取工藝優(yōu)化

呂雯雯，高倩茹，郝 佳，閆秋麗，許朵霞

(1.北京工商大學(xué) 食品與健康學(xué)院，北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類(lèi)健康高精尖創(chuàng)新中心，北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室,北京 100048； 2.北京市經(jīng)濟(jì)管理學(xué)校,北京 100048)

隨著人們對(duì)綠色、安全食品的追求，使用天然食品原料已成為未來(lái)食品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展趨勢(shì)。米糠是稻米加工過(guò)程中的主要副產(chǎn)品，含有稻米中2/3的營(yíng)養(yǎng)成分和9/10的人體必需元素，有“天然營(yíng)養(yǎng)寶庫(kù)”的稱(chēng)號(hào)[1]。米糠中含有15%的蛋白質(zhì)、16%～22%的脂肪、10%的水分，還含有生育酚、谷維素、角鯊烯等活性物質(zhì)，具有增強(qiáng)免疫力、治療肥胖癥、預(yù)防心血管疾病甚至抗癌的作用[2-4]。我國(guó)米糠產(chǎn)量豐富，但存在深加工不足的問(wèn)題，造成了米糠資源的浪費(fèi)。

植物油體是天然的微納米級(jí)原料，富含多不飽和脂肪酸、磷脂、生育酚和植物甾醇等生物活性物質(zhì)，作為天然復(fù)合物乳狀液，可廣泛應(yīng)用于飲料、乳制品、巧克力和冰淇淋等食品中[5-7]。此外，植物油體為天然乳化劑，作為載體具有良好的輸送和釋放能力，有利于食品的低能耗生產(chǎn)[8-10]。從米糠中提取米糠油體作為天然乳化劑應(yīng)用于食品工業(yè)中，具有廣泛的應(yīng)用前景，可解決米糠深加工不足的問(wèn)題。

目前，植物油體的提取方法主要有水法和酶法[11-12]。水法提取效率通常較低；而酶法提取可以解決此問(wèn)題，如Kapchie等[13]利用酶法提取大豆油體，選用復(fù)合果膠酶、纖維素酶和β-葡聚糖酶，在60℃、150 r/min條件下處理大豆粉20 h，大豆油體的提取率顯著高于水法提取的。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于米糠油體的研究不多，且主要是對(duì)傳統(tǒng)水法提取的米糠油體成分和物理性質(zhì)的研究。

米糠中含有較多的半纖維素，其中木聚糖含量最高。木聚糖酶可以分解米糠細(xì)胞壁及米糠中的木聚糖[14-15]。植物提取酶中包括纖維素酶、半纖維素酶、β-葡聚糖酶和果膠酶，可以顯著破壞植物細(xì)胞壁[16]。因此，本文擬采用木聚糖酶及植物提取酶針對(duì)性地提取米糠油體，以油體得率、粒徑分布、穩(wěn)定性及微觀結(jié)構(gòu)為指標(biāo)，探究復(fù)合酶配比、復(fù)合酶添加量、pH及酶解時(shí)間對(duì)米糠油體提取的影響，優(yōu)化酶法提取米糠油體的工藝條件，為米糠油體的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

米糠，哈爾濱北大荒米業(yè)有限公司。植物提取酶(主要包含纖維素酶、果膠酶、β-葡聚糖酶，純度≥99%)，寧夏和氏璧生物有限公司；木聚糖酶(純度≥99%)、尼羅藍(lán)(純度≥98%)、尼羅紅(純度≥98%)，上海源葉生物科技有限公司；疊氮化鈉，分析純，美國(guó)Sigma公司；氫氧化鈉、鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，河南省予華儀器有限公司；Allegra X-15R超高速離心機(jī)，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；S3500粒度儀，美國(guó)Microtrac公司；Lumisizer穩(wěn)定性分析儀，德國(guó)L.U.M.GmbH公司；Eutech 700 pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；FV3000激光共聚焦顯微鏡，美國(guó)Olympus公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 米糠油體的制備

將過(guò)450 μm(40目)篩的米糠以料液比1∶6(質(zhì)量比)加入到1 mmol/L的磷酸鹽緩沖液中，調(diào)節(jié)pH，加入復(fù)合酶攪拌混勻，50℃下酶解一定時(shí)間后，4 500 r/min、23℃離心20 min，取上層，即為米糠油體，在米糠油體中加入0.01%的疊氮化鈉防止微生物生長(zhǎng)。按下式計(jì)算米糠油體得率(x)。

x=m1/m2×100%

(1)

