• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    體外建立靈長類動物滋養(yǎng)層細胞系的研究進展

    2022-07-07 04:00:48常曉青姜良霞張樸堯
    關鍵詞:滋養(yǎng)層靈長類細胞系

    常曉青,姜良霞,張樸堯,譚 韜

    (1.昆明理工大學 靈長類轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究院,非人靈長類生物醫(yī)學國家重點實驗室,云南 昆明 650500;2.云南省人口和計劃生育科學技術研究所,云南 昆明 650021;3.北京大學第三醫(yī)院婦產(chǎn)科,生殖醫(yī)學中心,生殖內(nèi)分泌與輔助生殖技術北京市重點實驗室,輔助生殖教育部重點實驗室,北京 100191)

    0 引 言

    胎盤在哺乳動物胚胎發(fā)育過程中是一個暫時性的器官,對于維持妊娠和胎兒發(fā)育至關重要[1-2].胎盤發(fā)育紊亂會導致很多妊娠相關疾病的產(chǎn)生,如:妊娠期高血壓、胎盤植入性疾病、妊娠期糖尿病和早產(chǎn)等[3-8].胎盤從囊胚期的滋養(yǎng)外胚層發(fā)育而來[9],滋養(yǎng)外胚層由滋養(yǎng)層干細胞(Trophoblast Stem Cells,TSCs)組成,TSCs是胎盤分化細胞的前體細胞,能夠分化成所有的滋養(yǎng)層細胞(Trophoblast Cell) 亞型[10].靈長類動物的滋養(yǎng)層細胞主要有三種亞型:細胞滋養(yǎng)層細胞(Cytotrophoblasts,CT)、合胞體滋養(yǎng)層細胞(Syncytiotrophoblasts,ST)和絨毛膜外細胞滋養(yǎng)層細胞(Extravillous Trophoblasts,EVT).其中ST和EVT是由CT分化而來的[11].不同的滋養(yǎng)層細胞亞型負責胎盤不同的功能:ST主要負責母體和胎兒之間的氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)和廢物交換,ST是由單核細胞融合而成的多核細胞[12],異常的細胞融合會引發(fā)一些妊娠相關疾病,如先兆子癇和胎兒發(fā)育不全[13-14].EVT主要負責母體血液的供給,EVT從絨毛的末端侵入蛻膜,重塑母體螺旋動脈,使母體血液能夠持續(xù)地供應給胎盤[15-18],較淺或較深的EVT侵襲都會導致一系列的妊娠失敗,如胎兒宮內(nèi)生長受限、反復流產(chǎn)等[19-21].非人靈長類動物及其滋養(yǎng)層細胞模型可以用來研究靈長類動物胎盤發(fā)育保守與特異性的機制,因為非人靈長類動物與人類的胎盤絨毛結構、血液屏障、滋養(yǎng)細胞侵入后螺旋動脈重塑模式以及轉(zhuǎn)化方式等都較為相似[22].而小鼠與人類胎盤的結構及功能存在較大差異:小鼠滋養(yǎng)層細胞侵襲程度較淺,而人類滋養(yǎng)層細胞的侵襲較深且較為廣泛;小鼠胎盤為迷路結構,人類胎盤為絨毛結構;小鼠子宮動脈的轉(zhuǎn)化依賴于母體因素(子宮NK細胞),而人類主要依賴于滋養(yǎng)層細胞等[23-24].

    由于滋養(yǎng)細胞在動物胎盤發(fā)育中至關重要,所以建立靈長類動物滋養(yǎng)層細胞系對靈長類動物胎盤研究具有重要意義.早在1998年就已經(jīng)成功建立了小鼠滋養(yǎng)層細胞系[25],在含有成纖維細胞生長因子4(fibroblast growth factor 4,FGF4)、NODAL信號通路相關因子、肝素(Heparin)以及胎牛血清(fetal bovine serum)的條件下,可以從小鼠囊胚中分離得到小鼠滋養(yǎng)層干細胞(mouse Trophoblast Stem Cells,mTSCs)[26].但由于小鼠和靈長類胎盤具有較大差異,所以,小鼠滋養(yǎng)層細胞系的方法不完全適用于靈長類動物滋養(yǎng)層干細胞系的建立[27],建立靈長類動物滋養(yǎng)層細胞模型有助于胎盤發(fā)育相關分子機制的研究.目前已有不同實驗室建立了不同來源的靈長類滋養(yǎng)層細胞系,本文將圍繞靈長類動物滋養(yǎng)層細胞系的建立、研究進展以及滋養(yǎng)層細胞系的應用進行綜述.

    1 組織來源的靈長類滋養(yǎng)層細胞

    1.1 絨毛膜癌來源的滋養(yǎng)層細胞系

    1968年,Hertz[28]從人類絨毛膜癌中分離得到了可以連續(xù)傳代的滋養(yǎng)層BeWo細胞系,這是第一個可以在培養(yǎng)過程中合成激素的人類細胞系.1969年,Kochler等人[29]將BeWo細胞經(jīng)過連續(xù)傳代,得到了可以產(chǎn)生人類絨毛膜促性腺激素(hCG)、人絨毛膜生長素(HCS)和孕酮(progesterone)的JEG細胞系,后續(xù)也獲得了其他人類絨毛膜癌細胞系,如JAR、ACH-3P 和AC1-M59等細胞系[30-31].絨毛膜癌細胞系有妊娠早期胎盤滋養(yǎng)層細胞的許多結構和功能特征,目前已被廣泛用于胎盤體外模型研究[32-34]:BeWo細胞系是目前應用最廣泛的絨毛滋養(yǎng)層融合細胞培養(yǎng)模型[35],可以通過添加毛喉素(Forskolin,cAMP的激活劑)來促進BeWo細胞融合[36],處理后的細胞會表達參與滋養(yǎng)細胞融合的膠質(zhì)細胞缺失因子1(Glial Cell Missing 1,GCM_1)[37];JEG和JAR細胞系經(jīng)常作為研究絨毛膜癌的細胞模型[38-39].上述細胞系容易在體外進行培養(yǎng)和操作,但它們來源于惡性腫瘤,與正常的滋養(yǎng)層細胞有一定區(qū)別,并且部分細胞系長時間傳代后不能用于模仿體內(nèi)滋養(yǎng)層細胞狀態(tài).

