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    免疫檢查點(diǎn)TIGIT慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建和穩(wěn)定表達(dá)TIGIT細(xì)胞系的建立

    2022-10-18 11:43:26穆業(yè)騰胡楠楠楊馥旭范宇鑫郭峰霖關(guān)新剛
    關(guān)鍵詞:檢查點(diǎn)單克隆細(xì)胞系

    穆業(yè)騰,郭 沖,胡楠楠,楊馥旭,薛 晗,范宇鑫,郭峰霖,關(guān)新剛,2

    (1.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院醫(yī)藥生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林 吉林 132013;2.臺州學(xué)院醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系,浙江 臺州 318000)

    免疫檢查點(diǎn)是一類在免疫細(xì)胞上表達(dá)的負(fù)性調(diào)控分子,免疫檢查點(diǎn)分子主要包括細(xì)胞毒性T淋巴細(xì) 胞 抗 原4(cytotoxic T lymphocyte antigen 4,CTLA4)、程序性死亡受體1(programmed cell death 1,PD-1)、信號調(diào)節(jié)蛋白α(signal regulatory protein-α,SIRPα)、T細(xì) 胞 免 疫 球 蛋 白3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3,TIM-3)、淋 巴 細(xì) 胞 激 活 基 因3(lymphocyte activation gene 3,LAG-3)和T細(xì)胞免疫球蛋白和免疫受體酪氨酸抑制基序結(jié)構(gòu)域(T cell immunoglobulin and immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif domain,TIGIT)等[1-7]。腫瘤細(xì)胞通過表達(dá)檢查點(diǎn)配體分子與免疫細(xì)胞上的檢查點(diǎn)結(jié)合,誘導(dǎo)T細(xì)胞功能失調(diào)或衰竭,從而逃避免疫系統(tǒng)的攻擊。研究者[8-9]在對含有免疫受體酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosin-based inhibitory motif,ITIM)的T細(xì)胞進(jìn)行基因組篩選時發(fā)現(xiàn)了TIGIT(也稱為Vsig9、Vstm3或WUCAM),其為CD28蛋白家族中的成員。TIGIT由1個胞外免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、1個Ⅰ型跨膜區(qū)和1個胞內(nèi)ITIM結(jié)構(gòu)域組成,主要在NK細(xì)胞和T細(xì)胞上表達(dá),尤其是在記憶T細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞和Treg細(xì)胞上表達(dá)[10-13]。在腫瘤微環(huán)境中,TIGIT在腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào),作為抑制性受體參與誘導(dǎo)免疫細(xì)胞衰竭,在抑制CD8+T淋巴細(xì)胞依賴的抗腫瘤反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[14-16]。

    TIGIT通過參與復(fù)雜的免疫調(diào)控在先天性免疫和適應(yīng)性免疫中發(fā)揮重要作用,目前報(bào)道的配體主要有CD155、CD112、CD113和nectin-4,其中對CD155的研究最為深入[17-18]。腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的CD155與TIGIT結(jié)合后,會抑制免疫細(xì)胞對腫瘤的殺傷作用[19]。TIGIT與共刺激受體CD226均可競爭性結(jié)合CD155,但其對CD155的親和力高于CD226[20]。研究[21-22]顯示:選擇性阻斷TIGIT/CD155信號軸正成為一種有前景的腫瘤免疫治療策略,利用單克隆抗體阻斷TIGIT可逆轉(zhuǎn)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)誘導(dǎo)的免疫細(xì)胞衰竭并抑制腫瘤生長。迄今 為 止, 已 有Ociperlimab、Tiragolumab、Domvanalimab、Vibostolimab、EOS-448和BMS-986207等多種TIGIT抗體進(jìn)入臨床Ⅱ/Ⅲ期實(shí)驗(yàn),其中由基因泰克公司開發(fā)的Tiragolumab于2021年1月獲得美國FDA授予的突破性療法認(rèn)定[23]。為深入研究TIGIT蛋白參與腫瘤免疫逃逸機(jī)理及以其為靶點(diǎn)的免疫治療藥物研發(fā),本研究通過構(gòu)建TIGIT-綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)慢病毒表達(dá)載體及建立穩(wěn)定表達(dá)TIGITGFP的細(xì)胞系,為后續(xù)研究以TIGIT為靶點(diǎn)的免疫治療奠定理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器人胚胎腎HEK293T細(xì)胞為北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院醫(yī)藥生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室凍存。胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料公司,培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司,pLenti-CmGFP質(zhì)粒和pCMV6-TIGIT質(zhì)粒購自美國Origene公司,EcoRⅠ和NotⅠ限制性內(nèi)切酶購自日本TaKaRa公司,T4 DNA連接酶購自美國NEB公司,質(zhì)粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒購自美國Axyprep公司,Lipofectamine 3 000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司,TIGIT抗體購自英國Abcam公司,辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)和顯色底物購自武漢愛博泰克生物科技有限公司。核酸電泳系統(tǒng)、蛋白電泳和轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)及凝膠成像系統(tǒng)均購自美國Bio-Rad公司,細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購自美國Denovix公司,可視熒光倒置顯微鏡購自美國Thermo Fisher公司,全自動多功能酶標(biāo)儀購自瑞士TECAN公司。

