氧化鈰納米顆粒促成骨分化及其對相關(guān)致病菌抗菌作用的研究進(jìn)展

鈰（Ce）是一種稀土元素（原子序數(shù)58），屬于元素周期表中的鑭系元素，主要以氧化鈰（CeO2）的 形 式 存 在［1-2］。CeO2的性質(zhì)主要由其獨特的立方螢石晶格結(jié)構(gòu)決定，在此結(jié)構(gòu)中存在大量的氧空位。氧空位形成通常伴隨著2個電子在Ce原子上的局域化，使Ce的氧化物同時包括還原態(tài)CeO2（Ce4+）和 氧 化 態(tài)Ce2O3（Ce3+）2種 狀態(tài)［2-4］。Ce3+和Ce4+同時存在可模擬氧化還原反應(yīng)使氧化鈰納米顆粒（CeO2-nanoparticles，CeO2-NPs）同時表現(xiàn)出超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）模擬活性［5］。研究［6］表明：Ce的氧化物可以作為一種納米酶，發(fā)揮抗菌、抗癌、促成骨和促血管生成等多重功能。研究［7］顯示：CeO2-NPs在骨支架改進(jìn)、藥物和基因傳遞載體及標(biāo)記技術(shù)等方面均有應(yīng)用。研究［8］顯示：CeO2-NPs通過多種機(jī)制顯示其抗菌作用，如可通過觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)過量活性氧（reactive oxygen species，ROS）以 抵 抗 病 菌 等。隨著生物納米技術(shù)應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展，針對Ce及其氧化物的研究逐漸深入?，F(xiàn)對CeO2-NPs在促進(jìn)成骨細(xì)胞（osteoblast，OB）分化、抵抗相關(guān)致病菌的作用及不足進(jìn)行綜述，為以Ce為基礎(chǔ)治療劑的開發(fā)和研究提供新的思路。

1 CeO2-NPs的促成骨作用及其機(jī)制

CeO2-NPs因其抗氧化能力被認(rèn)為是有效的ROS清除劑，ROS在維持骨穩(wěn)態(tài)平衡過程中發(fā)揮著重要作用，即調(diào)控破骨細(xì)胞（osteoclast，OC）的分化成熟和成骨細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［9］。CeO2-NPs可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞中ROS水平，調(diào)控骨平衡，進(jìn)而促進(jìn)骨形成。

CeO2-NPs在成骨細(xì)胞分化過程中可影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 （mesenchymal stem cells，BMSCs）、OB和 軟 骨 細(xì) 胞 活 性。研 究［10-11］顯 示：Ce對成骨的積極作用與骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）信 號 有 關(guān)，在MC3T3-E1成骨實驗中，Ce可以通過調(diào)控OB基因從而影響MC3T3-E1細(xì)胞的增殖、成骨分化和礦化功能，也可通過轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）/BMP信 號 通 路 調(diào) 控BMSCs成骨。也有研究［9］表明：經(jīng)CeO2-NPs處理的OC使還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 1，NOX1）表達(dá)增加和ROS水平升高，進(jìn)而增強(qiáng)核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）信號通路促進(jìn)OC分化，增強(qiáng)骨吸收能力。上述結(jié)果為Ce的骨代謝機(jī)制提供了新的證據(jù)，也為今后CeO2-NPs的合理應(yīng)用提供了新的思路。

CeO2-NPs的抗氧化性能使其在骨疾病和骨組織工程領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，如生物植入物表面的CeO2-NPs涂層可促進(jìn)OB的增殖［12］。相關(guān)研究［13］表 明：CeO2-NPs涂 層 在 細(xì) 胞 增 殖、堿 性 磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性和鈣沉積活性等方面促進(jìn)了BMSCs的成骨行為。一項體內(nèi)動物實驗［14］研究了表面Ce4+/Ce3+比值對CeO2-NPs涂層種植體周圍骨形成和礦化的影響，證實新骨組織的形成和礦化程度取決于CeO2-NPs表面Ce4+/Ce3+比值。然而，CeO2-NPs對骨再生機(jī)制尚未完全闡明，需要進(jìn)一步研究證實。