    1.2 胎盤直接分離滋養(yǎng)層細胞及其轉(zhuǎn)化細胞系

    1986年,Kliman等人從人足月胎盤中直接分離得到了可在體外培養(yǎng)的單核滋養(yǎng)層細胞,之后Orendi等人[40]使用Percoll梯度法,從妊娠早期胎盤及其絨毛膜組織中分離得到了純度更高的CT (純度達80%),施瓊等人[41]使用組織塊培養(yǎng)法,也得到了同樣純度的CT.Petroff等人[42]和Serjilus等人[43]使用磁珠和流式分選方法進一步提純細胞,從胎盤中分離得到了純度大于97%的CT.直接從胎盤組織分離得到的滋養(yǎng)層細胞系為單核細胞,它們具有成熟及未成熟滋養(yǎng)層細胞的多種結構特征,如:細胞表達KRT7(也稱為CK7)、TEAD4、HAND1、ELF5等滋養(yǎng)層細胞標志物和上皮細胞的標志物E-鈣黏蛋白(E-Cadherin),不表達波形蛋白(vimentin)[44-45],一些單核滋養(yǎng)層細胞會表達分化的ST標志物:hCG、人胎盤催乳素(Human Placental Lactogen,HPL)和妊娠特異性β1糖蛋白(Pregnancy-specific β1-glycoprotein,SP1),并且會通過單核滋養(yǎng)層細胞的融合形成合胞體細胞[46].但是這些直接從胎盤組織分離而來的細胞生命周期短,難以穩(wěn)定建系,并會自發(fā)地融合,不利于對其進行長期研究.

    使用含有SV40大T抗原(simian virus 40 large T antigen)慢病毒的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染從人早期妊娠胎盤中分離的滋養(yǎng)層細胞,可以得到生命周期更長的滋養(yǎng)層轉(zhuǎn)化細胞系HTR-8/SVneo[47]和SGHPL[48].HTR-8/SVneo細胞系表達CK8和CK18,并分泌hCG.SGHPL細胞系則與絨毛外滋養(yǎng)層最為相似,具有原代絨毛膜滋養(yǎng)層細胞系的多種特征:表達KRT7、CD9和HLA-G并分泌hPL[49].HTR-8/SVneo和SGHPL細胞系可以作為體外細胞模型,用于研究早期妊娠期胞外滋養(yǎng)細胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,是目前研究胞外滋養(yǎng)層細胞侵襲、遷移和增殖最常用的細胞系[50-51].HTR-8/SVneo和SGHPL滋養(yǎng)層轉(zhuǎn)化細胞系是滋養(yǎng)層細胞來源的,但兩者都為轉(zhuǎn)化狀態(tài),僅有滋養(yǎng)層細胞的部分特征,如:HTR-8/SVneo細胞系高表達波形蛋白,但不表達KRT7和E-Cadherin[52];HTR-8/ SVneo細胞系包含上皮細胞和間充質(zhì)樣細胞,是一類混合細胞群體[53];SGHPL細胞系的壽命有限(20~25代),所以,滋養(yǎng)層細胞的研究仍然存在一定障礙.

    2 靈長類胚胎干細胞誘導來源的滋養(yǎng)層細胞系

    2.1 BMP4誘導靈長類胚胎干細胞向滋養(yǎng)層細胞分化

    胚胎干細胞(Embryonic Stem Cells,ESCs)具有多能性并且能夠分化為機體所有的細胞類型[54].很多研究者都在研究ESCs向滋養(yǎng)層細胞的誘導分化,其中最常見的方法是使用BMP4(Bone Morphogenetic Protein 4)進行誘導.Xu等人[55]分別將1、10和100 ng/mL的BMP4加入到不同的人類胚胎干細胞(human Embryonic Stem Cells,hESCs)系:H1,H7,H9和H14中,可以誘導hESCs發(fā)生劑量依賴性的形態(tài)學改變,出現(xiàn)了體積增大并且形態(tài)扁平的細胞,與滋養(yǎng)細胞或胎盤發(fā)育相關的基因編碼轉(zhuǎn)錄因子TFAP2、MSX2、SSI3、GATA2和GATA3在經(jīng)過BMP4處理后的細胞中都顯著上調(diào),滋養(yǎng)層標志物如CGA、CGB、MMP9、KRT7、GCM1、HLA-G1和CD9的表達增強,且多能性相關的基因均顯著下調(diào).細胞上清液中hCG、雌二醇(estradiol)和孕酮的含量明顯升高[55].BMP4的處理時間及使用濃度在不同的研究中具有較大的差異[56].但該方法誘導細胞系的增殖能力有限,表明它們的長期增殖還需要其他的因子的調(diào)節(jié)[55].并且BMP4不能特異性誘導滋養(yǎng)層譜系的分化,處理的hESCs會同時表達中胚層和內(nèi)胚層標志物[57].

    2.2 Activin/Nodal、FGF和BMP信號共同誘導靈長類胚胎干細胞向滋養(yǎng)層細胞分化

    Activin/Nodal和BMP信號可以調(diào)節(jié)早期hESCs譜系分離,當抑制Activin/Nodal、激活BMP信號時,hESCs可以向滋養(yǎng)層細胞的分化.在培養(yǎng)基中添加BMP4和Activin/Nodal的抑制劑SB431542培養(yǎng)hESCs后,細胞會向滋養(yǎng)層方向分化,具有滋養(yǎng)層細胞的形態(tài)和部分標志物的表達[58-59].存在BMP4、添加ActivinA/Nodal的抑制劑SB431542/A83-01和FGF2的抑制劑PD173074時,可以進一步加速hESCs向滋養(yǎng)層細胞的分化.分化的細胞具有部分滋養(yǎng)層細胞的特征:表達KRT7和HLA-G,一些細胞瞬時表達CDX2;中胚層標志物表達減少;細胞具有遷移能力;隨著分化時間的增加,培養(yǎng)基中會產(chǎn)生大量的hCG、孕酮、胎盤生長因子(placental growth factor)和HPL[60],證明了得到的細胞為滋養(yǎng)層細胞樣細胞.

    但是關于使用BMP4誘導hESCs向滋養(yǎng)層細胞樣細胞分化體系還存在一些爭議,如:在相同的培養(yǎng)條件下,Bernardo等人[57]只有4%~8%的細胞表達KRT7,而 Roberts等人[61]幾乎所有的細胞都表達KRT7;BMP4誘導的hESCs類似于胚外中胚層;ELF5的啟動子在hESCs分化的滋養(yǎng)層細胞樣細胞中不能模擬TSCs的低甲基狀態(tài)[61-62].因為滋養(yǎng)層細胞系的定義不清晰,所以Lee等人[63]在2016年使用人類早期胎盤的原代培養(yǎng)細胞定義了滋養(yǎng)層細胞系的4個標準:(1)HLA-I (human leukocyte antigen class I)的特殊表達:TS和ST不表達HLA-I,EVT表達HLA-C、E和G;(2)使用KRT7作為廣譜TS細胞的標志物,TFAP2C和GATA3作為單核TS細胞的標志物;(3)ELF5啟動子低甲基化;(4)C19MC miRNAs的高表達[63].通過抑制ActivinA/Nodal和FGF2,添加BMP4來誘導hESCs分化的滋養(yǎng)層細胞樣細胞并不完全符合以上4個標準,所以hESCs雖然可以分化為具備部分滋養(yǎng)層細胞特征的細胞,但相關研究還需要進一步探索.

