相對分子質(zhì)量對木聚糖結(jié)晶能力的影響

金旭宸，項(xiàng)舟洋

(華南理工大學(xué) 制漿造紙工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510640)

木聚糖是闊葉木及草類植物細(xì)胞壁中半纖維素的主要成分，擁有由β-1,4-糖苷鍵連接的D-吡喃木糖單元構(gòu)成的主鏈結(jié)構(gòu)。根據(jù)植物來源的不同，木糖單元上C2、C3或C2/C3位的羥基往往被α-D-吡喃葡萄糖醛酸、4-O-甲基-α-D-吡喃葡萄糖醛酸及α-L-呋喃阿拉伯糖所取代。在植物細(xì)胞壁中，大多數(shù)的木聚糖被部分乙?；痆1-3]。由于乙?；捌渌ф湹挠绊?，原生木聚糖為無定形的聚合物，但是脫乙?；暗椭ф湺鹊哪揪厶强梢院腿軇┓肿永缢?、DMSO等形成結(jié)晶結(jié)構(gòu)[4-5]，最常見的為木聚糖水合晶。木聚糖水合晶中木聚糖分子構(gòu)型呈左手三重螺旋結(jié)構(gòu)，水分子填充在木聚糖分子構(gòu)型的空隙中，起到穩(wěn)定晶格的關(guān)鍵作用；木聚糖水合晶一旦完全干燥，排除掉所有水分子，結(jié)晶結(jié)構(gòu)就會消失[6-8]。芬蘭的Kontturi課題組以及法國的Nishiyama課題組聯(lián)合發(fā)現(xiàn)：在DMSO中充分分散的堿提脫乙酰木聚糖通過加熱誘導(dǎo)能夠與DMSO分子發(fā)生結(jié)晶，說明脫乙酰木聚糖不僅可以和水分子，還可以和其它溶劑分子形成結(jié)晶結(jié)構(gòu)[5]。通過化學(xué)衍生化合成的完全乙?；哪揪厶遣恍枰軇┓肿?，可以自身形成結(jié)晶結(jié)構(gòu)，乙?；紦?jù)了水合晶中水分子的位置，因而不需要水分子的穩(wěn)定作用[9]。堿處理能夠脫除木聚糖上的乙?；曳蛛x得率較高，是木聚糖常用的分離方法。堿提木聚糖在很多情況下以水合晶的形式存在，特別是高濃度堿提取或低濃度酒精沉淀出來的支鏈度較低的木聚糖[4]。水合晶的存在會降低木聚糖的溶解性、分散性及黏度[10]，阻礙木聚糖水鑄膜的成膜[4]，但是有利于木聚糖對油水混合液的乳化及對無機(jī)功能粒子例如碳納米管(CNT)的分散[11]。前人的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)天然分離的脫乙酰木聚糖的結(jié)晶受其支鏈的抑制，支鏈糖基和木糖物質(zhì)的量比(支鏈度)為1∶13～1∶40的闊葉木木聚糖樣品中，支鏈度越高，X射線衍射(XRD)觀察到的結(jié)晶衍射環(huán)越不明顯[8]。黑麥木聚糖支鏈度大于0.5時(shí)為無定形，小于0.5時(shí)XRD分析能發(fā)現(xiàn)明顯的木聚糖水合晶特征峰[10]。本課題組最新的研究也發(fā)現(xiàn)，蔗渣木聚糖支鏈度大于0.15時(shí)為無定形，小于0.15時(shí)具有木聚糖水合晶的XRD特征峰?？梢钥闯觯揪厶堑乃辖Y(jié)晶能力與其化學(xué)結(jié)構(gòu)高度關(guān)聯(lián)，而鮮有報(bào)道從相對分子質(zhì)量的角度來分析其對木聚糖結(jié)晶能力的影響。已有文獻(xiàn)表明減少聚合物分子鏈的長度能夠增加分子鏈的自由度并降低其聚集形成規(guī)整結(jié)構(gòu)的概率[12]，因此推測，通過調(diào)控脫乙酰木聚糖的相對分子質(zhì)量也可以影響木聚糖結(jié)晶能力。本研究通過內(nèi)切木聚糖酶處理的方法，獲得具有不同相對分子質(zhì)量的脫乙酰木聚糖，探究相對分子質(zhì)量對木聚糖結(jié)晶能力的影響，以期為木聚糖的性能調(diào)控及高值化應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料、試劑與儀器