CeO2-NPs可以干預(yù)骨重塑過程，影響OB功能。新骨的形成與CeO2-NPs表面Ce4+/Ce3+比值有密切關(guān)聯(lián)［15］。Ce4+/Ce3+比值與骨整合程度成正比，Ce4+/Ce3+比值升高，CeO2-NPs顯示出其催化活性，清除骨組織中過量ROS，加快OB分化；Ce4+/Ce3+比值降低，ROS水平升高，促進(jìn)了OC形 成［5，9］。生 理 性ROS水 平 在OB和OC平 衡 中 起著至關(guān)重要的作用，為了維持這種有限的平衡，在生物系統(tǒng)中不斷地產(chǎn)生和清除ROS。骨平衡破壞可導(dǎo)致ROS的極度集中，OB中ROS過量產(chǎn)生會導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)變性和核酸損傷，最終OB凋亡，破壞成骨過程。因此可以通過調(diào)控CeO2-NPs表面Ce4+/Ce3+比值有效調(diào)節(jié)ROS的產(chǎn)生和清除，表現(xiàn)出類似CAT的活性，進(jìn)而降低細(xì)胞中過氧化氫（H2O2）水平，保護(hù)細(xì)胞以免發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生有利的新骨形成和骨整合環(huán)境，進(jìn)而達(dá)到新骨形成的目的。

研究［11］顯示：較高的Ce4+濃度可上調(diào)巨噬細(xì)胞抗炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素10（interleukin-10，IL-10）和白細(xì)胞介素1受體拮抗劑（interleukin-1 receptor antagonist，IL-1RA）、骨誘導(dǎo)分子骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）和轉(zhuǎn)化生長因子1（transforming growth factor-1，TGF-1）表達(dá)促進(jìn)成骨，提示調(diào)節(jié)Ce價態(tài)可能是改善成骨特性和減輕炎癥反應(yīng)的一種有效方法。M2巨噬細(xì)胞表型用于抗炎和組織再生，而M1巨噬細(xì)胞表型可促炎和導(dǎo)致組織破壞。CeO2-NPs表面Ce4+/Ce3+比值升高可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞極化為M2表型，并使抗炎細(xì)胞因子IL-10水平升高。CeO2-NPs表面Ce4+/Ce3+比值降低促使巨噬細(xì)胞向M1表型極化，并相應(yīng)地增加了促炎細(xì)胞因子腫瘤壞死因子α（tumor recrosis factor-α，TNF-α）的產(chǎn)生。通過調(diào)控CeO2-NPs中Ce的價態(tài)，升高Ce4+/Ce3+比值可以有效地調(diào)節(jié)干細(xì)胞的成骨能力和巨噬細(xì)胞的M2極化，從而促進(jìn)新骨形成和骨整合［5，12］。綜上所述，通過調(diào)控CeO2-NPs表面Ce4+/Ce3+的比值，可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞抗炎和促炎細(xì)胞因子的平衡，并創(chuàng)造抗炎促成骨的微環(huán)境［5，8］。

CeO2-NPs可以通過激活間充質(zhì)干細(xì)胞TGF-β/BMP信 號 通 路 促 進(jìn) 成 骨，CeO2-NPs激 活BMP信號通路并與骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體（bone morphogenetic protein receptor，BMPR）相 互 作用，進(jìn)一步激活磷酸化Smad蛋白（p-Smad1/5/8）表 達(dá)［11］。p-Smad1/5/8與Smad4結(jié) 合 導(dǎo) 致 成 骨 主控轉(zhuǎn)錄因子Runx2上調(diào)，Runx2在OB分化早期誘導(dǎo)成骨細(xì)胞標(biāo)記基因Ⅰ型膠原蛋白（collagen typeⅠ，ColⅠ）和BMP2，在OB分化后期誘導(dǎo)ALP和骨鈣素（osteocalcin，OCN），促使BMSCs向OB分化［16］。