    2.3 靈長類na?ve胚胎干細胞向滋養(yǎng)層細胞的分化

    小鼠ESCs可劃分為na?ve和primed兩種狀態(tài).Na?ve狀態(tài)的ESCs具有與胚胎植入前上胚層(epiblast,EPI)細胞相似的特征,而primed狀態(tài)的ESCs則與胚胎植入后的EPI類似,目前已經(jīng)獲得了具有na?ve狀態(tài)的靈長類ESCs[64-65].最近有研究證明可以將na?ve hESCs轉(zhuǎn)化為人類滋養(yǎng)層干細胞(hTSCs):Guo等人[66]通過抑制ERK/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和Nodal信號通路,可以高效地將na?ve hESCs轉(zhuǎn)化為hTSCs,該hTSCs表達胎盤TSCs相關的標志物:KRT7、ITGA6、HAVCR1和GATA3等,還可將其誘導為CGB+/SDC+ST以及HLA-G+EVT.而primed hESCs則失去了該潛能,僅會向羊膜方向分化.Io等人[67]也得到了相似的研究結果.Cinkornpumin等人[68]使用Okae等人[69]的hTSCs培養(yǎng)條件(下一部分詳述)可將na?ve hESCs轉(zhuǎn)化為hTSCs,使用該方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)分化-hTSCs(transdifferentiated-hTSCs)表達胎盤核心基因,并且能夠向EVT和ST分化.Dong等人[70]也在與Cinkornpumin等人相同的培養(yǎng)條件下得到了同樣的結果,其轉(zhuǎn)錄組(scRNA-seq)和染色質(zhì)可及性(ATAC-seq)分析表明,來自na?ve的hTSCs與來自囊胚的hTSCs相似,具有植入后滋養(yǎng)層的特征.以上結果證實了na?ve hESCs可以向滋養(yǎng)層細胞進行分化.

    3 靈長類胚胎來源的滋養(yǎng)層干細胞系

    3.1 人類滋養(yǎng)層干細胞系

    上述絨毛膜癌來源和部分hESCs來源的人類滋養(yǎng)層細胞系并未完全符合Lee的4個標準,不能視為真正hTSCs.Genbacev等人[71]從妊娠早期絨毛膜上分離出人類滋養(yǎng)層祖細胞系TPBCs,該細胞系表達OCT4、KRT7和GATA4,使用Matrigel誘導分化,會導致OCT4表達下調(diào),并誘導ST和EVT標志物的表達.但最近的研究發(fā)現(xiàn),這些細胞主要向EVT方向分化,這表明它們更類似于EVT前體細胞,而不是真正的hTSCs.隨后,Zdravkovic等人[72]從8細胞期的人類胚胎中獲得了類似hTSCs的UCSFB6細胞系.在含有bFGF、FCS和SB431542的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后,UCSFB6細胞表達滋養(yǎng)層細胞譜系轉(zhuǎn)錄因子TEAD4、CDX2、Gminin、GATA3、ELF5、EBES、GCM1和β-catenin,可以傳代數(shù)10次并維持未分化狀態(tài).UCSFB6細胞在存在Matrigel的條件下,可被誘導為表達KRT7、Integrinα1、HLA-G、VE-cadherin和VCAM1,并具有侵襲性的EVT,也可以將UCSFB6細胞誘導為表達hCG和人胎盤催乳素(CSH1)的多核ST.雖然UCSFB6細胞系表達滋養(yǎng)層標志物,但其尚未被鑒定是否完全符合Lee提出的4個標準.

    2018年Okae等人[69]建立了包括TSCT和TSblast的hTSCs.Okae使用從妊娠早期胎盤分離出的CT、EVT和ST進行單細胞轉(zhuǎn)錄組分析,發(fā)現(xiàn)與WNT(Wingless/Integrated)和EGF(epithelial growth factor)信號轉(zhuǎn)導途徑相關的基因在CT中表達升高.WNT和EGF是各種上皮干細胞增殖所必需的,包括皮膚干細胞和腸干細胞[73],Okae發(fā)現(xiàn)在含有CHIR99021(WNT激活劑)、EGF、VPA(HDAC抑制劑)、Y27632(ROCK抑制劑)、TGF-β抑制劑:A83-01和SB431542的培養(yǎng)基中可以長期培養(yǎng)CT.這些具有增殖能力的CT核型正常,能夠正常增殖至少5個月,表達滋養(yǎng)層標志物KRT7、GATA3、TFAP2C和TEAD4,并且HLA-ABC表達較弱,這些CT被命名為TSCT[69].在添加了Matrigel、NRG-1和A83-01的培養(yǎng)基中,TSCT會經(jīng)歷上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT),形成HLA-G+ EVT樣細胞.添加Forskolin的TSCT會融合形成合胞體,表達ST的標志物,在多次傳代后仍維持上述功能.Okae使用相同的培養(yǎng)條件也可從人類囊胚中得到TSblast細胞,與TSCT具有相似的特征.轉(zhuǎn)錄組和DNA甲基化譜分析顯示TSblast和TSCT與CT類似.此外,小鼠TS細胞自我更新所需的轉(zhuǎn)錄因子CDX2、ESRRB和SOX2在人類CT、TSCT和TSblast細胞中的表達較低.TSblast和TSCT細胞中的ELF5的啟動子都為低甲基化,并且C19MC miRNAs在CT、TSCT和TSblast細胞中高表達[69,74].因此Okae等人建立的TSCT和TSblast細胞符合Lee的4個金標準,證明了TSCT和TSblast細胞是hTSCs.

