兔妊娠早中期滋養(yǎng)層細(xì)胞侵潤的觀察研究

勾俊潔，賀斌，徐祥波，武斌，石翠格，張樹成，王介東＊

（1．北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100730；2．國家人口計生委科學(xué)技術(shù)研究所，北京 100081）

妊娠過程中，胎盤絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞在囊胚著床后便開始分化遷移，向子宮蛻膜層和肌層血管侵襲，啟動螺旋動脈的重塑過程，這一過程是建立母胎循環(huán)的關(guān)鍵。絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞具有的侵襲功能是保證子宮螺旋動脈重塑和妊娠順利完成的重要基礎(chǔ)。如果絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞的遷移及侵襲功能出現(xiàn)異常，侵入到母體組織不夠深或不完全，即胎盤著床過淺，會造成血管重塑不足而致胎盤血液灌注出現(xiàn)障礙，容易引起先兆子癇、流產(chǎn)、胎兒生長受限等妊娠性疾病［1－3］。深入了解絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲能力的調(diào)節(jié)機制將有助于闡明這些妊娠相關(guān)疾病的發(fā)病機制。

兔、嚙齒類和靈長類動物的胎盤同屬于血絨毛型胎盤。除了靈長類動物和人，兔和大鼠均具有子宮螺旋動脈?；蚪M學(xué)數(shù)據(jù)顯示，兔在生殖方面比嚙齒類更近似于人類［4］，而且腎素－血管緊張素系統(tǒng)和血液動力變化系統(tǒng)的基因關(guān)系圖顯示，兔是研究母體血壓及胎盤灌注合適的模型動物［5－6］。細(xì)胞角蛋白（CK）在上皮樣細(xì)胞中表達，滋養(yǎng)層細(xì)胞是獨特的上皮細(xì)胞［7］。Blaschitz等［8］在人類妊娠早期胎盤中的試驗結(jié)果顯示，細(xì)胞角蛋白7（CK7）能夠特異性標(biāo)記滋養(yǎng)層細(xì)胞及其亞群。Maldonado-Estrada等［9］用CK7作為第一選擇標(biāo)記，用以監(jiān)測純化的細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞的純度，將CK7視為是滋養(yǎng)層分離的廣泛使用的標(biāo)記。本文中我們利用CK7免疫組化方法探討兔妊娠早中期滋養(yǎng)層細(xì)胞侵潤子宮的深度及侵潤方式，以期為胚胎著床及子宮螺旋動脈重塑的機制提供理論基礎(chǔ)。

材料和方法

一、材料

1．實驗動物：6～7月齡新西蘭兔（購自北京金牧陽實驗動物養(yǎng)殖有限責(zé)任公司），體重3．5～3．9kg。環(huán)境溫度20～22℃，相對濕度70%～85%，每日光照12h，單籠單只飼養(yǎng)，自由攝食進水。

2．主要試劑：小鼠抗人細(xì)胞角蛋白7（CK7）抗體、PV6002二抗試劑盒、AP-Red kit試劑盒、辣根酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG，均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

3．實驗儀器：Leica LMD6000激光顯微捕獲儀（德國）。

二、實驗方法

1．取材：發(fā)情期雌兔于晚上8：00～10：00進行交配，觀察陰道涂片確定交配成功與否，交配成功的次日上午記為妊娠第0．5天。交配前一天開始每天進行耳緣靜脈取血，每次約1．0ml，室溫靜置40min，3 000rpm離心5min，取血清－20℃冷凍保存。妊娠雌兔分別于第6．0、7．5、9、10．5、12、13、14、15和19天處死取材，且處死前耳緣靜脈取血，血清－20℃保存。每組各妊娠時間點取至少5個胎盤于4%多聚甲醛固定。

2．免疫組織化學(xué)染色：胎盤組織常規(guī)石蠟包埋制片，切片脫蠟、水化，經(jīng)EDTA緩沖液（pH 8．0）煮沸20min進行抗原修復(fù)，3%雙氧水室溫下10min，加羊血清室溫孵育20min，小鼠抗人CK7（1∶200）4℃過夜（小鼠IgG抗體為陰性對照），辣根酶標(biāo)記羊抗小鼠二抗37℃孵育30min，DAB顯色8min，蘇木精復(fù)染1min，脫水透明，中性樹膠封片。

3．過碘酸雪夫（PAS）染色：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，高碘酸溶液染色10min，充分蒸餾水洗，擦干多余水分，雪夫試劑浸染10min，流水沖洗，Harris明礬蘇木素復(fù)染2min，95%酒精、無水酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

4．堿性磷酸酶染色：胎盤冰凍組織，下冰凍切片，冷丙酮固定5min，蒸餾水沖洗數(shù)秒，按AP-Red kit試劑盒說明書顯色20min，蒸餾水洗，Harris明礬蘇木素復(fù)染5s，蒸餾水洗，水溶性封片劑封片。