式中：m1為米糠油體質(zhì)量，g；m2為米糠質(zhì)量，g。

1.2.2 米糠油體粒徑分布的測(cè)定

采用S3500粒度儀測(cè)定米糠油體的粒徑分布。取一定量樣品，用1 mmol/L磷酸緩沖液稀釋400倍，以水為介質(zhì)，連續(xù)相和分散相的折射率分別設(shè)為1.33和1.45，濕法測(cè)量。

1.2.3 米糠油體穩(wěn)定性分析

使用Lumisizer穩(wěn)定性分析儀測(cè)定米糠油體的穩(wěn)定性。取0.4 mL樣品，在轉(zhuǎn)速4 000 r/min、測(cè)試溫度25℃、掃描間隔60 s/次、掃描次數(shù)255次條件下，測(cè)定樣品的移動(dòng)速率。

1.2.4 米糠油體微觀結(jié)構(gòu)分析

采用FV3000激光共聚焦顯微鏡分析米糠油體微觀結(jié)構(gòu)。在米糠油體中加入油體質(zhì)量的0.02%尼羅紅對(duì)油相進(jìn)行染色，取少量染色樣品置于載玻片上，用60倍目鏡進(jìn)行觀察，調(diào)節(jié)激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm和635 nm。

1.2.5 米糠油體中脂肪和蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用索氏抽提法測(cè)定米糠油體脂肪含量；采用BCA法測(cè)定米糠油體蛋白質(zhì)含量。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2017及SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用OriginPro 8.5.1進(jìn)行繪圖，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合酶配比對(duì)米糠油體得率和性質(zhì)的影響

在復(fù)合酶添加量為2%、pH為5.0、酶解溫度為50℃、酶解時(shí)間為1.5 h條件下，調(diào)整復(fù)合酶配比(木聚糖酶與植物提取酶質(zhì)量比，下同)分別為1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1，從米糠油體得率、粒徑分布、穩(wěn)定性與微觀結(jié)構(gòu)方面研究復(fù)合酶配比對(duì)米糠油體制備的影響。

2.1.1 得率

復(fù)合酶配比對(duì)米糠油體得率的影響見(jiàn)圖1。從圖1可以看出，隨著木聚糖酶所占比例的增大，米糠油體得率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，復(fù)合酶配比為2∶1時(shí)，米糠油體得率最大，為73.6%。可能是因?yàn)槊卓分泻休^多的木聚糖，當(dāng)木聚糖酶占比增加時(shí)，米糠中的木聚糖被充分酶解，米糠油體釋放增加；但當(dāng)木聚糖酶占比再增加，則植物提取酶占比過(guò)少，無(wú)法充分破壞細(xì)胞壁，導(dǎo)致米糠油體釋放減少，得率降低。

圖1 復(fù)合酶配比對(duì)米糠油體得率的影響

2.1.2 粒徑分布及穩(wěn)定性

復(fù)合酶配比對(duì)米糠油體粒徑分布的影響見(jiàn)圖2。

圖2 復(fù)合酶配比對(duì)米糠油體粒徑分布的影響

由圖2可看出，當(dāng)復(fù)合酶配比為1∶3和1∶2時(shí)，米糠油體粒徑呈雙峰分布，且粒徑較大，可能是由于油體液滴聚結(jié)所致。隨著木聚糖酶所占比例的增大，油體粒徑呈單峰分布，表現(xiàn)出均一性。復(fù)合酶配比為2∶1時(shí)，液滴粒徑最小，為8.37 μm，在該條件下提取的米糠油體液滴均勻性最佳。

復(fù)合酶配比對(duì)米糠油體穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖3。移動(dòng)速率值越小，樣品體系越穩(wěn)定[17]。由圖3可看出，隨木聚糖酶所占比例的增大，米糠油體穩(wěn)定性逐漸增大，復(fù)合酶配比為2∶1時(shí)，米糠油體穩(wěn)定性最高。此后，木聚糖酶占比再增大，米糠油體穩(wěn)定性不再發(fā)生改變。因此，復(fù)合酶配比為2∶1時(shí)，米糠油體粒徑分布最均一，粒徑最小且穩(wěn)定性最好。

圖3 復(fù)合酶配比對(duì)米糠油體穩(wěn)定性的影響

2.1.3 微觀結(jié)構(gòu)