CeO2-NPs在酸性環(huán)境中可以使OC中ROS水平明顯升高，抑制OB分化和礦化，增強(qiáng)OC活性，導(dǎo)致促炎性骨吸收［1］。OC活化的2條主要信號通路是絲裂原活化蛋白激酶和核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）蛋白信號通路。ROS作為細(xì)胞內(nèi)信使分子激活下游的絲裂原活化蛋白激酶和NF-κB信號通路，較低濃度CeO2-NPs激活活化T細(xì)胞核因子1（nuclear factor of activated T cell 1，NFATC1）和下游與OC生成相關(guān)的基因表達(dá)，進(jìn)而雙向調(diào)節(jié)RANKL依賴的OC生成［1］。研究［1］表明：低 濃 度CeO2-NPs（4.0～8.0 mg·L－1）促 進(jìn)OC形成，表現(xiàn)為NFATC1及c-Fos表達(dá)水平升高、F-actin環(huán)形成和骨吸收增加；但較高濃度（＞16.0 mg·L－1）CeO2-NPs可 通 過 降 低B細(xì) 胞 淋 巴瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）蛋白表達(dá)和上調(diào)裂解的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase-3，cleaved caspase-3）蛋白表達(dá)抑制OC分化，促進(jìn)其凋亡。

2 CeO2-NPs的抗菌作用及其機(jī)制

CeO2-NPs作為一種抗菌劑特別是其對細(xì)菌病原 體 的 抗 菌 作 用，受 到 廣 泛 關(guān) 注［1，16］。研 究［17-20］表明：CeO2-NPs對革蘭陽性病原菌（金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌）、革蘭陰性病原菌（大腸桿菌和銅綠假單胞菌）和真菌等微生物均表現(xiàn)出良好的抗菌活性，但其抗菌作用具有明顯的差異性。革蘭陽性和革蘭陰性病原菌作用的差異主要與其細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和致密性不同有關(guān)。革蘭陽性菌有較厚的蠟狀細(xì)胞壁，而革蘭陰性菌的結(jié)構(gòu)略復(fù)雜，除薄層的肽聚糖外，還具有一層磷脂外膜，其中含有部分磷酸化的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），有助于增加其細(xì)菌外膜上的負(fù)電荷，具有比革蘭陽性菌更強(qiáng)的耐藥性［21-23］。CeO2-NPs對多種細(xì)菌，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌等，也表現(xiàn)出一定的抗菌效果，因此其有望成為一種潛在的抗菌劑，用于難治性病原菌的抗感染治療。

CeO2-NPs作為新型治療藥物在治療相關(guān)致病菌引起的疾病和對抗其他疾病方面有著廣闊的前景，如與殼聚糖交聯(lián)海藻酸鹽生物聚合物膜形成一種新型的創(chuàng)面敷料在牙周炎中的抗菌應(yīng)用，Ce和銀鹽按不同的陽離子摻雜量混合制備具有抗菌性能的尿素聚氧化乙烯（ureasil polyethylene oxide，U-PEO）雜 化 材 料［8，24］。與 傳 統(tǒng) 抗 菌 藥 物 比 較，CeO2-NPs具有獨特的抗菌機(jī)制，并有望克服目前耐藥性細(xì)菌的挑戰(zhàn)。

除抗氧化特性外，CeO2-NPs還表現(xiàn)出促氧化行為，可以誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，對相關(guān)細(xì)菌表現(xiàn)出抗菌作用。研究［20］顯示：CeO2-NPs可通過多種機(jī)制顯示其抗菌作用，但大多數(shù)CeO2-NPs通過觸發(fā)細(xì)胞中過量ROS產(chǎn)生以抑制病原菌。研究［25］顯示：CeO2-NPs對細(xì)菌的毒性可能是由于表面Ce3+和氧空位的存在，其特性可能有助于產(chǎn)生ROS引起氧化應(yīng)激，同時破壞細(xì)菌細(xì)胞壁，分解生物有機(jī)分子，并阻礙其相關(guān)功能，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡。盡管目前對CeO2-NPs抗菌活性的研究較多，但關(guān)于其確切機(jī)制、毒性及體內(nèi)研究尚未完全闡明。

