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    lncRNA GHET1通過Wnt/β-catenin信號通路對子癇前期滋養(yǎng)層細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

    2022-10-18 11:43:24黃曉妹王洪偉韓貞艷韋秋園黃素靜
    關(guān)鍵詞:滋養(yǎng)層細(xì)胞周期胎盤

    黃曉妹,王洪偉,韓貞艷,韋秋園,黃素靜

    (海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院產(chǎn)科,海南 ???570100)

    子癇前期(preeclampsia,PE)作為一種臨床常見的妊娠期并發(fā)癥,嚴(yán)重影響母嬰健康,是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒死亡的重要原因之一[1]。迄今為止,PE的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。既往研究[2]顯示:胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤不足是導(dǎo)致子宮螺旋動脈功能障礙并最終形成PE的主要原因。研究[2]顯示:滋養(yǎng)層細(xì)胞的高增殖和高侵襲特性與腫瘤細(xì)胞具有一定的相似性,探究腫瘤相關(guān)分子在滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲中的作用可能對闡明PE發(fā)生機(jī)制具有積極意義。

    長 鏈 非 編 碼RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)是一類長度超過200個(gè)核苷酸且不具有蛋白質(zhì)編碼功能的RNA序列。lncRNAs通過基因印跡、組蛋白修飾、染色體重塑、選擇性剪切和細(xì)胞周期控制等作用在表觀、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá),參與機(jī)體的病理生理過程[3]。位于7號染色體上的lncRNA胃癌高表達(dá)轉(zhuǎn)錄本1(lncRNA gastric carcinoma high expression transcript 1,lncRNA GHET1)是一種已被證實(shí)能夠上調(diào)胃癌、肝癌、前列腺癌及宮頸癌等多種腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transformation,EMT)等能力進(jìn)而促進(jìn)疾病進(jìn)展的lncRNA[4]。對于其能否通過影響滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖和侵襲能力而參與PE的進(jìn)展及其相關(guān)作用機(jī)制尚未完全闡明。本研究旨在探討lncRNA GHET1在PE患者胎盤組織中表達(dá)及其對滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)展和細(xì)胞侵襲等行為的影響及其作用機(jī)制,以期為lncRNA GHET1可能成為治療及改善PE的潛在控制靶點(diǎn)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 臨床資料選擇2018年10月—2019年10月于海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院產(chǎn)科住院分娩的孕產(chǎn)婦30例作為研究對象。根據(jù)謝興等主編的第9版《婦產(chǎn)科學(xué)》中的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]將研究對象分為正常對照孕產(chǎn)婦組(正常組)15例和PE孕產(chǎn)婦組(PE組)15例。

    1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn):①所有孕產(chǎn)婦均為陰道分娩;②所有孕產(chǎn)婦年齡均在20~35歲;③所有研究對象均為自然單胎受孕。排除標(biāo)準(zhǔn):①并發(fā)原發(fā)性高血壓或肝、腎、心、腦、糖尿病及內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病等;②孕期使用激素類藥物或并發(fā)胎盤早剝及前置胎盤等妊娠并發(fā)癥;③既往有早產(chǎn)、宮內(nèi)死胎和胎兒染色體異常等不良分娩史。本研究經(jīng)本院倫理委員會審批,所有研究對象均簽署知情同意書。

    1.3 細(xì)胞、主要試劑和儀器人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo(HTR-8細(xì)胞)(美國ATCC細(xì)胞庫)。RPMI-1640(美國Hyclone公司),胎牛血清(杭州天航生物科技有限公司),100 U·mL-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素雙抗混合液(美國Sigma公司),過表達(dá)lncRNA GHET1和陰性對照序列pcDNA 3.1載體質(zhì)粒(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司),Lipofectamine 3 000和TRIzol(美 國Invitrogen公司),PrimeScriptTMRT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR ExScript RT-PCR試劑盒(日本TaKaRa公司),RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、BCA試劑盒和PI/RNase細(xì)胞周期流式檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司),HE染色試劑盒和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(北京索萊寶科技有限公司),CCK-8試 劑 盒、小 鼠 抗E-鈣 黏 蛋 白(E-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)單克隆抗體(美國Abcam公司),兔抗糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK3β)、磷酸化糖原合成酶激酶3β(phosphorylated glycogen synthase kinase 3β,p-GSK3β)和β-連 環(huán) 蛋 白(β-catenin)單克隆抗體(美國Santa Cruz公司),兔抗細(xì)胞性骨髓細(xì)胞瘤病病毒癌基因(cellularmyelocytomatosis viral oncogene,c-Myc)、細(xì)胞周期 素D1(cyclinD1)和GAPDH(美 國Cell Signaling Technology公司),Matrigel基質(zhì)膠(美國BD Biosciences公司)。Transwell小室(8 μm)(美國Millipore公司),光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)。