復(fù)合酶配比對(duì)米糠油體微觀結(jié)構(gòu)的影響見(jiàn)圖4。由圖4可看出，復(fù)合酶配比為1∶3和1∶2時(shí)，米糠油體凝結(jié)明顯，大小分布不均勻，多形成大油滴。復(fù)合酶配比為1∶1和2∶1時(shí)，米糠油體聚集體粒徑變小，油體呈現(xiàn)出相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)。復(fù)合酶配比為3∶1時(shí)，米糠油體粒徑變大，由之前的聚結(jié)狀態(tài)變?yōu)樾跄隣顟B(tài)，導(dǎo)致油體失穩(wěn)。

圖4 復(fù)合酶配比對(duì)米糠油體微觀結(jié)構(gòu)的影響

綜上，米糠油體提取的最佳復(fù)合酶配比為2∶1。

2.2 復(fù)合酶添加量對(duì)米糠油體得率和性質(zhì)的影響

在復(fù)合酶配比為2∶1、pH為5.0、酶解溫度為50℃、酶解時(shí)間為1.5 h條件下，調(diào)整復(fù)合酶添加量分別為1%、2%、3%、4%、5%(以體系質(zhì)量計(jì))，從米糠油體得率、粒徑分布、穩(wěn)定性與微觀結(jié)構(gòu)方面研究復(fù)合酶添加量對(duì)米糠油體制備的影響。

2.2.1 得率

復(fù)合酶添加量對(duì)米糠油體得率的影響見(jiàn)圖5。從圖5可以看出，隨著復(fù)合酶添加量從1%增加到5%，米糠油體得率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，復(fù)合酶添加量為3%時(shí)，米糠油體得率最大，為79.5%。酶添加量增大，使得酶與底物的接觸面積增大，從而使米糠細(xì)胞壁被充分破壞，釋放出更多的油體[18]；但酶的過(guò)度添加會(huì)導(dǎo)致油體完整性被破壞，降低米糠油體得率。

圖5 復(fù)合酶添加量對(duì)米糠油體得率的影響

2.2.2 粒徑分布及穩(wěn)定性

復(fù)合酶添加量對(duì)米糠油體粒徑分布的影響見(jiàn)圖6。

圖6 復(fù)合酶添加量對(duì)米糠油體粒徑分布的影響

從圖6可以看出，復(fù)合酶添加量為1%～3%時(shí)，米糠油體粒徑較小且均一，呈單峰分布，這可能是由于復(fù)合酶將細(xì)胞壁上部分多糖水解為單糖，適量的單糖可能在油體的油水界面上與蛋白質(zhì)相互作用產(chǎn)生強(qiáng)烈的空間作用力，有效阻礙了油體間的聚結(jié)[19]。同時(shí)，隨著復(fù)合酶添加量的增加，米糠油體的粒徑分布峰值向更小的尺寸移動(dòng)，復(fù)合酶添加量為3%時(shí)，粒徑最小。但是，復(fù)合酶添加量超過(guò)3%時(shí)，米糠油體粒徑呈現(xiàn)雙峰分布，粒徑大小不均一。

復(fù)合酶添加量對(duì)米糠油體穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖7。從圖7可以看出，隨著復(fù)合酶添加量的增加，米糠油體穩(wěn)定性呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。復(fù)合酶添加量為3%時(shí)，米糠油體穩(wěn)定性最好，可能是由于該條件下米糠油體具有較小的粒徑及較好的分散性。因此，復(fù)合酶添加量為3%時(shí)，米糠油體粒徑分布最均一，粒徑最小且穩(wěn)定性最好。

圖7 復(fù)合酶添加量對(duì)米糠油體穩(wěn)定性的影響

2.2.3 微觀結(jié)構(gòu)

復(fù)合酶添加量對(duì)米糠油體微觀結(jié)構(gòu)的影響見(jiàn)圖8。從圖8可以看出，復(fù)合酶添加量為1%時(shí)，米糠油體表現(xiàn)出明顯的聚結(jié)，多形成大油滴，在宏觀上表現(xiàn)為不穩(wěn)定的狀態(tài)，這可能是細(xì)胞壁沒(méi)有被充分水解，體系中單糖含量少，不足以與界面膜上的蛋白質(zhì)形成共聚物，導(dǎo)致油體液滴之間空間作用力弱，從而使液滴間發(fā)生聚結(jié)。當(dāng)復(fù)合酶添加量增加至2%～3%時(shí)，油體分布均勻，粒徑大小集中，宏觀體系表現(xiàn)為穩(wěn)定狀態(tài)，主要是因?yàn)轶w系中單糖含量增加，可以與界面膜上的蛋白質(zhì)充分作用，形成共聚物，使油體表面界面膜變厚，從而提高米糠油體穩(wěn)定性[20]。當(dāng)復(fù)合酶添加量再增大時(shí)，米糠油體液滴出現(xiàn)絮凝現(xiàn)象，且形成較多不規(guī)則的大油滴，這可能是由于體系中單糖含量過(guò)多，出現(xiàn)損耗絮凝，導(dǎo)致米糠油體失穩(wěn)。

