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    維持人胚胎干細(xì)胞多能性順式作用元件的篩選

    2021-05-12 02:24:56孫夢(mèng)瑤劉思琪周凡琦馬艷妮
    關(guān)鍵詞:誘導(dǎo)型能性流式

    孫夢(mèng)瑤,劉思琪,周凡琦,馬艷妮,余 佳

    (中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100005)

    人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells,hESCs)是一類源于人囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán),經(jīng)過體外分離純化及培養(yǎng),所得到的穩(wěn)定的多能干細(xì)胞,可在適當(dāng)?shù)臈l件下分化形成體內(nèi)各種類型的細(xì)胞,因具有潛在的再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景而被廣泛研究[1]。多能性是hESCs的重要特征之一,以O(shè)CT4、NANOG、SOX2等為代表的一系列轉(zhuǎn)錄因子,在維持hESCs多能性上發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[2]。目前,對(duì)于參與維持多能性基因表達(dá)的順式作用元件及染色質(zhì)高級(jí)構(gòu)象,仍不是十分清楚。例如,哪些增強(qiáng)子與絕緣子通過發(fā)揮順式作用影響hESCs的多能性等,因此有待進(jìn)一步研究和揭示。

    成族規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)基因編輯技術(shù)為實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的基因功能篩選提供良好的解決方案,通過構(gòu)建CRISPR文庫(kù),感染目的細(xì)胞,以細(xì)胞某種表型變化作為檢測(cè)和篩選手段,分離得到具有特殊表型的細(xì)胞,測(cè)序得到其中的基因敲除信息[3-5]。由于CRISPR關(guān)聯(lián)因子(CRISPR associated, Cas)9,也叫“Cas9蛋白”的持續(xù)性表達(dá)可能會(huì)對(duì)hESC的多能性產(chǎn)生影響[6],因此首先構(gòu)建了誘導(dǎo)型的Cas9穩(wěn)定表達(dá)株,再通過感染CRISPR文庫(kù),以O(shè)CT4的表達(dá)水平作為多能性的衡量標(biāo)準(zhǔn),通過流式分析,發(fā)現(xiàn)存在基因敲除后多能性下降的hESC群體。通過成功創(chuàng)建該種方法,可以獲得影響hESC多能性的順式作用元件的信息,為進(jìn)行下一步的功能與機(jī)制研究做好鋪墊。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    hESC(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院石莉紅課題組)。hESC培養(yǎng)試劑:mTesR1培養(yǎng)基、RelesR、accutase和dispase(Stem Cell公司);Matrigel(Corning公司)。HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)試劑:DMEM培養(yǎng)基(Corning公司);胎牛血清(Gibco公司);pcw-Cas9質(zhì)粒(Addgene公司);流式抗體:human-anti OCT4 流式抗體和human-anti SSEA4流式抗體(BD公司)。藥物:強(qiáng)力霉素(doxcycline,DOX,TaKaRa公司);嘌呤霉素(puromycin,puro)和殺稻瘟菌素(blasticidin,BSD,Thermo Fisher Scientific公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 培養(yǎng)hESCs細(xì)胞:使用mTesR1培養(yǎng)基培養(yǎng)hESC,一般培養(yǎng)于matrigel包被的6孔板上,每孔使用500 μL RelesR按1∶6~1∶10比例進(jìn)行傳代,每4~7 d傳代1次。

    1.2.2 誘導(dǎo)型Cas9穩(wěn)定表達(dá)株的獲?。簩cw Cas9質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝,高速離心收集病毒沉淀。使用病毒感染hESC,48 h后puro篩選得到感染成功的細(xì)胞。藥篩后的細(xì)胞使用accutase消化酶進(jìn)行單細(xì)胞傳代,待小克隆長(zhǎng)成之后,使用dispase消化并在顯微鏡下挑取單克隆于24孔板中進(jìn)行培養(yǎng)。至單克隆增殖成穩(wěn)定細(xì)胞株后,對(duì)培養(yǎng)得到的細(xì)胞進(jìn)行Cas9蛋白表達(dá)鑒定,從而得到誘導(dǎo)型Cas9穩(wěn)定表達(dá)株(induced Cas9-hESC,iCas9-hESC)。

    1.2.3 多能性基因相關(guān)順式作用元件的獲取:在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中,得到15個(gè)多能性基因的基因組位置(OCT4、KLF4、NANOG、SOX2、DPPA5、DNMT3L、REX1、KLF5、KLF2、DPPA2、STELLA、HORMAD1、MAEL、TFCP2L1和UTF1)。分別在每個(gè)基因位置上下游100 Mb(1 Mb=1 000 kb)內(nèi)篩選其中的增強(qiáng)子與絕緣子,作為候選順式作用元件研究對(duì)象,確定其起始位置。

    1.2.4 CRISPR文庫(kù)的構(gòu)建:以候選順式作用元件的起始位置為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)gRNA(guide RNA),每個(gè)候選靶點(diǎn)設(shè)計(jì)3條gRNA,構(gòu)建雙gRNA基因敲除的慢病毒載體。1個(gè)載體中包含2個(gè)U6啟動(dòng)子,分別表達(dá)1條gRNA[7],載體上同時(shí)帶有mcherry熒光標(biāo)記和BSD抗性篩選標(biāo)記。

    1.2.5 CRISPR文庫(kù)感染hESCs:CRISPR文庫(kù)在MOI(multiple of infection)=0.5時(shí)感染hESCs,保證1個(gè)細(xì)胞中只進(jìn)入1對(duì)gRNA。感染文庫(kù)48 h后細(xì)胞進(jìn)行BSD藥物篩選,藥物篩選7 d后,加入2 ng/mL DOX(Doxcycline)誘導(dǎo)Cas9蛋白表達(dá),Cas9蛋白表達(dá)7 d后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作[8]。