5．血清雌和孕激素水平測定：使用放射免疫法測定采集血清中的激素含量（試劑盒由南京迪安醫(yī)學(xué)檢驗所有限公司提供）。

結(jié) 果

一、妊娠早、中期血清雌二醇和孕酮變化

雌二醇水平在妊娠第6天后開始升高，第12天達高峰，此后下降，第15天時接近初始水平（圖1A）。孕酮水平第3天開始呈升高趨勢，第6天開始顯著增高，第12天達到最高水平，此后一直維持這個水平（圖1B）。

二、子宮內(nèi)膜血管管周蛻膜化變化

妊娠第9天，子宮內(nèi)膜血管管周出現(xiàn)蛻膜化細(xì)胞，胞質(zhì)比較致密（圖2A），富含堿磷酶（圖2E）和糖蛋白（圖2G）；第10．5天，蛻膜化細(xì)胞由管周擴充到整個間質(zhì)，蛻膜細(xì)胞發(fā)生空泡化（圖2B）；從第12天開始，蛻膜化細(xì)胞高度空泡化（圖2C），間質(zhì)被擠壓成狹長的條索狀（圖2C、F、H）；第15天，蛻膜細(xì)胞仍然保持高度空泡化（圖2D），空泡化的蛻膜細(xì)胞不再富含堿磷酶（圖2F）和糖蛋白（圖2H）。

圖1 雌兔妊娠早、中期血清雌二醇與孕酮水平

三、妊娠早中期滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵潤

CK7免疫組化方法檢測顯示，在兔妊娠第6天，CK7陽性定位于擴張的子宮腔上皮細(xì)胞（圖3A）；在第7．5天，在胚胎著床處，定位于滋養(yǎng)層粘結(jié)點（圖3B箭頭示）；到第9天時滋養(yǎng)層粘附完成，被滋養(yǎng)層粘附的內(nèi)膜部位失去上皮樣結(jié)構(gòu)，陽性信號減弱，在滋養(yǎng)層粘附部位偶見CK7陽性的滋養(yǎng)層細(xì)胞（圖3C箭頭示）；在第10．5天，胎盤小葉出現(xiàn)（圖3D箭頭示），CK7陽性的合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞已經(jīng)開始侵潤到子宮內(nèi)膜基質(zhì)（圖3D）；在第12天，迷路區(qū)結(jié)構(gòu)較明顯，CK7陽性的滋養(yǎng)層細(xì)胞在迷路下子宮基質(zhì)中劇增，且在此區(qū)域動脈竇形成（圖3E）；在第13天和14天，胎盤下的動脈竇進一步擴張，在動脈竇周圍的間質(zhì)及管周蛻膜細(xì)胞CK7陽性的滋養(yǎng)層細(xì)胞增多（圖3F、3G）：在絨毛柱的末梢細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞形成內(nèi)含三四個或更多個核的合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞（圖3G2），而迷路區(qū)大部分為空泡化的合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞（圖3G2、3G3）。此外，在非著床位點，細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞融合成數(shù)個核的合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞，但是此處的合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞與迷路區(qū)的合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞明顯不同，其核的數(shù)量較多達數(shù)個至數(shù)十個，而且均未見空泡樣改變（圖3G1）。在第15天，胎盤形成，且胎盤連接區(qū)全部被CK7陽性的滋養(yǎng)層細(xì)胞侵潤，動脈竇管腔又進一步擴張（圖3H）；在第19天，CK7陽性的滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲至子宮肌層和肌層動脈管壁，而連接區(qū)基質(zhì)細(xì)胞基本全部發(fā)生退行性改變，形成少細(xì)胞的松散區(qū)域，動脈竇里的CK7陽性滋養(yǎng)層細(xì)胞基本消失，且管腔較第15天擴大更加明顯（圖3I）。

圖2 妊娠早、中期血管管周蛻膜化變化（HE、PAS、堿性磷酸酶染色）

在妊娠第12天到第15天的胎盤組織中，子宮蛻膜區(qū)滋養(yǎng)層細(xì)胞侵潤部位均同時存在以下三種情況：（1）管內(nèi)充滿滋養(yǎng)層細(xì)胞而管壁和管周沒有滋養(yǎng)層細(xì)胞（圖3E1）；（2）正在向管周細(xì)胞滲透的滋養(yǎng)層細(xì)胞（圖3E2）；（3）血管之間的間質(zhì)充滿滋養(yǎng)層細(xì)胞，管周沒有滋養(yǎng)層細(xì)胞滲透（圖3E3）。

圖3 妊娠早、中期胎盤CK7免疫組織化學(xué)染色

討 論

子宮螺旋動脈重塑及滋養(yǎng)層細(xì)胞侵潤與先兆子癇、植入性胎盤、胎兒生長受限等疾病相關(guān)，研究滋養(yǎng)層細(xì)胞侵潤的分子機制在基礎(chǔ)研究和臨床指導(dǎo)上都具有重大意義。