圖8 復(fù)合酶添加量對(duì)米糠油體微觀結(jié)構(gòu)的影響

綜上，米糠油體提取的最佳復(fù)合酶添加量為3%。

2.3 pH對(duì)米糠油體得率和性質(zhì)的影響

在復(fù)合酶配比為2∶1、復(fù)合酶添加量為2%、酶解溫度為50℃、酶解時(shí)間為1.5 h條件下，調(diào)節(jié)pH分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，從米糠油體得率、粒徑分布、穩(wěn)定性與微觀結(jié)構(gòu)方面研究pH對(duì)米糠油體制備的影響。

2.3.1 得率

pH對(duì)米糠油體得率的影響見(jiàn)圖9。pH對(duì)于酶活性有顯著性影響，未處于最適pH時(shí)，酶活性較低。由于本研究中兩種細(xì)胞壁多糖酶的最適pH不同，因此將其復(fù)配后，需要重新驗(yàn)證最適pH。從圖9可以看出，隨著pH的增大，米糠油體得率呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢(shì)，pH為5.5時(shí)，米糠油體得率最高，為75.6%。

圖9 pH對(duì)米糠油體得率的影響

2.3.2 粒徑分布及穩(wěn)定性

pH對(duì)米糠油體粒徑分布的影響見(jiàn)圖10。

圖10 pH對(duì)米糠油體粒徑分布的影響

從圖10可以看出，在pH 4.0和pH 4.5條件下，米糠油體的粒徑呈雙峰分布，粒徑分布不均，發(fā)生油體聚結(jié)，可能是由于米糠油體表面蛋白質(zhì)等電點(diǎn)在pH 4.0左右，使得蛋白質(zhì)沉淀，米糠油體失穩(wěn)。pH在5.0～6.0時(shí)，米糠油體粒徑呈單峰分布，粒徑分布均勻，主要集中在8 μm左右。

pH對(duì)米糠油體穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖11。從圖11可以看出，pH 在4.0～6.0范圍內(nèi)，米糠油體的穩(wěn)定性呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì)，pH為5.0時(shí)，米糠油體的穩(wěn)定性最佳。因此，pH為5.0時(shí)，米糠油體粒徑分布最均一，粒徑最小且穩(wěn)定性最好。

圖11 pH對(duì)米糠油體穩(wěn)定性的影響

2.3.3 微觀結(jié)構(gòu)

pH對(duì)米糠油體微觀結(jié)構(gòu)的影響見(jiàn)圖12。從圖12可以看出，pH為4.0時(shí)，米糠油體聚結(jié)形成較多的大油滴，穩(wěn)定性差，與粒徑分布的結(jié)果一致。pH增大到5.0時(shí)，米糠油體大小分布集中，分散均勻，呈現(xiàn)出穩(wěn)定的狀態(tài)。pH在5.5～6.0范圍內(nèi)，米糠油體發(fā)生絮凝，逐漸失穩(wěn)，主要是因?yàn)槊卓酚腕w空間相互作用力減弱。

圖12 pH對(duì)米糠油體微觀結(jié)構(gòu)的影響

綜上，米糠油體提取的最佳pH為5.0。

2.4 酶解時(shí)間對(duì)米糠油體得率和性質(zhì)的影響

在復(fù)合酶配比為2∶1、復(fù)合酶添加量為2%、pH為5.0、酶解溫度為50℃條件下，分別攪拌反應(yīng)0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，從米糠油體得率、粒徑分布、穩(wěn)定性與微觀結(jié)構(gòu)方面研究酶解時(shí)間對(duì)米糠油體制備的影響。

2.4.1 得率

酶解時(shí)間對(duì)米糠油體得率的影響見(jiàn)圖13。從圖13可以看出，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，米糠油體得率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，酶解時(shí)間為1.5 h時(shí)，米糠油體得率最高。