    1.4 2組研究對象胎盤組織處理孕產(chǎn)婦分娩中胎盤娩出后立即收集全層胎盤組織約20~40 g,置于冰上迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。無菌生理鹽水充分清洗血污后,將胎盤組織分為2部分,一部分固定于4%多聚甲醛溶液中進(jìn)行HE染色,以觀察2組胎盤組織的形態(tài)表現(xiàn);另一部分置于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

    1.5 HTR-8細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組HTR-8細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS和1%青-鏈霉素DMEM-1640培養(yǎng)基中,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前,常規(guī)使用1%胰蛋白酶進(jìn)行消化生長融合至80%HTR-8細(xì)胞,計(jì)數(shù)后,按每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,培養(yǎng)過夜后,使用Lipofectamin 3 000轉(zhuǎn)染試劑將過表達(dá)lncRNA GHET1和陰性對照序列pcDNA3.1載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HTR-8細(xì)胞中,培養(yǎng)6 h后更換為含10%FBS的DMEM-1640培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將HTR-8細(xì)胞隨機(jī)分為對照組(常規(guī)培養(yǎng))、lncRNA GHET1組(轉(zhuǎn)染過表達(dá)lncRNA GHET1質(zhì)粒)和陰性對照組(轉(zhuǎn)染陰性對照序列質(zhì)粒)。

    1.6 HE染色觀察2組研究對象胎盤組織病理形態(tài)表現(xiàn)將2組研究對象的胎盤組織樣本置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h,常規(guī)石蠟包埋,制備4 μm厚切片,二甲苯和梯度酒精脫蠟至水,隨后使用蘇木素染色5 min,水洗1 min,氨水返藍(lán),伊紅染色2 min,再次進(jìn)行酒精脫水和二甲苯透明,最后封片、鏡檢。

    1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative,RT-qPCR)法檢測2組研究對象胎盤組織和各組HTR-8細(xì)胞中l(wèi)ncRNA GHET1 mRNA表達(dá)水平使用TRIzol提取胎盤組織和滋養(yǎng)層細(xì)胞中總RNA,紫外分光光度計(jì)測定所提取RNA的純度及濃度后,按照PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。RT-qPCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性30 s,95℃變性10 s,60℃退火/延伸20 s,40個(gè)循環(huán)。25 μL RT-qPCR反應(yīng)體 系:引 物10 pmol,2×SYBR ExScript kit試劑10 μL,模板3 μL,ddH2O 10 μL。RT-qPCR引物:lncRNA GHET1,F(xiàn) 5′-CCCCACAAATGAAGACACT-3′,R 5′-TTCCCAACACCCTATAAGAT-3′;GAPDH,F(xiàn) 5′-GTCGGTGTGAACGGATTTG-3′,R 5′-AAGATGGTGATGGGCTTC-3′。以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計(jì)算2組研究對象胎盤組織和各組HTR-8細(xì)胞中l(wèi)ncRNA GHET1mRNA表達(dá)水平。

    1.8 CCK-8法檢測各組HTR-8細(xì)胞增殖率HTR-8細(xì)胞按每孔5×103個(gè)接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔,分別置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)12、24和48 h后加入10 μL CCK-8試劑,孵育3 h,于酶標(biāo)儀450 nm波長處檢測各組各時(shí)間點(diǎn)的吸光度(A)值。其中以各組0 h時(shí)的A值為對照組A值,計(jì)算細(xì)胞增殖率,實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。細(xì)胞增殖率=(實(shí)驗(yàn)組A值-對照組A值)/對照組A值×100%。

    1.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組不同細(xì)胞周期HTR-8細(xì)胞百分率取HTR-8細(xì)胞,4℃預(yù)冷PBS緩沖液輕輕洗滌,胰蛋白酶常規(guī)消化,300 g離心5 min,收集細(xì)胞沉淀,500 μL PBS緩沖液重懸細(xì)胞后加入-20℃預(yù)冷70%乙醇溶液3.5 mL,4℃固定過夜。PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次,按照細(xì)胞周期流式檢測試劑盒說明書方法加入500 μL PI/RNase染色液,4℃避光孵育30 min。采用流式細(xì)胞儀分析各組不同細(xì)胞周期HTR-8細(xì)胞百分率,實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

