滋養(yǎng)層干細(xì)胞研究進(jìn)展

張居作，徐君飛，薛立群＊

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙410128；2.懷化學(xué)院生命科學(xué)系，湖南懷化418000）

滋養(yǎng)層干細(xì)胞已成為研究胎盤發(fā)育和功能的理想體外模型，但建立其連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞庫還非常困難。胎盤是所有哺乳動物胎兒賴以存活和發(fā)育的器官，在母胎之間承擔(dān)著氣體交換、營養(yǎng)廢物運輸和信息傳遞作用，同時對母體起到免疫耐受和激素分泌作用，而哺乳動物的胎盤起始于對胚胎附植、胚胎存活和胎盤發(fā)育起關(guān)鍵作用的滋養(yǎng)層干細(xì)胞［1］，滋養(yǎng)層干細(xì)胞發(fā)育異常，可導(dǎo)致胚胎自發(fā)性丟失、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、子癇前期等相關(guān)妊娠疾?。?］。滋養(yǎng)層干細(xì)胞可從胚胎滋養(yǎng)外胚層直接獲得，或通過自發(fā)分化、基因敲除和分離胚體等方式誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化，但自發(fā)分化細(xì)胞異質(zhì)性高，不易控制，基因敲除途徑只能反映出細(xì)胞分化過程中部分標(biāo)志性基因表達(dá)的變化［3］。因此，到目前為止，靈長類動物［4-6］、鼠［7-12］、豬［13-16］、牛［17］和綿羊［18-19］的滋養(yǎng)層干細(xì)胞僅能實現(xiàn)分離，培養(yǎng)體系還很不成熟，尚未獲得理想的模型，這大大阻礙了后續(xù)研究的開展。本文總結(jié)了鼠、人、家畜滋養(yǎng)層干細(xì)胞的分離方法、培養(yǎng)體系、標(biāo)志性基因等研究所取得的進(jìn)展，以期為開展滋養(yǎng)層干細(xì)胞研究提供理論基礎(chǔ)。

1 鼠滋養(yǎng)層干細(xì)胞研究

目前，在滋養(yǎng)層干細(xì)胞方面，研究最多、最成熟的是鼠滋養(yǎng)層干細(xì)胞模型和培養(yǎng)體系。Tanaka S等［7］最早利用成纖維生長因子4（fibroblast growth factor 4，F(xiàn)GF4）來維持滋養(yǎng)層干細(xì)胞的增殖和多能性，所獲得的滋養(yǎng)層干細(xì)胞能分化成各種滋養(yǎng)層細(xì)胞，傳代超過50代性狀沒有明顯改變，并推測FGFR2是最佳受體，T-box基因、mEomes基因和尾型同源盒轉(zhuǎn)錄因子2基因是FGF4信號路徑的下游靶基因。緊接著，Erlebacher A 等［8］在添加有FGF4、轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF-β）或相關(guān)因子激活素（activin）的條件培養(yǎng)基中實現(xiàn)了滋養(yǎng)層干細(xì)胞的生長、增殖和多能性維持，獲得的滋養(yǎng)層干細(xì)胞能分化成各種滋養(yǎng)層細(xì)胞，進(jìn)一步驗證了FGF4、TGF-β或activin能滿足滋養(yǎng)層干細(xì)胞的更新增殖，同時獲得了2株滋養(yǎng)層干細(xì)胞細(xì)胞系，這些細(xì)胞系表現(xiàn)出上皮樣形態(tài)，能表達(dá)滋養(yǎng)層干細(xì)胞標(biāo)記基因。至此，鼠滋養(yǎng)層干細(xì)胞的培養(yǎng)體系已經(jīng)基本形成，但由于飼養(yǎng)細(xì)胞能分泌多種不確定生長因子、不同批次血清成分和含量的波動給研究結(jié)果增加了不確定性。為此，Schorle團(tuán)隊開展了較為全面的鼠滋養(yǎng)層干細(xì)胞研究［9-11］，形成一套較為成熟的分離培養(yǎng)、標(biāo)記基因鑒定、增殖和多能性維持及定向分化體系，在 DMEM（Dulbecco＇s modified Eagle＇s medium）／F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加10種給定化學(xué)物質(zhì)，實現(xiàn)了滋養(yǎng)層干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)；同時將獲得的滋養(yǎng)層干細(xì)胞皮下注射裸鼠，誘導(dǎo)產(chǎn)生了出血性損傷，進(jìn)一步證實了所獲得的滋養(yǎng)層干細(xì)胞具備有發(fā)展成胎盤的能力。Ohinata Y等［12］對無血清培養(yǎng)基進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在DMEM／F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加 FGF2、activin A、XAV939和Y27632，可維持滋養(yǎng)層干細(xì)胞的自我更新增殖和多能性的保持，這種條件下的滋養(yǎng)層干細(xì)胞能夠表達(dá)特定的Eomes、Elf5、Cdx2、Klf5、Cdh1、Esrrb、Sox2和Tcfap2c標(biāo)記基因，在體外能誘導(dǎo)分化成滋養(yǎng)層巨細(xì)胞、海綿狀滋養(yǎng)層細(xì)胞和迷宮滋養(yǎng)層細(xì)胞。據(jù)此，鼠滋養(yǎng)層干細(xì)胞分離方法、培養(yǎng)體系較為完善，但標(biāo)志性基因研究還有待進(jìn)一步篩選和確定。