    3.2 非人靈長類動物滋養(yǎng)層干細胞系

    非人靈長類動物與人類親緣關系相對較近,成熟的非人靈長類動物與人類胎盤的形態(tài)、免疫能力和胎盤侵襲行為等都較為相似,在某些情況下,可將人源化的抗體應用于非人靈長類動物的胎盤研究[75].所以,非人類靈長類動物是研究人類胎盤的極好模型,非人靈長類動物滋養(yǎng)細胞干細胞(Non-human primates TSCs)可以作為未來評估靈長類滋養(yǎng)細胞發(fā)育和功能的體外平臺.2007年,Vandevoort等人[76]從恒河猴囊胚中首次分離出具有滋養(yǎng)層干細胞特征的細胞.將恒河猴囊胚除去透明帶后在恒河猴胚胎成纖維細胞(REF)飼養(yǎng)層或無飼養(yǎng)層及生長因子(僅有人類胎盤膠原包被)條件下均可穩(wěn)定傳代培養(yǎng).該細胞系表達KRT7、CD9、CGB和SSEA1滋養(yǎng)層細胞特征,不表達CDX2,同時會表現(xiàn)出類似于EVT的侵襲行為,但在長期培養(yǎng)或β-雌二醇存在下,細胞會形成合胞體樣結構.細胞中還檢測到合胞素-2((Syncytin-2)和非經(jīng)典組織相容性抗原MAMU-AG的表達.合胞素-2在滋養(yǎng)層細胞融合中發(fā)揮作用,MAMU-AG為非人類靈長類MHC I類基因[77].雖然該恒河猴細胞系可以分化為多核細胞和侵襲細胞,但它們也表達ICM/ESCs的標志物OCT4以及STB的標志物絨毛膜促性腺激素(CG),并且未對該細胞系進行誘導分化,因此研究者不能確定這些細胞是否是真正的非人靈長類TSCs.

    2020年Schmidt等人[78]和Matsumoto等人[79]分別使用不同的方法得到非人靈長類滋養(yǎng)層干細胞系.Schmidt等人[78]通過分離孕早期和孕中期胎盤絨毛狀細胞滋養(yǎng)細胞,使用hTSCs培養(yǎng)基(Okae等人的培養(yǎng)條件)培養(yǎng),獲得了恒河猴TSCs系,該細胞系可以穩(wěn)定增殖.表達KRT7、GATA3、TEAD4、Tfap2c和TP63,并且可分化為恒河猴ST和EVT細胞.經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)恒河猴TSCs與同樣從早期胎盤發(fā)育而來的hTSCs相似,包括滋養(yǎng)層轉(zhuǎn)錄因子和C19MC miRNAs的表達以及ELF5啟動子DNA低甲基化.恒河猴TSCs來源的ST和EVT表現(xiàn)出滋養(yǎng)層細胞特有的分化標志,如ST細胞的CG分泌增加、CGA、CGB的表達,EVT細胞表達Mamu-AG和侵襲性相關的基質(zhì)金屬蛋白酶基因(MMP2).這表明了hTSCs培養(yǎng)條件可以用于恒河猴TSCs培養(yǎng)和體外分化.Tanaka等人[25]使用AFHBY培養(yǎng)基(含Activin A、FGF4、肝素、BMS493和Y27632),從食蟹猴囊胚中建立了食蟹猴TSCs細胞系(macTSCs).macTSCs表達KRT7、GATA3、Tfap2c、VGLL1和HAND1,具有滋養(yǎng)細胞DNA甲基化狀態(tài)(ELF5啟動子低甲基化),以及C19MC miRNAs的特異性表達.macTSCs還具有向ST和EVT分化的能力:使用dbcAMP誘導macTSCs向ST和EVT分化,分化的細胞會形成多核細胞ST,表達ST細胞的標志物GCM1、CGA和CGB,并分泌孕酮;也會出現(xiàn)侵襲性EVT樣細胞,其MMP2和Mafa-AG蛋白的水平表達增加.在異種嵌合體實驗中,macTSCs促進了嵌合囊胚中滋養(yǎng)外胚層(TE)的發(fā)育.FGF4信號對維持并促進小鼠TSCs的增殖是必不可少的,在Tanaka的這項研究中,F(xiàn)GF4也促進了macTSCs的增殖,這是第一個被FGF4促進增殖的靈長類滋養(yǎng)層細胞系.因為非人靈長類與人類胎盤的結構較為相似,所以非人靈長類滋養(yǎng)層干細胞系的建立可以為分析人類與非人類靈長類動物胎盤發(fā)育的異同提供有價值的體外培養(yǎng)模型.

    4 體細胞重編程來源滋養(yǎng)層干細胞系

    研究者們希望能夠從高度分化的體細胞中建立TSCs,從而得到在基因上與患者匹配的TSCs.在最近的2項研究中,Servick[80]和Liu等人[81]發(fā)現(xiàn)OSKM(OCT4,SOX2,KLF4,c-MYC)重編程系統(tǒng)并不局限于胚胎譜系的生成,在該過程中還存在一個滋養(yǎng)層分支,可以形成滋養(yǎng)層譜系.因此,他們將成人皮膚細胞轉(zhuǎn)化為誘導TSCs(hiTSCs),該hiTSCs能夠穩(wěn)定增殖到50代以上.使用原代CT與hiTSCs進行全面的對比發(fā)現(xiàn):(1)hiTSCs表達單核滋養(yǎng)細胞的關鍵基因標志物,并且可以分化為EVT和ST;(2)hiTSCs和hTSCs分化的EVT、ST與原代相同類型細胞的轉(zhuǎn)錄譜相似;(3)與成纖維細胞和iPS細胞相比,hiTSCs還具有C19MC miRNAs的高表達;(4)觀察到在hiTSCs中ELF5基因的啟動子和假定增強子區(qū)域有特異的開放染色質(zhì)可及性,與之前的低甲基化狀態(tài)結果一致;(5)hiTSCs還具有體內(nèi)分化的潛能[81].

    以上不同方法得到的hTSCs具體對應的是胚胎發(fā)育的哪個階段的滋養(yǎng)層譜系仍未知,所以Petropoulos等人[82]和Zhou等人[83]將hTSCs的轉(zhuǎn)錄本與人類圍著床期胚胎的單細胞RNA測序數(shù)據(jù)進行了比較分析.轉(zhuǎn)錄譜比較發(fā)現(xiàn):hTSCs與植入后第8~10d胚胎中的滋養(yǎng)層細胞相似,表達LRP2和NR2F2,但不表達CDX2和EVT、ST的標志物;源自hTSCs分化的ST和EVT與胚胎中發(fā)現(xiàn)的ST和EVT具有相似的表達譜[84].Mischler等人[85]最近也獲得了CDX2+ hTSCs,但是這些細胞還未與人類CT進行比較,尚不明確這些細胞具體對應胚胎滋養(yǎng)層發(fā)育的哪一個階段.成體細胞來源的滋養(yǎng)層干細胞系為獲得患者來源的細胞系提供了可能,也進一步擴展了滋養(yǎng)層干細胞系的基礎研究和臨床應用的可能.