木聚糖(提取自甘蔗渣),購自上海源葉生物科技有限公司。木聚糖酶(內(nèi)切酶)，酶活10 000 U/mg，上海麥克林公司。醋酸、醋酸鈉、乙醇等藥品，均為市售分析純。

AT-100D恒溫培養(yǎng)搖床；LSH-50CL恒溫恒濕箱；IC-3000型高效離子色譜，配備陰離子交換柱CarboPacTMPA20, 美國Dionex公司；Agilent PL-GPC 50凝膠滲透色譜(GPC)，美國Agilent公司；TG209F1熱重分析儀，德國耐馳公司；X’Pert Powder X射線衍射(XRD)儀，荷蘭Eindhoven公司；LY-SSR轉(zhuǎn)子黏度計(jì)，上海方瑞儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1不同相對分子質(zhì)量木聚糖的制備 參考文獻(xiàn)[13]利用內(nèi)切木聚糖酶制備不同相對分子質(zhì)量的木聚糖樣品。將0.02 g木聚糖酶溶于100 mL蒸餾水中，在室溫下完全溶解得到木聚糖酶溶液。將5 g木聚糖粉末、250 mL醋酸鈉緩沖液(0.1 mol/L，pH值 4.8)置于500 mL藍(lán)口玻璃瓶中，充分?jǐn)嚢?.5 h，之后加入2.5 mL木聚糖酶溶液，并將其置于40 ℃的AT-100D恒溫培養(yǎng)搖床以300 r/min分別振蕩1.5、2.5、3.5、4.5、6.5和8.5 h。反應(yīng)完畢后，將藍(lán)口瓶置于105 ℃烘箱中約7 min，進(jìn)行滅活。冷卻至室溫后，加入3倍體積的無水乙醇進(jìn)行沉淀。分離后用70%乙醇對固體沉淀進(jìn)行多次洗滌，之后凍干，得到不同相對分子質(zhì)量的粉末狀木聚糖樣品。根據(jù)酶處理時(shí)間由短到長(1.5～8.5 h)，酶處理的木聚糖樣品被分別命名為X1、X2、X3、X4、X5和X6，未經(jīng)處理的木聚糖則用X0表示。

在室溫下將X1～X6樣品分別溶解于質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%及4% NaOH溶液中，用5 mol/L的HCl將溶液pH值調(diào)節(jié)為5.5，之后倒入3倍體積的無水乙醇中，使木聚糖樣品再次沉淀出來，分離、洗滌、凍干后將2% NaOH溶解再沉淀樣品分別命名為RLX1～RLX6，將4% NaOH溶解再沉淀樣品分別命名為RHX1～RHX6。

1.2.2木聚糖水鑄膜的制備 將0.6 g木聚糖粉末分散于8 mL去離子水中，得到質(zhì)量濃度75 g/L的分散液。將分散液于90 ℃下攪拌30 min，轉(zhuǎn)速為350 r/min。攪拌結(jié)束后，將分散液倒入聚四氟乙烯模具(65 mm×40 mm)中，于LSH-50CL恒溫恒濕箱中以溫度50 ℃、相對濕度70%干燥24 h。

1.3 分析與表征

1.3.1木聚糖的化學(xué)組分 根據(jù)文獻(xiàn)[4]的方法對木聚糖進(jìn)行水解。木聚糖水解液中的中性糖含量由IC-3000型高效離子色譜測定。用200 mmol/L NaOH溶液對色譜柱進(jìn)行沖洗，再用水、20 mmol/L NaOH溶液和500 mmol/L乙酸鈉溶液以0.5 mL/min的流速梯度洗脫。

1.3.2木聚糖相對分子質(zhì)量 利用Agilent PL-GPC 50凝膠滲透色譜測定木聚糖的重均相對分子質(zhì)量(Mw)和數(shù)均相對分子質(zhì)量(Mn)，考察木聚糖的分散性指數(shù)(PDI)。約5 mg的木聚糖粉末溶解于1.5 mL流動相，檢測進(jìn)樣量為100 μL，柱溫為40 ℃，流動相為二甲基亞砜(DMSO)溶液，流速為0.6 mL/min。用聚甲基丙烯酸甲酯/聚苯乙烯標(biāo)準(zhǔn)品作相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)品相對分子質(zhì)量分別為4 880、13 750、41 570、237 000和400 600。