    1.2 TIGIT慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建取測序正確的pCMV6-TIGIT質(zhì)粒和表達(dá)載體pLenti-C-mGFP各2 μL加入至含限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ的酶切體系中,37℃酶切4 h,采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳對相關(guān)片段進(jìn)行分離并回收,洗脫出目的片段,加入T4 DNA連接酶25℃水浴連接1 h獲得重組質(zhì)粒pLenti-TIGIT-GFP,轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞,接種至含氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)基中,培養(yǎng)過夜。挑取單個菌落于LB管中,170 r·min-1搖床過夜,通過質(zhì)粒提取和雙酶切鑒定,將雙酶切成功的質(zhì)粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。

    1.3 篩選和建立TIGIT穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系將重組質(zhì)粒pLenti-TIGIT-GFP轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞,經(jīng)有限稀釋法篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)TIGIT-GFP的HEK293T細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染前1 d,將生長狀態(tài)良好的HEK293T細(xì)胞鋪于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔細(xì)胞約1.0×106個。第2天細(xì)胞匯合度至70%~90%時更換基礎(chǔ)培養(yǎng)基,并加入含Lipofectamine 3 000及TIGIT質(zhì)粒的Opti-MEM混合溶液,5 h后置于熒光顯微鏡下觀察,可見部分細(xì)胞有GFP表達(dá),繼續(xù)培養(yǎng)至48 h,觀察TIGIT-GFP表達(dá)及細(xì)胞膜定位情況。為獲取穩(wěn)定表達(dá)TIGIT-GFP的HEK293T細(xì)胞系,將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中加入嘌呤霉素(8 mg·L-1)篩選,采用有限稀釋法獲取均一表達(dá)的單克隆細(xì)胞。將初步篩選的細(xì)胞消化并通過細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)后制備密度為1×105mL-1的細(xì)胞懸液,8倍稀釋后接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。培養(yǎng)7~10 d后,選取陽性克隆孔再次克隆,重復(fù)2~3次,獲得穩(wěn)定表達(dá)TIGIT的單克隆穩(wěn)定細(xì)胞系。

    1.4 Western blotting法檢測細(xì)胞中TIGIT-GFP蛋白表達(dá)通過有限稀釋法獲取4個單克隆細(xì)胞,分別鋪至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,細(xì)胞密度達(dá)80%~90%時,將細(xì)胞置于冰上,PBS緩沖液洗滌2次,每孔加入200 μL RIPA裂解液裂解60 min,期間每隔10 min混勻1次,離心收集上清,BCA蛋白定量后,加入適量Loading Buffer 100℃水浴10 min。取20 μL蛋白上樣,經(jīng)12%SDS-PAGE凝膠分離,半干法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。采用封閉液(5 %脫脂奶粉)室 溫 封 閉2 h后,分 別 加 入β-actin一 抗(1∶2 000)和TIGIT一抗(1∶1 000),4℃搖床過夜。次日PVDF膜經(jīng)TBST洗脫3次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶2 000),室溫?fù)u床孵育2 h,再次洗脫3次,將顯影液覆蓋至PVDF膜上,采用凝膠成像系統(tǒng)顯影成像。由于TIGIT和GFP蛋白的相對分子質(zhì)量均為27 000,若在相對分子質(zhì)量54 000附近出現(xiàn)特異性條帶則提示TIGIT-GFP融合蛋白表達(dá)成功。

    2 結(jié) 果

    2.1 慢病毒表達(dá)載體pLenti-TIGIT-GFP構(gòu)建pCMV6-TIGIT質(zhì)粒雙酶切后可見長度約為726 bp的片段,pLenti-C-mGFP質(zhì)粒雙酶切后可見長度約為867 bp的片段(圖1)。將切膠回收的載體片段和目的片段連接形成重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞,挑菌過夜,提取質(zhì)粒后采用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切,瓊脂糖凝膠電泳可見2條清晰條帶,其中一條長度為7 800 bp與載體片段相符,另一條長度為726 bp與目的基因相符(圖2),表明可能構(gòu)建出重組質(zhì)粒pLenti-TIGIT-GFP。

    圖1 慢病毒表達(dá)載體pLenti-C-mGFP和TIGIT質(zhì)粒pCMV6-TIGIT雙酶切結(jié)果Fig.1 Double digestion results of lentiviral expression vector pLenti-C-mGFP and TIGIT plasmid pCMV6-TIGIT

    圖2 慢病毒表達(dá)載體pLenti-TIGIT-GFP雙酶切鑒定Fig.2 Double digestion identification of lentiviral expression vector pLenti-TIGIT-GFP

    2.2 慢病毒表達(dá)載體pLenti-TIGIT-GFP測序鑒定重組質(zhì)粒pLenti-TIGIT-GFP的DNA測序分析結(jié)果顯示:TIGIT基因成功插入到表達(dá)載體pLenti-C-mGFP中EcoRⅠ位點(diǎn)(GAATTC),提示重組質(zhì)粒pLenti-TIGIT-GFP構(gòu)建成功。見圖3。