    5 滋養(yǎng)層細胞系的應用

    5.1 滋養(yǎng)層細胞的嵌合體模型

    嵌合體實驗是評估干細胞功能的金標準,該方法可以在正常發(fā)育組織的背景下測試供體干細胞譜系發(fā)育的潛能[86].小鼠ESCs的嵌合體實驗表明:小鼠ESCs可以參與小鼠嵌合體胚胎部分譜系的發(fā)育,卻從未參與滋養(yǎng)層譜系的發(fā)育[87].Oda等人[88]將熒光標記的小鼠TSCs注射到囊胚后,發(fā)現(xiàn)小鼠TSCs對所有滋養(yǎng)層都有一定的嵌合,但對胚胎組織部分沒有嵌合.Rielland等人[89]的研究結果也證明即使經(jīng)過多次傳代,小鼠TSCs仍能嵌合到胎盤和頂葉卵黃囊(parietal yolk sac)的滋養(yǎng)層.以上結果表明小鼠TSCs具有作為干細胞的發(fā)育潛力.在非人靈長類滋養(yǎng)層干細胞的嵌合體實驗中,也得到了類似的結果:Tanaka等人[25]將GFP-macTSCs注射到小鼠8細胞期的胚胎中并進行體外培養(yǎng)至囊胚時期.GFP-macTSCs參與了30%~40%的小鼠嵌合體胚胎體外發(fā)育,所有GFP-macTSC細胞均嵌合到滋養(yǎng)層部分,并不嵌合到內(nèi)細胞團.但人類嵌合體研究涉及到動物福利、供體細胞來源、宿主物種等倫理問題[90],不能和小鼠TSCs采用同樣的方式進行人類TSCs的嵌合體研究,所以研究者們便從“類器官”方向?qū)θ祟怲SCs的潛能進行進一步的研究.

    5.2 胎盤滋養(yǎng)層細胞類器官組織模型

    近年來,隨著“微型器官”或“類器官”的發(fā)展以及“器官芯片”的建立,3D培養(yǎng)系統(tǒng)取得了迅速的進展,3D組織培養(yǎng)比2D組織培養(yǎng)的體內(nèi)生理環(huán)境條件更相似[91].胎盤研究領域也建立了許多胎盤“類器官”的模型.有研究者使用hTSCs建立了可以自我復制的胎盤類器官模型.Turco等人[92]和Sheridan等人[93]從妊娠早期胎盤組織中純化了細胞滋養(yǎng)層細胞,建立了一種可以長期培養(yǎng)并遺傳穩(wěn)定的胎盤滋養(yǎng)層類器官組織,該類器官組織能夠分化成ST和EVT,形成絨毛狀結構,具有滋養(yǎng)層細胞特征的4個標準,能夠檢測到胎盤特異性激素的分泌,并且與正常妊娠早期胎盤的甲基化水平類似.Haider等人[94]也建立了類似的滋養(yǎng)層類器官模型:他們同樣使用妊娠早期(6到7周)的胎盤,獲得了具有增殖能力的滋養(yǎng)層類器官.這些滋養(yǎng)層類器官結構的外層表達hTSCs的標志物,并且會自發(fā)地向結構中心進行細胞融合,從而產(chǎn)生能分泌hCG的ST.全基因組表達譜顯示,該胎盤滋養(yǎng)層類器官與新分離的CT以及通過2D體外分化產(chǎn)生的ST相似.胎盤滋養(yǎng)層細胞類器官的三維結構可以部分模擬體內(nèi)細胞分化和腔隙形成的生理過程[94].它們共同存在的問題是胎盤滋養(yǎng)層細胞類器官組織模型結構的ST都在內(nèi)部,但在正常發(fā)育的胎盤中,ST在細胞滋養(yǎng)層的外部.后續(xù)研究可能需要進一步優(yōu)化滋養(yǎng)層細胞自我更新、特化和分化的培養(yǎng)條件.

    最近還開發(fā)了幾種細胞與生物材料3D共培養(yǎng)的方法來研究滋養(yǎng)細胞功能的模型.Nishiguchi等人[95]首次提出了人類滋養(yǎng)細胞的血管化胎盤屏障模型,該模型在人類滋養(yǎng)層細胞(Human pCTB or BeWo cells)上使用了膠原和層粘連蛋白納米膜,以模擬基底膜、支持細胞及粘附功能.其細胞之間的通訊連接正常,包括縫隙連接的形成.研究者可以將培養(yǎng)區(qū)域劃分成多個片段,以研究不同細胞類型之間的相互作用.該模型與妊娠早期人類胎盤的結構及對氧氣的反應能力存在相似性,初步證明了滋養(yǎng)細胞和內(nèi)皮細胞之間存在相互作用.該模型還可以用來闡明細胞信號跨越屏障的機制.Kreuder等人[96]則優(yōu)化了上述模型,建立了一種新的無濾膜屏障模型.使用BeWo細胞系與生物膜內(nèi)的原代胎盤成纖維細胞和原代人胎盤內(nèi)皮細胞(代表人胎盤絨毛的三種細胞成分)共培養(yǎng).在生物膜上共培養(yǎng)兩周后,所有細胞類型均保持其細胞類型特異性標志物的表達.Nichol等人[97]使用3D生物的打印Gel-MA,還開發(fā)了一種基于細胞、生長因子和趨化因子,在充滿水凝膠的同心環(huán)中進行滋養(yǎng)層細胞侵襲的分析方法.該模型具有可以控制其幾何形狀、力學性能、細胞活力、形態(tài)以及密度等優(yōu)點.不僅能夠測量滋養(yǎng)層細胞的侵襲程度,而且能夠分析侵襲過程中細胞與細胞的相互作用.Blundell等人[98]則建立了一個多層微流體系統(tǒng),使人類滋養(yǎng)層細胞和人類胎兒內(nèi)皮細胞能夠與生理上相似的空間排列進行共培養(yǎng),以模擬人類胎盤屏障的結構,具有部分人類胎盤的生理特征.以上幾種3D胎盤研究模型都使用絨毛膜癌滋養(yǎng)層細胞作為類器官模型的材料,但因為絨毛膜癌滋養(yǎng)層細胞是惡性起源,并不能完全反映滋養(yǎng)層細胞生理方面情況,所以胎盤類器官模型仍需改進.

    目前研究者們利用不同方法建立了在特定培養(yǎng)條件下生長和分化的胎盤“類器官”模型,這些模型可以用于研究細胞通訊及其對胎盤功能的影響,顯著促進了人們對胎盤結構和功能的理解.因此胎盤“類器官”模型將為人類胎盤疾病的研究提供有力的平臺.