在人的妊娠過程中，細(xì)胞滋養(yǎng)層祖細(xì)胞有兩種分化途徑：一是部分細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞融合形成多核的合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞，使絨毛能夠漂浮在母體血液中，同時構(gòu)成與母體血之間的屏障，調(diào)節(jié)氧氣、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的運輸；二是部分細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞分化成絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞，絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞向母體蛻膜組織侵潤，對子宮螺旋動脈重塑起重要作用［10－11］。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，在兔的妊娠過程中滋養(yǎng)層細(xì)胞主要為含三四個核或更多核的空泡化合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞，絨毛中只含單核的細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞，在絨毛柱末端往往為多個核的合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞。同時，空泡化的滋養(yǎng)層細(xì)胞呈CK7強陽性染色，而非空泡化的滋養(yǎng)層細(xì)胞CK7則陽性信號很弱。因此我們推測兔妊娠中合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞形成的一種方式為：絨毛中細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞逐漸融合成多核的合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞，并從絨毛柱末端脫落下來，之后逐漸發(fā)生空泡化，侵襲能力加強，向蛻膜區(qū)及肌層血管侵襲。另外，在非著床點我們還看到單核的細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞融合成巨大的含數(shù)個核的合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞，在這些細(xì)胞侵潤的部位見到不完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，推測這些細(xì)胞對非著床位點連接區(qū)的建立具有重要作用，其機制仍有待于探討。

在人類子宮螺旋動脈重塑機制中，關(guān)于滋養(yǎng)層細(xì)胞是通過管周間質(zhì)細(xì)胞侵潤方式進入血管，還是從血管遠(yuǎn)端進入逆行向上侵潤整個子宮動脈，這一直存在爭議［12］。在本研究中初步觀察在兔中滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵潤方式，在同一胎盤組織中總能同時觀察到以下3種情況：（1）管內(nèi)充滿滋養(yǎng)層細(xì)胞而管壁和管周沒有滋養(yǎng)層細(xì)胞；（2）正在向管周細(xì)胞滲透的滋養(yǎng)層細(xì)胞；（3）血管之間的間質(zhì)充滿滋養(yǎng)層細(xì)胞，管周沒有滋養(yǎng)層細(xì)胞滲透。同時發(fā)現(xiàn)在妊娠第19天肌層處存在大量滋養(yǎng)層細(xì)胞，而肌層與連接區(qū)之間的蛻膜組織中沒有滋養(yǎng)層細(xì)胞。因此，這些結(jié)果提示兔滋養(yǎng)層細(xì)胞可能以間質(zhì)滲入、蛻膜細(xì)胞滲入、血管內(nèi)逆行向上多種方式并行向肌層方向進行侵潤。

另外我們發(fā)現(xiàn)，在兔的妊娠子宮中，在蛻膜化的初始階段堿性磷酸酶活性較高，蛻膜細(xì)胞逐漸空泡化后，不再顯示堿性磷酸酶活性，所以在兔中堿性磷酸酶的強陽性是管周蛻膜化開始的一個指示，這與Zook等［13］通過皮埋雌孕激素誘導(dǎo)蛻膜化的結(jié)果相一致，具體的機制有待于進一步研究。

Albrecht等［14］在猩猩體內(nèi)的研究表明，雌二醇能夠明顯地抑制絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲能力和血管重塑過程。而對于孕酮，大量研究結(jié)果表明其對絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力起著負(fù)調(diào)節(jié)性作用［15－16］。但也有人得到與此 相反的 結(jié)果［17］。本研究中通過測定兔妊娠早中期的雌孕激素水平，結(jié)果也提示滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲功能可能受到孕酮、雌二醇等激素的調(diào)節(jié)。此外，兔妊娠階段雌和孕激素水平變化特點還提示，孕酮的高水平是維持蛻膜化的關(guān)鍵，雌激素對蛻膜化起誘導(dǎo)作用。Elton等［18］的實驗結(jié)果印證了這一點。他們通過皮下注射雙醋炔諾酮加美雌醇誘導(dǎo)兔子宮蛻膜化，結(jié)果顯示，只給雙醋炔諾醇組，子宮蛻膜率隨著雙醋炔諾醇濃度的增加而升高，但最高只能達到74%，而給予適宜劑量美雌醇時蛻膜率升高到100%。

滋養(yǎng)細(xì)胞的浸潤程度受到自身、蛻膜組織及母體雌孕激素誘導(dǎo)的網(wǎng)絡(luò)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)。對這些調(diào)節(jié)機制的探索有利于先兆子癇、胎兒生長受限、植入性胎盤等妊娠相關(guān)性疾病的認(rèn)識，通過其發(fā)病機制的深入研究進而從源頭上找到治療這些疾病的新靶點。

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