CeO2-NPs可能的抗菌機(jī)制主要包括膜破壞和氧化損傷及CeO2-NPs攜帶正電荷與攜帶負(fù)電荷的細(xì)菌相互作用。在CeO2-NPs抗菌過程中2種機(jī)制同時進(jìn)行，CeO2-NPs與細(xì)菌表面直接接觸引起細(xì)胞中ROS水平升高，CeO2-NPs攜帶正電荷而細(xì)菌攜帶負(fù)電荷，二者產(chǎn)生電磁吸引，CeO2-NPs吸附至細(xì)菌表面后，隨著孵育時間的延長，其Zeta電位可能由正逐漸轉(zhuǎn)至負(fù)，而CeO2-NPs吸引力確保納米顆粒與細(xì)菌直接接觸，導(dǎo)致氧化損傷和細(xì)菌細(xì)胞膜不再完整，最終誘導(dǎo)細(xì)菌死亡［26］。綜上所述，CeO2-NPs與細(xì)菌細(xì)胞膜之間的靜電相互作用是CeO2-NPs抗菌機(jī)制的重要環(huán)節(jié)。以CeO2-NPs對革蘭陽性菌大腸桿菌的抗菌作用為例，首先進(jìn)行吸附，大腸桿菌與CeO2-NPs接觸后，其表面攜帶負(fù)電荷，攜帶正電荷的CeO2-NPs可通過靜電吸引吸附至細(xì)菌細(xì)胞膜上，進(jìn)而通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和破壞膜結(jié)構(gòu)干擾營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運并影響細(xì)菌的生存能力，最終誘導(dǎo)大腸桿菌死亡［27］。

CeO2-NPs吸附至細(xì)胞膜后，通過2種可能的方式影響細(xì)菌的生存能力，一是誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，二是干擾營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運功能［27］。CeO2-NPs氧化應(yīng)激可能歸因于Ce4+和Ce3+之間的可逆轉(zhuǎn)換。細(xì)胞可通過胞內(nèi)抗氧化劑使細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損傷并使ROS保持較低水平，CeO2-NPs吸附至細(xì)菌外膜表面時，可能會與脫氫酶等介體結(jié)合干擾細(xì)胞呼吸，CeO2-NPs可催化ROS產(chǎn)生，破壞系統(tǒng)的清除機(jī)制，ROS和自由基的水平升高，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)成功［27-28］。CeO2-NPs也可通過干擾營養(yǎng)物質(zhì)運輸功能達(dá)到抗菌目的。CeO2-NPs吸附至細(xì)菌外膜，因納米粒子與膜之間的靜電作用非常強(qiáng)，使其能夠在膜表面停留，靠近細(xì)菌細(xì)胞膜表面的Ce4+原子被還原為Ce3+，快速釋放ROS，脂質(zhì)或蛋白質(zhì)等細(xì)菌細(xì)胞膜的主要成分受到氧化壓力，使細(xì)菌外膜形成類中膜結(jié)構(gòu)，改變DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂等功能［29］。CeO2-NPs釋放出 的Ce離子可以 與 細(xì)菌外膜上具有營養(yǎng)物質(zhì)運輸功能蛋白質(zhì)中的巰基（-SH）發(fā)生反應(yīng)。CeO2-NPs與膜蛋白巰基相互作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，降低細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)生物有機(jī)分子功能失調(diào)，細(xì)菌新陳代謝和生理反應(yīng)發(fā)生異常，進(jìn)而導(dǎo)致其死亡。形狀不規(guī)則或表面粗糙的CeO2-NPs有棱角，可能會對細(xì)菌造成物理損害，細(xì)胞壁損傷。因此，CeO2-NPs吸附至細(xì)菌細(xì)胞膜上后，既可促進(jìn)ROS的產(chǎn)生又可造成細(xì)菌細(xì)胞壁的物理損傷［18］。