1.3.3木聚糖熱穩(wěn)定性 木聚糖粉末樣品熱穩(wěn)定性通過TG209F1熱重分析儀測定。溫度變化范圍為室溫至500 ℃，升溫速率為10 ℃/min，實(shí)驗(yàn)氣氛為氮?dú)狻?/p>

1.3.4XRD分析 由對稱反射模式的X’Pert Powder X射線衍射儀測定，配備在40 kV和40 mA下工作的銅X射線源(k=0.154 18 nm)。凍干后的木聚糖粉末樣品被裝入中心孔深為200 μm的粉末樣品臺上。輕輕按壓樣品后，用平刃將高于平臺表面的多余樣品擦掉。

1.3.5木聚糖分散液黏度 約1 g的木聚糖粉末充分分散于9 mL的2% NaOH溶液中配置成固含量為10%的木聚糖分散液。取適量體積溶液，用LY-SSR轉(zhuǎn)子黏度計(jì)在30～100 r/min的剪切速率范圍內(nèi)測定分散液的黏度。每份分散液黏度測量2次，取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶處理對木聚糖相對分子質(zhì)量的影響

選取的蔗渣木聚糖前期的研究[4]已經(jīng)對其進(jìn)行了化學(xué)組分及水溶性分析，其含有76.5%的木糖，7.5%的阿拉伯糖以及3.9%的葡萄糖醛酸，具有較高的木糖含量，支鏈度較低，不具有乙酰基，且水溶性較低。酶處理及酶-堿處理后木聚糖的化學(xué)組分及相對分子質(zhì)量見表1。

表1 酶處理及酶-堿處理后木聚糖的化學(xué)組分及相對分子質(zhì)量

從表1中可以得知，隨著酶解時(shí)間的增加，木聚糖樣品的相對分子質(zhì)量不斷降低。酶解1.5 h后，木聚糖Mw及Mn分別由原料木聚糖的58 000和17 500顯著降低至32 700和7 900，說明內(nèi)切木聚糖酶處理能夠有效降低木聚糖的相對分子質(zhì)量。然而，酶解處理超過2.5 h后，雖然木聚糖的Mn繼續(xù)降低，但是木聚糖的Mw變化不大；反映在木聚糖聚合物分散性指數(shù)(PDI)上，PDI隨酶解時(shí)間增加而增大，從原料木聚糖的3.31增大至酶解木聚糖的4.14～6.12，說明木聚糖酶解為非均相反應(yīng)，這是本研究選取的木聚糖水溶性較低的緣故。木聚糖聚集態(tài)結(jié)構(gòu)中靠外或較松散的部分被率先酶解，造成相對分子質(zhì)量顯著降低；而隨著酶解時(shí)間增加，酶分子仍然難以進(jìn)入木聚糖聚集態(tài)結(jié)構(gòu)中結(jié)晶或者結(jié)合較緊密的部分，只能繼續(xù)酶解易酶解部分，生成許多小相對分子質(zhì)量片段，導(dǎo)致Mn持續(xù)降低，而PDI持續(xù)升高。木聚糖的化學(xué)組分分析顯示，不同酶解時(shí)間處理的木聚糖的阿拉伯糖/木糖質(zhì)量比有輕微波動，但是在離子色譜測量誤差范圍內(nèi)，不能做出木聚糖化學(xué)組分產(chǎn)生變化的判斷(表1)。因此，總體上來說，內(nèi)切木聚糖酶處理對木聚糖化學(xué)組分影響較小，這是由于內(nèi)切木聚糖酶的作用機(jī)理為切斷木聚糖主鏈上的β-1,4-糖苷鍵，對阿拉伯糖支鏈基團(tuán)的影響較小[14]。

2.2 木聚糖結(jié)晶能力分析

木聚糖酶處理后樣品的XRD分析可見圖1(a)。從圖可以看出，未經(jīng)酶處理的木聚糖(X0)具有明顯的木聚糖水合晶XRD特征峰，且結(jié)晶度較高，這是其支鏈度較低所致，與先前的研究結(jié)果相符合[4]。酶處理1.5 h的木聚糖(X1)在相對分子質(zhì)量有較大程度降低的情況下仍保持明顯的XRD特征峰，進(jìn)一步說明非均相木聚糖酶解過程首先是非晶部分的酶解。酶解處理超過2.5 h后，隨著酶解時(shí)間的增加，木聚糖XRD特征峰的半峰寬變大，部分特征峰變得不明顯，說明其結(jié)晶度逐漸減小[15]。因此，可以推斷，長時(shí)間非均相酶解處理雖然不能大幅降低木聚糖相對分子質(zhì)量，但是會對木聚糖結(jié)晶結(jié)構(gòu)造成一定破壞。然而，X3～X6木聚糖結(jié)晶度雖然有所降低，但可看出仍保留有一定的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，特別是110晶面的特征峰仍然明顯，說明木聚糖結(jié)晶結(jié)構(gòu)中的110晶面難以被酶破壞。