    1.10 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測各組HTR-8細(xì)胞侵襲能力常規(guī)消化轉(zhuǎn)染后HTR-8細(xì)胞,將重懸于不含F(xiàn)BS培養(yǎng)基中各組HTR8細(xì)胞按每孔5×104個(gè)接種于包被Martrigel基質(zhì)膠的Transwell小 室 中,Transwell上 室 加 入600 μL含15%FBS常規(guī)RPMI-1640培養(yǎng)液。每組設(shè)定3個(gè)復(fù)孔,于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。取出上室,PBS緩沖液洗滌2次,濕棉簽擦拭小室上層未穿出細(xì)胞,4%多聚甲醛室溫下固定15 min,0.1%結(jié)晶紫染色30 min,PBS緩沖液洗滌2次,光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察,并計(jì)算侵襲細(xì)胞數(shù),代表細(xì)胞侵襲能力。上述實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

    1.11 Western blotting法檢測各組HTR-8細(xì)胞中c-Myc、cyclinD1、GSK3β、p-GSK3β、E-cadherin、Vimentin和β-catenin蛋白表達(dá)水平采用RIPA裂解液、蛋白酶和磷酸酶抑制劑提取各組HTR-8細(xì)胞總蛋白。BCA法蛋白定量后,每組取約40 μg蛋白樣品于SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,隨后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上。室溫下,5%脫脂奶粉封閉1 h,4℃抗體孵育過夜,包括E-cadherin(1∶1 000)、Vimentin(1∶1 000)、GSK3β(1∶800)、p-GSK3β(1∶800)、β-catenin(1∶1 000)、c-Myc(1∶800)、cyclinD1(1∶800)和GAPDH(1∶2 000)。次日,室溫下用過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(稀釋1∶5 000)孵育1 h。滴加增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液,采用凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照,采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值,實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。以GAPDH為內(nèi)參,計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

    1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2組研究對象年齡、分娩孕周、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)、血壓、24 h尿蛋白、胎盤質(zhì)量和新生兒體質(zhì)量及胎盤組織中l(wèi)ncRNA GHET1 mRNA表達(dá)水平,各組HTR-8細(xì)胞中l(wèi)ncRNA GHET1 mRNA表達(dá)水平、細(xì)胞增殖率、不同細(xì)胞周期細(xì)胞百分率、侵襲細(xì)胞數(shù)及各組HTR-8細(xì) 胞 中c-Myc、cyclinD1、E-cadherin、Vimentin和β-catenin蛋 白 表 達(dá) 水 平 及p-GSK3β/GSK3β比值均符合正態(tài)分布,以±s表示,2組間樣本均數(shù)比較采用配對樣本t檢驗(yàn),多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析,組間樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 2組研究對象臨床資料正常組與PE組孕產(chǎn)婦 的 臨 床 資 料 中 年 齡 [(30.31±3.06) 和(27.89±4.11)歲]、孕周[(37.12±0.40)和(35.26±0.81)周)、產(chǎn)前BMI[(22.19±1.30)和(23.11±0.84)kg·m-2]、新 生 兒 體 質(zhì) 量[(2 930.67±554.83)和(2 670.02±689.77)g]比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與正常組比 較,PE組患者 收縮壓[(112.33±2.58)和(156.10±7.09)mmHg]、舒 張 壓[(74.03±3.28)和(94.22±1.01)mmHg]及24 h尿蛋白水 平[(0.00±0.00)和(0.48±0.17)g·L-1]均明顯升高(P<0.01),胎盤質(zhì)量[(525.17±63.30) 和 (410.73±59.10)g] 明 顯 降 低(P<0.01)。

    2.2 2組研究對象胎盤組織病理形態(tài)表現(xiàn)HE染色結(jié)果顯示:正常組胎盤組織絨毛發(fā)育良好,絨毛內(nèi)血管密度豐富,可見少量鈣化灶和合體結(jié)節(jié)。與正常組比較,PE組胎盤組織的絨毛發(fā)育不良,數(shù)量減少,絨毛內(nèi)及間質(zhì)血管分布紊亂,血管壁出現(xiàn)纖維素樣壞死,鈣化區(qū)域及絨毛上的合體結(jié)節(jié)增加。見圖1。

    圖1 2組研究對象胎盤組織病理形態(tài)表現(xiàn)(HE,×200)Fig.1 Pathomorphology of placenta tissue of subjects in two groups(HE,×200)