CeO2-NPs對細(xì)菌的毒性較為復(fù)雜，是多個因素綜合作用的結(jié)果。毒理學(xué)行為的差異既取決于CeO2-NPs的特性，也取決于不同的細(xì)菌菌株。細(xì)菌所處多種外部環(huán)境對CeO2-NPs的抗菌活性也有顯著影響。當(dāng)CeO2-NPs具有較大表面積、較高活性和較高濃度時，其具有較強(qiáng)的毒性［31］，但如何控制CeO2-NPs比表面積尚未完全闡明。

3 CeO2-NPs的納米醫(yī)學(xué)方面應(yīng)用

ROS是生物系統(tǒng)和自然環(huán)境中產(chǎn)生的強(qiáng)氧化劑，而CeO2-NPs是細(xì)胞中ROS的有效清除劑［6，31］。研究［32］顯示：CeO2-NPs可以清除細(xì)胞中的ROS，包括H2O2和自由基，CeO2-NPs也可以表現(xiàn)出類似氧化酶的活性，促進(jìn)細(xì)胞中ROS產(chǎn)生。CeO2-NPs具有抗氧化活性，使CeO2-NPs在治療由ROS引起的疾病方面具有較大潛力，如視網(wǎng)膜變性、心血管疾病和神經(jīng)變性等。CeO2-NPs還可誘導(dǎo)干細(xì)胞定向生長，提高聚合物支架表面的生物活性；同時也表現(xiàn)出良好的生物相容性，甚至在抗腫瘤方面對正常細(xì)胞也起到一定的保護(hù)作用［5］。

過量的ROS在癌癥等多種疾病發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用，在不同類型癌癥的體外和體內(nèi)模型中，CeO2-NPs已被證實具有選擇性抗癌活性。研究［33］表明：癌細(xì)胞經(jīng)CeO2-NPs處理后，活化的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CD8+T細(xì)胞）釋放出更多效應(yīng)分子和細(xì)胞因子，包括白細(xì)胞介素2（interleukin-2，IL-2）、TNF-α、顆粒酶B和穿孔素，上述炎癥因子釋放有助于增強(qiáng)癌癥的免疫治療效果。CeO2-NPs表面的Ce4+/Ce3+比值和腫瘤微酸堿環(huán)境會影響抗氧化劑或促氧化劑活性，細(xì)胞類型或細(xì)胞微環(huán)境也會對細(xì)胞毒性產(chǎn)生不同的影響，但其具體的影響機(jī)制還需進(jìn)一步探討。

CeO2-NPs具有清除組織微環(huán)境中活性物質(zhì)、抑制炎癥、降低細(xì)胞因子水平和提供細(xì)胞保護(hù)的功能，因此可能在組織中發(fā)揮抗炎作用［34］。高水平ROS可導(dǎo)致慢性炎癥發(fā)生，進(jìn)而引發(fā)免疫紊亂，并導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的器官損傷。CeO2-NPs的抗氧化活性可以減輕炎癥，保護(hù)細(xì)胞或組織免受損害，如CeO2-NPs被用來增強(qiáng)應(yīng)用皮膚替代物治療的療效并提高傷口修復(fù)能力，清除細(xì)胞中過量的ROS以緩解橫紋肌溶解所致的急性心肌損傷和膿毒癥所致的急性腎損傷等［35-37］。

4 總結(jié)與展望

CeO2-NPs因其良好的生物相容性和有效的抗菌性能及促成骨特性成為組織工程材料研究的新熱點。本文作者對CeO2-NPs現(xiàn)有的相關(guān)研究進(jìn)行總結(jié)、概括和分析，對CeO2-NPs的抗菌和促成骨分化作用及其機(jī)制進(jìn)行了深入的探討。CeO2-NPs是一類具有潛在治療價值的抗氧化劑納米顆粒，其在骨組織工程領(lǐng)域及抗感染治療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。