    6 總結與展望

    人們對胎盤及胎盤疾病了解甚少,主要原因是缺乏穩(wěn)定的細胞模型進行胎盤相關疾病的病因和預防治療研究.靈長類動物滋養(yǎng)層細胞系的建立為靈長類動物胎盤研究提供了一個很好的平臺,體細胞來源的滋養(yǎng)層干細胞系使胎盤疾病、調(diào)控胎盤發(fā)育的相關機制研究更為便捷.靈長類動物滋養(yǎng)層干細胞模型將幫助我們了解人類滋養(yǎng)細胞缺陷發(fā)育障礙的疾病機制,例如反復流產(chǎn)、先兆子癇和子宮內(nèi)生長受限等.除此之外,靈長類動物滋養(yǎng)層干細胞系還可以為胚胎領域提供幫助,如:類胚體研究是目前胚胎研究的一個熱門方向,同一來源誘導的滋養(yǎng)層干細胞和胚胎干細胞可以為類胚體的研究提供更好的細胞模型.但目前研究者們只得到了類似于植入后第8~10 d 胚胎中的滋養(yǎng)層細胞系,還需要優(yōu)化培養(yǎng)方案以得到更早期的細胞系.總之,該研究領域需要進行更多、更深入的研究.

    猜你喜歡
    滋養(yǎng)層靈長類細胞系
    微小miR-184在調(diào)控女性滋養(yǎng)層細胞凋亡中的作用及其分子機制探究
    靈長類生物醫(yī)學前沿探索中的倫理思考
    科學與社會(2021年4期)2022-01-19 03:29:50
    Kisspeptin對早期胎盤滋養(yǎng)層細胞的調(diào)節(jié)作用
    中國靈長類動物一覽表
    森林與人類(2016年7期)2016-08-11 07:08:02
    為什么人們都說猴子聰明?
    STAT3對人肝內(nèi)膽管癌細胞系增殖與凋亡的影響
    抑制miR-31表達對胰腺癌Panc-1細胞系遷移和侵襲的影響及可能機制
    滋養(yǎng)層干細胞研究進展
    E3泛素連接酶對卵巢癌細胞系SKOV3/DDP順鉑耐藥性的影響
    兔妊娠早中期滋養(yǎng)層細胞侵潤的觀察研究
    色老头精品视频在线观看| 午夜成年电影在线免费观看| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 国产高清videossex| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 亚洲国产精品久久男人天堂| 午夜福利免费观看在线| 精品国产亚洲在线| 成人精品一区二区免费| 麻豆国产av国片精品| 亚洲无线在线观看| 999久久久精品免费观看国产| 亚洲国产欧美网| 99精品欧美一区二区三区四区| 黄色 视频免费看| 黑人操中国人逼视频| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 亚洲七黄色美女视频| 国产精品免费一区二区三区在线| 波多野结衣高清无吗| 老司机在亚洲福利影院| 黄色丝袜av网址大全| 精品免费久久久久久久清纯| 国产主播在线观看一区二区| 乱人伦中国视频| 9热在线视频观看99| 老司机福利观看| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 国产精品九九99| 国产精品影院久久| 757午夜福利合集在线观看| 好男人在线观看高清免费视频 | 在线播放国产精品三级| 中亚洲国语对白在线视频| 国产精品二区激情视频| 男人舔女人下体高潮全视频| 久久国产亚洲av麻豆专区| 亚洲一区高清亚洲精品| av网站免费在线观看视频| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 最新在线观看一区二区三区| 国产成人精品久久二区二区91| 日本精品一区二区三区蜜桃| 婷婷精品国产亚洲av在线| 一边摸一边做爽爽视频免费| 级片在线观看| 又大又爽又粗| 国产成年人精品一区二区| 亚洲精品一区av在线观看| 亚洲最大成人中文| 国产精品 欧美亚洲| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 午夜福利18| 老司机在亚洲福利影院| 多毛熟女@视频| 丝袜美腿诱惑在线| 国产精品久久久人人做人人爽| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | www日本在线高清视频| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 午夜福利成人在线免费观看| 亚洲av第一区精品v没综合| 99精品欧美一区二区三区四区| 美女免费视频网站| 黄色成人免费大全| 国产精品野战在线观看| 久久草成人影院| 99香蕉大伊视频| 免费观看人在逋| 久久人人精品亚洲av| 麻豆成人av在线观看| 国产成人av激情在线播放| 性欧美人与动物交配| 黄频高清免费视频| 91麻豆精品激情在线观看国产| 亚洲专区国产一区二区| 中文字幕高清在线视频| 免费看十八禁软件| 久久久水蜜桃国产精品网| 精品久久久久久,| 不卡一级毛片| 欧美日韩黄片免| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 色av中文字幕| 欧美乱妇无乱码| 亚洲性夜色夜夜综合| 91字幕亚洲| 亚洲成人久久性| 禁无遮挡网站| 国产成人精品无人区| 搡老妇女老女人老熟妇| 又紧又爽又黄一区二区| 操出白浆在线播放| 午夜精品久久久久久毛片777| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 成在线人永久免费视频| 成人亚洲精品一区在线观看| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 视频在线观看一区二区三区| 久久精品国产亚洲av高清一级| 淫秽高清视频在线观看| 丁香欧美五月| 午夜福利高清视频| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 一级a爱视频在线免费观看| 韩国av一区二区三区四区| 久久久久久久久中文| 91老司机精品| 欧美另类亚洲清纯唯美| 精品欧美一区二区三区在线| 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲五月天丁香| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 亚洲,欧美精品.| 人人妻人人澡欧美一区二区 | 男女下面进入的视频免费午夜 | 色综合婷婷激情| 国产高清videossex| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲一区高清亚洲精品| 在线观看免费日韩欧美大片| 一夜夜www| 老汉色av国产亚洲站长工具| 一a级毛片在线观看| 成年版毛片免费区| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 久久 成人 亚洲| 日韩欧美在线二视频| 精品欧美一区二区三区在线| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 日韩av在线大香蕉| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 国产三级在线视频| 欧美+亚洲+日韩+国产| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 看片在线看免费视频| 天堂影院成人在线观看| 亚洲国产精品久久男人天堂| 两个人看的免费小视频| 中出人妻视频一区二区| 三级毛片av免费| 久久亚洲真实| 国产午夜精品久久久久久| 91麻豆精品激情在线观看国产| 亚洲少妇的诱惑av| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 久久香蕉精品热| 亚洲中文字幕日韩| 久热爱精品视频在线9| 少妇熟女aⅴ在线视频| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 亚洲av片天天在线观看| 国产1区2区3区精品| 老司机午夜十八禁免费视频| 午夜福利在线观看吧| 一夜夜www| 久久久水蜜桃国产精品网| 欧美日本中文国产一区发布| 久久久精品欧美日韩精品| 国产精品一区二区三区四区久久 | 黄片大片在线免费观看| 亚洲av熟女| 母亲3免费完整高清在线观看| 一个人免费在线观看的高清视频| 18禁国产床啪视频网站| 日韩欧美一区视频在线观看| 精品国产美女av久久久久小说| 亚洲成人精品中文字幕电影| 国产又爽黄色视频| 乱人伦中国视频| 日韩精品青青久久久久久| 