    圖3 重組質(zhì)粒pLenti-TIGIT-GFP的DNA測序結(jié)果Fig.3 DNA sequencing results of recombinant plasmid pLenti-TIGIT-GFP

    2.3 熒光顯微鏡觀察TIGIT-GFP蛋白細(xì)胞定位構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中,48 h后熒光顯微鏡下可觀察到細(xì)胞上有GFP表達(dá),GFP主要分布在HEK293T細(xì)胞膜上(圖4),提示TIGIT-GFP在HEK293T細(xì)胞的細(xì)胞膜上成功表達(dá)。

    圖4 熒光顯微鏡觀察穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pLenti-TIGIT-GFP質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞中TIGIT-GFP的表達(dá)(Bar=20 μm)Fig.4 Expression of TIGIT-GFP in HEK293T cells stably transfected with pLenti-TIGIT-GFP observed by fluorescence microscope(Bar=20 μm)

    2.4 穩(wěn)定表達(dá)TIGIT-GFP細(xì)胞系建立由于外源基因整合到HEK293T細(xì)胞的效率不同,導(dǎo)致每個細(xì)胞TIGIT-GFP的表達(dá)量存在差異。篩選穩(wěn)定表達(dá)TIGIT-GFP的單克隆細(xì)胞后,觀察到單個孔中有細(xì)胞排列緊密、呈集落生長的單個克隆團(tuán)。經(jīng)過2次有限稀釋單克隆篩選后,共得到4個綠色熒光相對較亮的單克隆細(xì)胞。見圖5。

    圖5 TIGIT-GFP單克隆細(xì)胞的綠色熒光成像(Bar=100 μm)Fig.5 Green fluorescence images of TIGIT-GFP monoclonal cells(Bar=100 μm)

    2.5 HEK293T細(xì)胞中TIGIT-GFP蛋白表達(dá)情況Western blotting檢 測 結(jié) 果 顯 示:對 照 組HEK293T細(xì)胞中未見TIGIT-GFP蛋白表達(dá),實(shí)驗(yàn)組HEK293T細(xì)胞中TIGIT-GFP蛋白表達(dá)為陽性,表明經(jīng)轉(zhuǎn)染篩選后,TIGIT-GFP在HEK293T細(xì)胞中成功表達(dá)。見圖6。

    圖6 Western blotting法檢測2組HEK293T細(xì)胞中TIGIT-GFP蛋白表達(dá)電泳圖Fig.6 Electrophoregram of expression of TIGITGFP protein in HEK293 cells in two groups detected by Western blotting method

    3 討 論

    近年來,基于免疫檢查點(diǎn)抑制劑的腫瘤免疫療法取得了較大成功。腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中,腫瘤細(xì)胞通過表達(dá)檢查點(diǎn)的配體分子誘導(dǎo)免疫細(xì)胞沉默,逃避免疫系統(tǒng)的清除[24]。免疫檢查點(diǎn)抑制劑阻斷檢查點(diǎn)介導(dǎo)的抑制性信號通路,恢復(fù)衰竭T細(xì)胞功能,高效殺傷腫瘤細(xì)胞[25]。臨床數(shù)據(jù)[26]顯示:當(dāng)前免疫檢查點(diǎn)療法正面臨著諸多難題,有一部分患者并未從抗PD-1、程序性死亡受體-配體1(programmed cell death-ligand 1,PD-L1) 和CTLA4抗體中獲益,因此應(yīng)開發(fā)新的檢查點(diǎn)抑制劑用于改善癌癥患者免疫治療效果。

    TIGIT作為一種新近發(fā)現(xiàn)的免疫檢查點(diǎn)分子,在多種腫瘤中異常表達(dá),與腫瘤進(jìn)展和患者的預(yù)后密切相關(guān)[27-28]。TIGIT基因敲除小鼠實(shí)驗(yàn)[29]表明:體內(nèi)敲除TIGIT基因可引發(fā)比抗PD-1或抗CTLA4單克隆抗體更少的免疫相關(guān)不良事件(immune-related adverse events,irAEs)。鑒 于TIGIT單獨(dú)阻斷可觀的臨床效果,將其與多種免疫檢查點(diǎn)抑制劑[如PD-1、T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋 白3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3,TIM-3)和CTLA4等]聯(lián)合使用同時靶 向 腫 瘤 微 環(huán) 境 (tumor micro-environment,TME)中的多條免疫抑制通路,協(xié)同逆轉(zhuǎn)免疫沉默,實(shí)現(xiàn)腫瘤多靶點(diǎn)協(xié)同增效治療,從而達(dá)到改善癌癥免疫治療的目的[30-32]。

    綜上所述,本研究成功構(gòu)建TIGIT-GFP慢病毒表達(dá)載體并制備穩(wěn)定表達(dá)TIGIT-GFP的人胚胎腎HEK293T細(xì)胞系,為深入了解免疫檢查點(diǎn)TIGIT蛋白參與腫瘤免疫逃逸機(jī)理及以其為靶點(diǎn)的免疫治療研究奠定基礎(chǔ)。

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