    2.3 2組研究對象胎盤組織和各組HTR-8細(xì)胞中l(wèi)ncRNA GHET1 mRNA表達(dá)水平RT-qPCR結(jié) 果顯示:與正常組比較,PE組患者胎盤組織中l(wèi)ncRNA GHET1 mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。見圖2。與對照組比較,GHET1組HTR-8細(xì)胞中l(wèi)ncRNA GHET1 mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.01),陰性對照組上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

    圖2 2組研究對象胎盤組織中l(wèi)ncRNA GHET1 mRNA表達(dá)水平Fig.2 Expression levels of lncRNA GHET1 mRNA in placenta tissue of subjects in two groups

    圖3 各組HTR-8細(xì)胞中l(wèi)ncRNA GHET1 mRNA表達(dá)水平Fig.3 Expression levels of lncRNA GHET1 mRNA in HTR-8 cells in various groups

    2.4 各組HTR-8細(xì)胞增殖率CCK-8法檢測結(jié)果顯示:與對照組比較,培養(yǎng)24和48 h時(shí)GHET1組HTR-8細(xì)胞增殖率明顯升高(P<0.05),陰性對照組上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

    圖4 CCK-8法檢測各組HTR-8細(xì)胞增殖率Fig.4 Proliferation rates of HTR-8 cells in various groups detected by CCK-8 method

    2.5 各組不同細(xì)胞周期HTR-8細(xì)胞百分率流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示:與對照組比較,GHET1組HTR-8細(xì)胞中G1期細(xì)胞百分率明顯降低(P<0.05),S期細(xì)胞百分率明顯升高(P<0.05),陰性對照組上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖5。

    圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組不同細(xì)胞周期HTR-8細(xì)胞百分率Fig.5 Percentages of HTR-8 cells at different cell cycles in various groups detected by flow cytometry

    2.6 各組HTR-8細(xì)胞侵襲能力Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與對照組(102個(gè)±11個(gè))比較,GHET1組HTR-8細(xì)胞中侵襲細(xì)胞數(shù)(114個(gè)±27個(gè))明顯升高(P<0.05),陰性對照組侵襲細(xì)胞數(shù)(97個(gè)±19個(gè))差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖6。

    圖6 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測各組HTR-8細(xì)胞侵襲情況(結(jié)晶紫,×100)Fig.6 Invasion of HTR-8 cells in various groups detected by Transwell chamber experiment(Crystal violet,×100)

    2.7 各組HTR-8細(xì)胞中c-Myc、cyclinD1、E-cadherin、Vimentin和β-catenin蛋白表達(dá)水平及p-GSK3β/GSK3β比值Western blotting法檢測結(jié)果顯示:與對照組細(xì)胞比較,GHET1組HTR-8細(xì)胞中c-Myc、cyclinD1蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05),陰性對照組HTR-8細(xì)胞中c-Myc和cyclinD1蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見 圖7。與 對 照 組 比 較,GHET1組HTR-8細(xì) 胞 中E-cadherin蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05),Vimentin蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05);陰性對照上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖8。與對照組比較,GHET1組HTR-8細(xì)胞中 β-catenin蛋白表達(dá)水平和p-GSK3β/GSK3β比 值 均 明 顯 升 高(P<0.05),陰性對照組上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖9。

    圖7 Western blotting法檢測各組HTR-8細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖(A)和直條圖(B)Fig.7 Electrophoregram(A)and histogram(B)of expressions of cell cycle-related proteins in HTR-8 cells in various groups detected by Western blotting method

    圖8 Western blotting法檢測各組HTR-8細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖(A)和直條圖(B)Fig.8 Electrophoregram(A)and histogram(B)of expressions of EMT-related proteins in HTR-8 cells in various groups detected by Western blotting method

    圖9 Western blotting法檢測各組HTR-8細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖(A)和直條圖(B)Fig.9 Electrophoregram(A)and histogram(B)of expressions of Wnt/β-catenin signaling pathway-related proteins in HTR-8 cells in various groups detected by Western blotting method

    3 討 論

    胎盤結(jié)構(gòu)和功能異常導(dǎo)致的胎盤組織灌注減少是PE患者胎盤組織最明顯的病理特征,而滋養(yǎng)層細(xì)胞作為胎盤組織和功能維持的主要細(xì)胞,其對胎盤 組 織 的 發(fā) 育 和 形 成 具 有 重 要 作 用[1-2]。研 究[3,6]顯示:在PE表達(dá)失調(diào)的lncRNA可通過調(diào)控滋養(yǎng)層細(xì)胞功能而參與影響PE的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果表明:過表達(dá)lncRNA GHET1可能通過Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)展和細(xì)胞侵襲,具有改善PE發(fā)生進(jìn)展的作用。