欧美日韩精品网址| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 精品久久久久久久人妻蜜臀av | av欧美777| 亚洲成人免费电影在线观看| 色播在线永久视频| 91精品国产国语对白视频| 桃色一区二区三区在线观看| 日本 欧美在线| а√天堂www在线а√下载| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 免费搜索国产男女视频| 男女下面插进去视频免费观看| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 757午夜福利合集在线观看| 精品卡一卡二卡四卡免费| 韩国av一区二区三区四区| 国产精品 欧美亚洲| 中文字幕色久视频| 极品人妻少妇av视频| 两人在一起打扑克的视频| 女人被狂操c到高潮| 三级毛片av免费| 国产欧美日韩一区二区精品| 亚洲七黄色美女视频| 国产伦人伦偷精品视频| 精品久久久久久久毛片微露脸| 99精品欧美一区二区三区四区| 国产精品久久久av美女十八| 亚洲少妇的诱惑av| 999久久久精品免费观看国产| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 中文字幕精品免费在线观看视频| 欧美精品啪啪一区二区三区| 精品久久久精品久久久| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 性欧美人与动物交配| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 最近最新中文字幕大全免费视频| 天堂动漫精品| 美女午夜性视频免费| 欧美日本亚洲视频在线播放| 美女免费视频网站| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 少妇的丰满在线观看| 国产国语露脸激情在线看| 精品一区二区三区四区五区乱码| 女人精品久久久久毛片| 欧美色欧美亚洲另类二区 | 女同久久另类99精品国产91| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 999久久久国产精品视频| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 999久久久国产精品视频| 手机成人av网站| 一区二区三区激情视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 搡老岳熟女国产| 精品国产一区二区三区四区第35| 国产一区在线观看成人免费| 国产免费av片在线观看野外av| 国产三级黄色录像| 91精品三级在线观看| 变态另类丝袜制服| 国产精品av久久久久免费| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 啦啦啦 在线观看视频| 人成视频在线观看免费观看| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 欧美国产精品va在线观看不卡| 精品不卡国产一区二区三区| 999精品在线视频| 亚洲自拍偷在线| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 黄频高清免费视频| 大型av网站在线播放| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 啦啦啦韩国在线观看视频| 少妇 在线观看| 99re在线观看精品视频| 变态另类丝袜制服| 国产成人精品无人区| 中文字幕人妻熟女乱码| 午夜成年电影在线免费观看| 午夜免费鲁丝| 9191精品国产免费久久| 日韩中文字幕欧美一区二区| 欧美激情 高清一区二区三区| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 波多野结衣一区麻豆| 老司机午夜福利在线观看视频| 日韩欧美在线二视频| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 9191精品国产免费久久| 九色亚洲精品在线播放| 老熟妇仑乱视频hdxx| 搡老岳熟女国产| 免费高清在线观看日韩| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 免费少妇av软件| 99国产精品免费福利视频| 日韩大码丰满熟妇| 国产精品永久免费网站| 欧美不卡视频在线免费观看 | 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 日本三级黄在线观看| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 精品人妻1区二区| 十八禁网站免费在线| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 久久青草综合色| 欧美亚洲日本最大视频资源| 久久精品国产清高在天天线| 老鸭窝网址在线观看| 老司机午夜十八禁免费视频| 啦啦啦观看免费观看视频高清 | 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 欧美一级a爱片免费观看看 | 日韩高清综合在线| 大码成人一级视频| 国产激情欧美一区二区| 亚洲欧美激情在线| 男人舔女人下体高潮全视频| а√天堂www在线а√下载| 日本vs欧美在线观看视频| 无限看片的www在线观看| 91字幕亚洲| 欧美黄色片欧美黄色片| 国产成人精品在线电影| 免费看十八禁软件| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲最大成人中文| 男人舔女人的私密视频| 欧美黑人精品巨大| 亚洲性夜色夜夜综合| 男人的好看免费观看在线视频 | 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| www.自偷自拍.com| 午夜福利在线观看吧| 国产欧美日韩一区二区三| 久久精品影院6| 狠狠狠狠99中文字幕| 亚洲国产欧美一区二区综合| 日本 欧美在线| 免费不卡黄色视频| 午夜成年电影在线免费观看| 亚洲色图综合在线观看| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 久久欧美精品欧美久久欧美| 亚洲片人在线观看| 久久久久久久精品吃奶| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 正在播放国产对白刺激| 香蕉久久夜色| 免费在线观看影片大全网站| 老司机在亚洲福利影院| 午夜免费成人在线视频| 日本精品一区二区三区蜜桃| 一边摸一边抽搐一进一小说| 美女扒开内裤让男人捅视频| 国产精品亚洲美女久久久| 亚洲电影在线观看av| 国产一区在线观看成人免费| а√天堂www在线а√下载| 国产熟女午夜一区二区三区| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产成+人综合+亚洲专区| 中文亚洲av片在线观看爽| 无限看片的www在线观看| 午夜视频精品福利| 美女午夜性视频免费| 国产欧美日韩精品亚洲av| 香蕉丝袜av| 久久性视频一级片| 人妻久久中文字幕网| 中文字幕久久专区| 亚洲成人久久性| 久久精品国产清高在天天线| 黄片大片在线免费观看| 久久热在线av| 色老头精品视频在线观看| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 18禁观看日本| 国产一区二区激情短视频| 男女下面插进去视频免费观看| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 少妇被粗大的猛进出69影院| av视频在线观看入口| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产1区2区3区精品| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 免费高清视频大片| 成人手机av| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲成人免费电影在线观看| 国产主播在线观看一区二区| 国产精品精品国产色婷婷| 操出白浆在线播放| 久久久久久久久中文| 婷婷精品国产亚洲av在线| 亚洲av成人av| 99久久国产精品久久久| 精品久久久久久久人妻蜜臀av | 色综合站精品国产| 日韩高清综合在线| 国产精品 欧美亚洲| 一边摸一边做爽爽视频免费| 