木聚糖的酶處理為非均相反應(yīng)，對結(jié)晶結(jié)構(gòu)的破壞并不能反映其對木聚糖結(jié)晶能力的影響，因此將酶處理后的木聚糖在堿溶液里溶解或分散并重新沉淀，觀察木聚糖結(jié)晶能力的變化。將木聚糖溶解并重新沉淀的過程可以視為其重結(jié)晶過程。將木聚糖樣品使用2% NaOH溶液處理，樣品均勻地分散在溶液中，但并未完全溶解，為黃色懸浮液。使用無水乙醇沉淀并凍干之后進(jìn)行XRD分析，與酶解之后直接沉淀得到的木聚糖樣品(X系列)相比，RLX1和RLX2樣品結(jié)晶度進(jìn)一步降低，其他RLX樣品的結(jié)晶度未發(fā)生明顯變化(圖1(b))。將X系列木聚糖樣品使用4% NaOH溶液處理，所有樣品均全部溶解，為黃色透明溶液。沉淀后得到的木聚糖樣品RHX1～RHX6均具有與未處理木聚糖相同的木聚糖水合晶XRD特征峰，且峰型均較為尖銳，具有與未處理木聚糖相似的結(jié)晶度(圖1(c))。對堿溶解或分散并重新沉淀的木聚糖進(jìn)行化學(xué)組成及相對分子質(zhì)量分析，可以發(fā)現(xiàn)阿拉伯糖/木糖質(zhì)量比、相對分子質(zhì)量、PDI等與堿處理之前的木聚糖樣品相比幾乎沒有變化(表1)，這可能是由于堿處理是在室溫下進(jìn)行，并且時(shí)間較短，因而對木聚糖化學(xué)結(jié)構(gòu)影響較小，可以排除堿處理后木聚糖結(jié)晶度變化是由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)變化所致。

a.木聚糖酶xylanase；b.木聚糖酶xylanase+2% NaOH；c.木聚糖酶xylanase+4% NaOH

內(nèi)切木聚糖酶可以切斷木聚糖鏈，從而破壞木聚糖的水合晶結(jié)構(gòu)，造成了木聚糖結(jié)晶度的降低(圖1(a))。由于堿能破壞木聚糖分子間的氫鍵，因此2% NaOH處理后，木聚糖的結(jié)晶度進(jìn)一步降低(圖1(b))。由于酶處理及2% NaOH分散均為非均相反應(yīng)，木聚糖分子鏈不能進(jìn)行自由運(yùn)動，分子鏈的排列未能進(jìn)行重構(gòu)，因此僅能說明木聚糖的結(jié)晶結(jié)構(gòu)受到了破壞，并不能說明其結(jié)晶能力的變化。當(dāng)提高堿溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，使用4% NaOH溶液對木聚糖進(jìn)行處理時(shí)，木聚糖能夠完全溶解，分子鏈能夠自由運(yùn)動、排列，在重新沉淀過程中木聚糖分子鏈可重新規(guī)整排列，因此能夠分析出木聚糖結(jié)晶能力的變化。結(jié)果顯示：4% NaOH溶解的酶處理木聚糖，重新沉淀后再度形成完整的木聚糖水合晶結(jié)構(gòu)(圖1(c))。由此可知，非均相的酶解處理能夠通過破壞木聚糖分子鏈干擾木聚糖的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，但是并不能降低其結(jié)晶能力，因此當(dāng)相對分子質(zhì)量降低的木聚糖分子重新規(guī)整排列之后，完整水合晶結(jié)構(gòu)再度出現(xiàn)。