    LncRNA GHET1被認(rèn)為是胃癌特異性lncRNA之一,研究[4]顯示:lncRNA GHET1作為一種新型的致癌lncRNA,廣泛參與促進(jìn)包括胃癌、肝癌、前列腺癌和骨肉瘤等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在胃癌中,利用小干擾RNA下調(diào)腫瘤細(xì)胞中l(wèi)ncRNA GHET1表達(dá)能通過降低細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子c-Myc、cyclinD1和周期蛋白依賴性激酶2(cyclin-dependent kinase 2,CDK2)等蛋白表達(dá)水平,誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞阻滯于G1期,并抑制其增殖、遷移和侵襲能力[7-8]。在肝癌中,高表達(dá)的lncRNA GHET1能夠通過靶向調(diào)控激活轉(zhuǎn)錄因子1 mRNA和蛋白表達(dá)水平促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和EMT[9]。在骨肉瘤中,敲除lncRNA GHET1能通過下調(diào)Wnt/β-catenin信號通路減弱腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和EMT能力,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[10]。而滋養(yǎng)層細(xì)胞作為一種類似腫瘤細(xì)胞的特殊類型細(xì)胞,與腫瘤細(xì)胞具有一定程度的相似性。研究[11]表明:滋養(yǎng)層細(xì)胞的EMT能力是其對蛻膜組織及子宮侵襲的基礎(chǔ)。EMT是細(xì)胞表型的一種轉(zhuǎn)化過程,其主要表現(xiàn)為表皮細(xì)胞標(biāo)記物黏附分子E-cadherin表達(dá)降低和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物N-鈣黏蛋白(N-cadherin)和Vimentin等表達(dá)上調(diào)。在EMT過程中細(xì)胞骨架重組,細(xì)胞間黏附能力降低,細(xì)胞極性喪失[12]。在滋養(yǎng)層細(xì)胞上表現(xiàn)為E-cadherin蛋白表達(dá)水平降低和Vimentin蛋白表達(dá)水平升高,即細(xì)胞出現(xiàn)EMT轉(zhuǎn)化[13-14],其有利于胚胎成功著床和胚胎的正常形成。本研究結(jié)果顯示:PE組患者胎盤組織中l(wèi)ncRNA GHET1表達(dá)水平較正常組明顯降低,過表達(dá)lncRNA GHET1能夠明顯促進(jìn)滋養(yǎng)層HTR-8細(xì)胞侵襲和EMT能力,與LI等[15]的研究結(jié)果一致,提示lncRNA GHET1能夠促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲能力。研究[16-17]證實(shí):PE患者胎盤組織異??赡芘c滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期阻滯有關(guān)。因此,本研究進(jìn)一步探究lncRNA GHET1對滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖活性的影響,結(jié)果顯示:過表達(dá)lncRNA GHET1可通過上調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白c-Myc與cyclinD1表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展及增殖活性,與其在胃癌細(xì)胞中的作用類似[7-8]。

    Wnt/β-catenin信號通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞生存、發(fā)育、增殖及和凋亡等生物學(xué)過程的重要途徑,也是參與影響多個(gè)器官或系統(tǒng)形成的重要機(jī)制[18-19]。國內(nèi)學(xué)者李慧等[20]研究發(fā)現(xiàn):Wnt/β-catenin信號通路的失活導(dǎo)致滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲和增殖能力減弱。ZHANG等[21]研究證實(shí):與正常胎盤組織比較,PE患者胎盤組織中Wnt/β-catenin信號通路種相關(guān)蛋 白p-GSK3β、β-catenin、c-Myc和cyclinD1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯降低,提示W(wǎng)nt/β-catenin信號通路參與PE的進(jìn)展。此外,lncRNA GHET1同 樣 也能通 過Wnt/β-catenin信 號通路調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲等惡性生物學(xué)行為[10,22]。因此,本研 究檢測Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果顯示:過表達(dá)lncRNA GHET1能上調(diào)GSK3β磷酸化水平和β-catenin蛋白表達(dá)水平。

    綜上所述,lncRNA GHET1在PE患者胎盤組織中表達(dá)較正常孕產(chǎn)婦明顯下調(diào),過表達(dá)lncRNA GHET1可能通過Wnt/β-catenin信號通路來促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)展、細(xì)胞侵襲和EMT能力。

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