日本欧美视频一区| 香蕉丝袜av| 精品无人区乱码1区二区| 高潮久久久久久久久久久不卡| 成人av一区二区三区在线看| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 久久久久久国产a免费观看| 一区在线观看完整版| 国产成人av激情在线播放| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 亚洲少妇的诱惑av| 91成年电影在线观看| 女人精品久久久久毛片| 久久精品国产综合久久久| 亚洲少妇的诱惑av| 久久中文字幕人妻熟女| 三级毛片av免费| 波多野结衣巨乳人妻| 午夜精品国产一区二区电影| 女性生殖器流出的白浆| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 欧美性长视频在线观看| 久久欧美精品欧美久久欧美| 精品久久久久久久毛片微露脸| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 久久久久久久久免费视频了| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 国产又色又爽无遮挡免费看| 亚洲av成人av| 精品熟女少妇八av免费久了| 麻豆一二三区av精品| 欧美不卡视频在线免费观看 | 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 搡老妇女老女人老熟妇| 国产精品亚洲av一区麻豆| 欧美国产精品va在线观看不卡| 在线观看一区二区三区| 黄频高清免费视频| 法律面前人人平等表现在哪些方面| av免费在线观看网站| 精品国产美女av久久久久小说| 亚洲五月天丁香| 最近最新中文字幕大全电影3 | 国产国语露脸激情在线看| av电影中文网址| 久久国产乱子伦精品免费另类| av超薄肉色丝袜交足视频| 午夜免费鲁丝| 999精品在线视频| 久久久国产精品麻豆| 极品人妻少妇av视频| 日韩精品中文字幕看吧| 一区二区日韩欧美中文字幕| 制服诱惑二区| 国产精品亚洲美女久久久| 午夜视频精品福利| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 波多野结衣高清无吗| 亚洲片人在线观看| 免费在线观看黄色视频的| 亚洲av五月六月丁香网| 亚洲中文av在线| 欧美中文综合在线视频| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 视频在线观看一区二区三区| 亚洲国产欧美网| 国产高清激情床上av| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲最大成人中文| 欧美激情极品国产一区二区三区| 婷婷丁香在线五月| 韩国精品一区二区三区| 国产成人影院久久av| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 日韩欧美三级三区| 精品欧美一区二区三区在线| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 国产精品久久视频播放| 亚洲午夜理论影院| 一进一出好大好爽视频| 欧美中文日本在线观看视频| 一进一出抽搐gif免费好疼| a级毛片在线看网站| 一区二区三区国产精品乱码| 两个人免费观看高清视频| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 人成视频在线观看免费观看| 啦啦啦韩国在线观看视频| 亚洲欧美日韩无卡精品| 久99久视频精品免费| 九色亚洲精品在线播放| 黄色视频,在线免费观看| 黄色丝袜av网址大全| 亚洲伊人色综图| 国产av又大| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 怎么达到女性高潮| 亚洲国产看品久久| 久久这里只有精品19| 中文亚洲av片在线观看爽| 日本免费a在线| 黄色毛片三级朝国网站| 在线观看免费视频网站a站| 99久久国产精品久久久| 一级a爱视频在线免费观看| 香蕉丝袜av| 99精品在免费线老司机午夜| 久热这里只有精品99| 99久久精品国产亚洲精品| 免费在线观看影片大全网站| 母亲3免费完整高清在线观看| 丝袜美足系列| 国产午夜精品久久久久久| 日韩欧美在线二视频| 色在线成人网| 欧美日韩一级在线毛片| 女同久久另类99精品国产91| 免费搜索国产男女视频| 美国免费a级毛片| 国产亚洲欧美在线一区二区| 精品第一国产精品| 亚洲国产看品久久| 欧美色欧美亚洲另类二区 | 亚洲精品国产精品久久久不卡| 波多野结衣av一区二区av| 无人区码免费观看不卡| 亚洲三区欧美一区| 成人手机av| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 亚洲精品美女久久av网站| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 少妇被粗大的猛进出69影院| 欧美另类亚洲清纯唯美| 丁香欧美五月| 两人在一起打扑克的视频| 久久久久亚洲av毛片大全| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 身体一侧抽搐| av视频在线观看入口| 欧美性长视频在线观看| 欧美成人性av电影在线观看| 中文字幕高清在线视频| 久久亚洲精品不卡| 久9热在线精品视频| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 午夜影院日韩av| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 妹子高潮喷水视频| 香蕉国产在线看| 亚洲精品中文字幕在线视频| 成人手机av| 妹子高潮喷水视频| 一级,二级,三级黄色视频| 不卡av一区二区三区| av在线天堂中文字幕| 久久 成人 亚洲| 色综合站精品国产| 欧美久久黑人一区二区| 深夜精品福利| 黑人欧美特级aaaaaa片| 欧美激情 高清一区二区三区| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 色在线成人网| 99香蕉大伊视频| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 1024视频免费在线观看| 欧美日韩精品网址| av视频在线观看入口| 天天一区二区日本电影三级 | 在线播放国产精品三级| 久热这里只有精品99| 国产激情久久老熟女| 日韩欧美一区视频在线观看| 国产成人啪精品午夜网站| av天堂在线播放| 日本vs欧美在线观看视频| 亚洲全国av大片| 99香蕉大伊视频| 一区二区三区高清视频在线| 精品欧美国产一区二区三| 国产一区二区三区视频了| 给我免费播放毛片高清在线观看| 动漫黄色视频在线观看| 久久性视频一级片| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 成人av一区二区三区在线看| 99精品久久久久人妻精品| 国产精品综合久久久久久久免费 | 精品日产1卡2卡| 国产xxxxx性猛交| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产欧美日韩一区二区三| 亚洲情色 制服丝袜| 亚洲,欧美精品.| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 我的亚洲天堂| 天堂√8在线中文| 99精品在免费线老司机午夜| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 日日爽夜夜爽网站| 成人免费观看视频高清| 色播在线永久视频| 欧美日韩乱码在线| 美女国产高潮福利片在线看| 色精品久久人妻99蜜桃| 日本黄色视频三级网站网址| 亚洲五月婷婷丁香| 一区二区三区高清视频在线| 国产成人av教育| 午夜影院日韩av| 99久久综合精品五月天人人| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 多毛熟女@视频| 日本精品一区二区三区蜜桃| 丁香六月欧美| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 亚洲全国av大片| 精品一区二区三区四区五区乱码| 久久久久亚洲av毛片大全| 久久久国产成人精品二区| 国产不卡一卡二| 亚洲精品国产色婷婷电影| 99精品欧美一区二区三区四区| 看片在线看免费视频| 免费看美女性在线毛片视频| 又黄又爽又免费观看的视频|