2 人滋養(yǎng)層干細(xì)胞研究

由于倫理限制，人的滋養(yǎng)層干細(xì)胞材料來源困難，原始滋養(yǎng)層細(xì)胞體外分離和長期穩(wěn)定培養(yǎng)存在一些缺陷；或從成熟胎盤分離出來的滋養(yǎng)層細(xì)胞大部分已經(jīng)定向分化，呈現(xiàn)妊娠多樣性［5-6］；或少數(shù)多能性細(xì)胞缺乏維持多能性的培養(yǎng)條件，也會很快分化，因而人滋養(yǎng)層干細(xì)胞的研究一直缺乏成熟的實驗?zāi)Ｐ?，到目前為止，對人早期滋養(yǎng)層細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)掌握很少。Genbacev O等［4］從絨毛膜直接分離滋養(yǎng)層多能干細(xì)胞，采用DMEM／F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補充10ng／mL 的 FGF，100mL／L的 FBS和10μmol／L的SB431542進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，由于缺乏合適的維持多能性的條件，極性多能細(xì)胞壽命短暫，很快分化形成多核合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞和侵襲性細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞。James J L等［5］發(fā)現(xiàn)單層絨毛細(xì)胞滋養(yǎng)層培養(yǎng)1周后死亡，錨定絨毛細(xì)胞滋養(yǎng)層能產(chǎn)生新的絨毛外滋養(yǎng)層并存活期增加至3周，但不能重新生成合胞體滋養(yǎng)層。James J等［20］對滋養(yǎng)層祖細(xì)胞進(jìn)行研究，采用DMEM／F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補充5 ng／mL的表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF），5mg／mL的胰島素，10mg／mL的轉(zhuǎn)鐵蛋白，400U／L的hCG進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，獲得了絨毛外滋養(yǎng)層祖細(xì)胞，但這些細(xì)胞是否為滋養(yǎng)層干細(xì)胞沒有被鑒定。所以，人滋養(yǎng)層干細(xì)胞研究還停留在分離方法上，培養(yǎng)體系一直難以建成。

3 家畜滋養(yǎng)層干細(xì)胞研究

因豬、牛、羊等家畜的活體采卵難度大、耗時長、花費大，單次獲得的胚胎有限，使得其滋養(yǎng)層干細(xì)胞的建系較模式動物鼠要困難。

由于豬和人有一些類似的生理機(jī)能和非常相似的免疫細(xì)胞類群，能夠高度保真的復(fù)制許多人類疾病，目前研究重癥綜合性免疫缺陷表明豬可能成為再生醫(yī)學(xué)、遺體器官移植、干細(xì)胞治療和腫瘤發(fā)生的重要模型［21］；另外，胚胎自發(fā)性丟失的重要原因是胎盤異?；蛱ケP血管形成異常［21］。因此，對豬滋養(yǎng)層干細(xì)胞研究具有重要的意義。Alberio R等［13］從10.5d～12d胚胎中收集外胚層，以DMEM／F12為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加bFGF和β-mercaptoethanol，結(jié)果表明，外胚層能夠自我更新，維持細(xì)胞多能性，表達(dá)關(guān)鍵的多能因子OCT4（或POU5F1）、NANOG、SOX2和NODAL，同時能被BMP-4誘導(dǎo)分化為滋養(yǎng)層。Ezashi T等［15］采用基因重編豬纖維母細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生干細(xì)胞，以DMEM／F12為基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加FGF2，獲得一種能自我更新的多能性滋養(yǎng)層細(xì)胞類群，但傳代后不能維持一致的表型。宋志強(qiáng)等［16］通過對6d孤雌囊胚透明帶進(jìn)行劃口，在飼養(yǎng)層和基礎(chǔ)培養(yǎng)液中附加堿性成纖維生長因子（bFGF）和人白血病抑制因子（hLIF），分離得到的細(xì)胞呈現(xiàn)上皮樣細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞間結(jié)合緊密，邊緣光滑，核質(zhì)比較大，表達(dá)滋養(yǎng)層干細(xì)胞標(biāo)記基因Cdx2，體現(xiàn)了滋養(yǎng)層干細(xì)胞特征。對豬滋養(yǎng)層干細(xì)胞的研究主要是借鑒鼠、人滋養(yǎng)層干細(xì)胞的一些研究方法和標(biāo)記基因，通過從早期胚胎外胚層或者體外培養(yǎng)的囊胚獲得研究材料，還不能實現(xiàn)連續(xù)培養(yǎng)，獲得的細(xì)胞也存在不確定性。