圖13 酶解時(shí)間對(duì)米糠油體得率的影響

2.4.2 粒徑分布及穩(wěn)定性

酶解時(shí)間對(duì)米糠油體粒徑分布的影響見(jiàn)圖14。從圖14可以看出，酶解時(shí)間在0.5～2.0 h時(shí)，米糠油體粒徑呈單峰分布，酶解時(shí)間為1.5 h時(shí)，米糠油體粒徑分布最集中，酶解時(shí)間延長(zhǎng)至2.5 h時(shí)，米糠油體粒徑呈雙峰分布，出現(xiàn)大的聚集體，可能是由于酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，油體的界面膜被破壞，油滴聚合導(dǎo)致。

圖14 酶解時(shí)間對(duì)米糠油體粒徑分布的影響

酶解時(shí)間對(duì)米糠油體穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖15。從圖15可以看出，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，米糠油體穩(wěn)定性呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢(shì)。酶解0.5～1.0 h時(shí)，米糠油體穩(wěn)定性差，可能是由于酶解時(shí)間過(guò)短，酶解不充分，僅少量油體被釋放出來(lái)，游離的少量油體空間作用力弱。酶解1.5 h時(shí)，米糠油體顯示出較好的穩(wěn)定性，可能是由于該條件下米糠酶解充分，大量油體被釋放出來(lái)，油體間的空間作用力較強(qiáng)[21]。但隨著酶解時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，體系中的油滴發(fā)生聚結(jié)，體系失穩(wěn)，從而導(dǎo)致穩(wěn)定性變差。因此，酶解時(shí)間為1.5 h時(shí)，米糠油體粒徑分布最均一，粒徑最小且穩(wěn)定性最好。

圖15 酶解時(shí)間對(duì)米糠油體穩(wěn)定性的影響

2.4.3 微觀結(jié)構(gòu)

酶解時(shí)間對(duì)米糠油體微觀結(jié)構(gòu)的影響見(jiàn)圖16。從圖16可以看出，酶解時(shí)間為0.5 h時(shí)，米糠油體粒徑分布不均，有強(qiáng)烈的絮凝及聚結(jié)作用，表現(xiàn)為不穩(wěn)定狀態(tài)。當(dāng)酶解時(shí)間延長(zhǎng)至1.5 h時(shí)，米糠油體粒徑逐漸變小，分布均勻，無(wú)明顯的絮凝和聚結(jié)，穩(wěn)定性良好。繼續(xù)延長(zhǎng)酶解時(shí)間，米糠油體又表現(xiàn)出不穩(wěn)定狀態(tài)，可能是酶解過(guò)度導(dǎo)致油體完整性被破壞。這與粒徑及穩(wěn)定性的結(jié)果一致。

圖16 酶解時(shí)間對(duì)米糠油體微觀結(jié)構(gòu)的影響

綜上，米糠油體提取的最佳酶解時(shí)間為1.5 h。

2.5 米糠油體基本組成

在酶法提取米糠油體的最佳工藝條件(復(fù)合酶配比為2∶1，復(fù)合酶添加量為3%，pH為5.0，酶解時(shí)間為1.5 h，酶解溫度為50℃)下提取米糠油體，檢測(cè)米糠油體的基本組成，可得干基條件下米糠油體中脂肪含量為(87.37±0.16)%，蛋白質(zhì)含量為(12.63±0.14)%。

3 結(jié) 論

選用木聚糖酶和植物提取酶，以油體得率、粒徑分布、穩(wěn)定性及微觀結(jié)構(gòu)為考察指標(biāo)，對(duì)酶法提取米糠油體的條件(復(fù)合酶配比、復(fù)合酶添加量、pH、酶解時(shí)間)進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果顯示，在木聚糖酶與植物提取酶質(zhì)量比2∶1、復(fù)合酶添加量3%、pH 5.0、酶解溫度50℃和酶解時(shí)間1.5 h條件下提取米糠油體，所得米糠油體得率高，粒徑分布集中，粒徑達(dá)到微米級(jí)，且酶法提取不會(huì)破壞米糠油體表面蛋白質(zhì)，得到的米糠油體穩(wěn)定性良好、結(jié)構(gòu)完整。本研究為米糠油體的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)，對(duì)于提高油體穩(wěn)定性和拓寬油體在食品領(lǐng)域的應(yīng)用有重要意義。