    1.2.6 流式抗體染色和分析:對(duì)CRISPR文庫(kù)編輯后的hESCs進(jìn)行OCT4流式抗體染色,染色方法為,PBS清洗細(xì)胞,細(xì)胞使用4%多聚甲醛固定10 min,0.1% T×100通透10 min,流式抗體染色30~45 min,上機(jī)分析[9]。

    2 結(jié)果

    2.1 iCas9-hESC特征鑒定

    成功構(gòu)建的hESC誘導(dǎo)型Cas9穩(wěn)定表達(dá)株(iCas9-hESC),可以在DOX誘導(dǎo)后1 d內(nèi)高水平表達(dá)Cas9蛋白(圖1A)。選擇OCT4和SSEA4兩個(gè)基因衡量干細(xì)胞多能性,研究發(fā)現(xiàn),在hESCs向中胚層誘導(dǎo)過程的第2天和第4天,OCT4和SSAE4的表達(dá)水平持續(xù)下降(圖1B)。當(dāng)iCas9-hESC表達(dá)Cas9蛋白時(shí),OCT4和SSEA4的表達(dá)水平并未發(fā)生顯著變化(圖1C)。

    A.expression of Cas9 protein one day after Dox induction; B.with the induction of hESCs to the mesoderm, the expression levels of OCT4 and SSEA4 continued to decline; C.when iCas9-hESC expressed Cas9 protein, the expression levels of OCT4 and SSEA4 did not change significontly圖1 iCas9-hESC特征鑒定Fig 1 iCas9-hESC characterization

    2.2 成功構(gòu)建CRISPR文庫(kù)

    以候選順式元件的兩端作為靶點(diǎn),分別設(shè)計(jì)3對(duì)gRNA進(jìn)行敲除,通過兩步克隆將帶有 gRNA 的片段插入到慢病毒骨架上,最終得到由 2.7×107個(gè)單克隆組成的慢病毒文庫(kù)。合成的gRNA文庫(kù)覆蓋率為99.97%,且gRNA豐度的分布符合正態(tài)分布,整體分布呈現(xiàn)比較均勻的狀態(tài)(圖2)。

    圖2 CRISPR文庫(kù)質(zhì)控Fig 2 CRISPR library quality control

    2.3 使用CRISPR文庫(kù)感染iCas9-hESC

    在MOI=0.5時(shí)將CRISPR文庫(kù)感染進(jìn)iCas9-hESC,進(jìn)行BSD藥物篩選后仍有細(xì)胞存活,對(duì)感染文庫(kù)后的細(xì)胞進(jìn)行流式分析,可檢測(cè)到mcherry的表達(dá)(圖3)。

    圖3 細(xì)胞感染CRISPR文庫(kù)后mcherry的表達(dá)Fig 3 Expression of mcherry after cell infected with CRISPR library

    2.4 CRISPR文庫(kù)編輯后hESCs多能性發(fā)生變化

    流式分析發(fā)現(xiàn)確實(shí)存在一群細(xì)胞,在CRISPR文庫(kù)感染后OCT4表達(dá)水平下降[12]。并可通過流式分選將這批細(xì)胞分析出來,進(jìn)行后續(xù)的基因敲除鑒定(圖4)。

    圖4 hESCs多能性的變化Fig 4 Changes in hESCs pluripotency

    3 討論

    CRISPR技術(shù)是目前進(jìn)行基因編輯的主要方法之一,通過構(gòu)建CRISPR文庫(kù),可以對(duì)一系列基因進(jìn)行敲除,并進(jìn)一步通過表型的變化篩選出功能性基因。本文主要研究以增強(qiáng)子和絕緣子為代表的順式元件對(duì)hESCs多能性的影響,順式元件雖然不編碼蛋白質(zhì),但是可以參與基因的表達(dá)調(diào)控,通過影響轉(zhuǎn)錄進(jìn)而影響蛋白編碼基因的表達(dá)水平[13-14]。多能性是hESCs的特殊特征,但在hESCs中特異性影響多能性的順式元件的研究尚不全面。因此本工作針對(duì)hESCs中多能性相關(guān)的順式元件構(gòu)建CRISPR文庫(kù),旨在篩選出潛在影響hESCs多能性的順式作用元件。

    首先通過構(gòu)建誘導(dǎo)型Cas9穩(wěn)定表達(dá)株(iCas9-hESC),排除Cas9的持續(xù)性表達(dá)對(duì)hESCs多能性的影響,并通過OCT4和SSEA4兩種多能性marker的表達(dá)水平,鑒定出iCas9-hESC的多能性狀態(tài)未收到影響。接下來對(duì)候選順式元件構(gòu)建雙gRNA CRISPR敲除文庫(kù),在文庫(kù)成功感染iCas9-hESC后,誘導(dǎo)Cas9蛋白表達(dá),排除Cas9蛋白表達(dá)影響CRISPR文庫(kù)感染效率的可能性。接下來對(duì)基因編輯后的細(xì)胞,通過OCT4表達(dá)水平的變化,成功區(qū)分出多能性下降和不變的hESCs,證明確實(shí)存在影響hESCs多能性的順式作用元件。

    本工作建立了在hESCs中進(jìn)行大規(guī)模功能性基因組元件篩選的可行性方案,以本工作為基礎(chǔ),可通過流式分選得到多能性下降的細(xì)胞群體,對(duì)其中的gRNA進(jìn)行測(cè)序分析,即可確定敲除后影響hESCs多能性的重要基因元件。通過建立篩選方案,也可應(yīng)用于其他DNA序列的功能性篩選,具有較強(qiáng)的應(yīng)用性與普適性。

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