目前，對牛、羊滋養(yǎng)層干細(xì)胞的研究還較少。Ramos-Ibeas P等［17］結(jié)合單層培養(yǎng)系統(tǒng)，微滴表面覆蓋明膠，以鼠胚胎成纖維細(xì)胞為飼養(yǎng)細(xì)胞，以支持從活體檢查獲得胚胎中分離、建立的牛滋養(yǎng)細(xì)胞系的生長。所獲得的滋養(yǎng)細(xì)胞的傳代能力超過2年，保持多潛能性性的基因表達(dá)模式，展示出一定的自我更新能力。通過研究建成了一套通過牛的胎活體檢查獲得胚體，體外培養(yǎng)、分離出滋養(yǎng)層細(xì)胞的系統(tǒng)，這套系統(tǒng)能解決從很少數(shù)量細(xì)胞擴(kuò)增DNA研究牛胚胎基因型和表型的限制，同時建成一個能用于研究圍植入期胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞的體外模型，但不能實現(xiàn)連續(xù)培養(yǎng)，要建成細(xì)胞模型還有很多難點需要克服。劉慧等［19］經(jīng)過培養(yǎng)不同孕期的蒙古綿羊滋養(yǎng)層細(xì)胞，通過添加不同濃度血清的高糖DMEM培養(yǎng)體系獲得滋養(yǎng)層細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)多樣，呈多角形或卵圓形，核圓或呈小泡狀；細(xì)胞角蛋白呈陽性表達(dá)，波形蛋白呈陰性表達(dá)；透射電子顯微鏡觀察綿羊絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞，核較大，胞質(zhì)內(nèi)線粒體較多，有電子密度較高的脂滴，細(xì)胞表面有豐富的微絨毛，細(xì)胞間可見縫隙連接結(jié)構(gòu)，但獲得的這些滋養(yǎng)層細(xì)胞是否為干細(xì)胞沒有進(jìn)一步的鑒定。

4 小結(jié)和展望

滋養(yǎng)層干細(xì)胞來自早期胚胎，在胚胎發(fā)育的過程中分化為特定的滋養(yǎng)層細(xì)胞類型，是胎盤形成的重要組成［22-23］，這些細(xì)胞包括滋養(yǎng)層巨細(xì)胞、海綿滋養(yǎng)層細(xì)胞、糖原滋養(yǎng)層細(xì)胞和合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞。但哺乳動物胎盤類型存在差異，滋養(yǎng)層細(xì)胞類型不同，滋養(yǎng)層干細(xì)胞的獲得是開展進(jìn)一步研究的基礎(chǔ)，然而滋養(yǎng)層干細(xì)胞的獲得、培養(yǎng)方法和標(biāo)記基因的研究還處于探索階段。雖然鼠滋養(yǎng)層干細(xì)胞的研究已經(jīng)取得了突破性進(jìn)展，為其他動物滋養(yǎng)層干細(xì)胞的研究提供了借鑒，但細(xì)胞物種差異性決定了不是所有的動物都與鼠類似，因而研究需要根據(jù)動物的滋養(yǎng)層細(xì)胞的特征，發(fā)育過程和生理功能，選擇合適的時間點、維持細(xì)胞多能性的物質(zhì)和標(biāo)記基因。

培養(yǎng)體系中添加血清、生長因子，培養(yǎng)器皿包被基質(zhì)，給予飼養(yǎng)層細(xì)胞等能夠使細(xì)胞很好的存活下來。但是，血清成分的不確定性，培養(yǎng)基中是否添加血清一直存在爭議，更多的觀點支持不加血清；飼養(yǎng)細(xì)胞分泌的生長因子不確定，多數(shù)觀點建議采用纖維蛋白包被或者基質(zhì)膠包被，也有對培養(yǎng)器皿進(jìn)行處理存在不同觀點；添加的生長因子多種多樣，主要有FGF、EGF、activin A、Heparin和β-mercaptoethanol，不同研究者有不同的選擇偏好性，這些不確定性和偏好性選擇可能改變了獲得細(xì)胞的特性，可能已經(jīng)分化為終端細(xì)胞類型。

標(biāo)記基因的選擇主要由三個方面決定：是否與胎盤早期發(fā)育密切相關(guān)，基因沉默或者過表達(dá)對分化方向產(chǎn)生決定性的影響，基因的表達(dá)和表觀效應(yīng)是否作為滋養(yǎng)層干細(xì)胞干性轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)成員的角色相對應(yīng)［3］。但是在實際應(yīng)用中受到了物種、時間點選擇的影響，標(biāo)記基因的選擇也存在不確定性，對多能性標(biāo)記基因 Cdx2、Eomes、Elf5、Cdx2、Klf5、Cdh1、Esrrb、Sox2、cfap2c、CK7、CD9 、CGb、SSEA-1、合胞體蛋白2和Mamu-AG的選擇同樣也存在偏好性，是否適用于所有物種？不同物種滋養(yǎng)層干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果有差異，是觀察時機(jī)的選擇造成（是否已經(jīng)分化），還是形態(tài)學(xué)不同？這些疑問有待進(jìn)一步闡明，利用滋養(yǎng)層干細(xì)胞來研究胎盤形成和胎盤免疫屏障是必然選擇，將為解決妊娠綜合癥、子癇前期、胎兒生長受限、流產(chǎn)、死胎等問題提供理論基礎(chǔ)。

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