2.3 分散液黏度分析

將部分經(jīng)過酶解后的木聚糖樣品充分分散于2% NaOH溶液中，并測定分散液黏度，結(jié)果數(shù)據(jù)可見圖2。從圖2可以清晰看出，隨著剪切速率的升高，原料木聚糖分散液的黏度由110 mPa·s逐步降低為77 mPa·s。與未改性的木聚糖相似，X1～X4分散液同樣出現(xiàn)了剪切變稀現(xiàn)象。剪切變稀現(xiàn)象的出現(xiàn)是在靜止?fàn)顟B(tài)下，木聚糖分子上的羥基與水分子形成的氫鍵隨著剪切速率的增大而逐步被破壞所致[16-17]。因此，酶解作用并不會改變木聚糖流體性質(zhì)，即其剪切稀化特性；酶解木聚糖黏度的依次降低可再次證明木聚糖平均相對分子質(zhì)量的降低(表1)。

圖2 10%固含量木聚糖分散液黏度

2.4 成膜性能分析

未處理的木聚糖及經(jīng)酶處理的木聚糖樣品(X1～X6)均未能形成完整水鑄膜，當(dāng)鑄膜液中的水分揮發(fā)后，薄膜呈碎裂狀，如圖3所示。由圖可見，干燥后X4～X6(圖3(b)～(d))碎膜的裂紋間隙小于X1(圖3(a))，這可能是由于X4～X6木聚糖的結(jié)晶度小于X1所致。但X4～X6木聚糖仍保留有一定的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，因此未能形成完整薄膜。這與本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)相符，木聚糖的水合結(jié)晶抑制其水鑄膜的成膜性能[4]，圖3所示結(jié)果再次證明此結(jié)論。

a.X1；b.X4；c.X5；d.X6

2.5 熱穩(wěn)定性能分析

酶處理木聚糖X1～X4的TG/DTG曲線見圖4。由圖可知，在溫度小于100 ℃時(shí)，樣品中的水分率先蒸發(fā)。原料木聚糖X0及經(jīng)酶處理的木聚糖樣品X1～X4分別于282、278、276、274和267 ℃開始降解。隨著平均相對分子質(zhì)量的降低，木聚糖的起始分解溫度也隨之降低；木聚糖的相對分子質(zhì)量越小，破壞木聚糖分子結(jié)構(gòu)所需能量更低，因此其起始分解溫度更低。5種木聚糖樣品的最高降解速率溫度均在304～308 ℃之間，差異性不大?？偟膩碚f，不同木聚糖樣品的起始分解溫度差距在15 ℃以內(nèi)，區(qū)別不大，而最能反映熱穩(wěn)定性的最高降解速率溫度差距更是在4 ℃以內(nèi)，說明木聚糖的相對分子質(zhì)量對其熱穩(wěn)定性影響不大。

圖4 木聚糖的TG(a)和DTG(b)曲線

3 結(jié) 論

3.1對木聚糖進(jìn)行非均相的木聚糖酶處理，木聚糖化學(xué)結(jié)構(gòu)(阿拉伯糖/木糖質(zhì)量比值)沒有顯著變化，而相對分子質(zhì)量變化較大；酶處理2.5 h后，木聚糖Mw從58 000降至25 700，Mn從17 500降至5 400，PDI從3.31升高至4.73；之后，隨著酶處理時(shí)間進(jìn)一步延長至8.5 h，木聚糖Mw變化不大，Mn繼續(xù)下降至3 400，PDI繼續(xù)升高至6.12。

3.2X射線衍射(XRD)分析表明：非均相的木聚糖酶處理以及進(jìn)一步的非均相堿液(2% NaOH溶液)處理使木聚糖水合晶的大部分特征峰的峰強(qiáng)變?nèi)?，結(jié)晶度降低，說明其水合晶結(jié)構(gòu)遭到破壞。將不同相對分子質(zhì)量的酶處理木聚糖完全溶解于4% NaOH溶液，使其分子鏈能夠自由運(yùn)動及重新排列，重新沉淀后的木聚糖XRD譜圖顯示：木聚糖水合晶完整的結(jié)晶結(jié)構(gòu)能夠再度形成，且具有較高的結(jié)晶度，說明非均勻地降低木聚糖的相對分子質(zhì)量對其水合結(jié)晶能力沒有明顯影響。

3.3木聚糖平均相對分子質(zhì)量的降低沒有顯著改變木聚糖的熱穩(wěn)定性及剪切稀化的流變性質(zhì)，但是黏度隨著相對分子質(zhì)量的降低而降低；在50 r/min的剪切速率下，黏度從未處理木聚糖的約100 mPa·s降至X4木聚糖的約20 mPa·s。

3.4酶處理木聚糖的水鑄膜成膜性能仍然受其結(jié)晶的抑制，單純降低相對分子質(zhì)量并沒有改善其水鑄膜成膜性能。