免疫檢查點(diǎn)TIGIT慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建和穩(wěn)定表達(dá)TIGIT細(xì)胞系的建立

穆業(yè)騰,郭 沖,胡楠楠,楊馥旭,薛 晗,范宇鑫,郭峰霖,關(guān)新剛,2

（1.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院醫(yī)藥生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 吉林 132013；2.臺州學(xué)院醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系，浙江 臺州 318000）

免疫檢查點(diǎn)是一類在免疫細(xì)胞上表達(dá)的負(fù)性調(diào)控分子，免疫檢查點(diǎn)分子主要包括細(xì)胞毒性T淋巴細(xì) 胞 抗 原4（cytotoxic T lymphocyte antigen 4，CTLA4）、程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PD-1）、信號調(diào)節(jié)蛋白α（signal regulatory protein-α，SIRPα）、T細(xì) 胞 免 疫 球 蛋 白3（T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3，TIM-3）、淋 巴 細(xì) 胞 激 活 基 因3（lymphocyte activation gene 3，LAG-3）和T細(xì)胞免疫球蛋白和免疫受體酪氨酸抑制基序結(jié)構(gòu)域（T cell immunoglobulin and immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif domain，TIGIT）等［1-7］。腫瘤細(xì)胞通過表達(dá)檢查點(diǎn)配體分子與免疫細(xì)胞上的檢查點(diǎn)結(jié)合，誘導(dǎo)T細(xì)胞功能失調(diào)或衰竭，從而逃避免疫系統(tǒng)的攻擊。研究者［8-9］在對含有免疫受體酪氨酸抑制基序（immunoreceptor tyrosin-based inhibitory motif，ITIM）的T細(xì)胞進(jìn)行基因組篩選時發(fā)現(xiàn)了TIGIT（也稱為Vsig9、Vstm3或WUCAM），其為CD28蛋白家族中的成員。TIGIT由1個胞外免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、1個Ⅰ型跨膜區(qū)和1個胞內(nèi)ITIM結(jié)構(gòu)域組成，主要在NK細(xì)胞和T細(xì)胞上表達(dá)，尤其是在記憶T細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞和Treg細(xì)胞上表達(dá)［10-13］。在腫瘤微環(huán)境中，TIGIT在腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)，作為抑制性受體參與誘導(dǎo)免疫細(xì)胞衰竭，在抑制CD8+T淋巴細(xì)胞依賴的抗腫瘤反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［14-16］。

TIGIT通過參與復(fù)雜的免疫調(diào)控在先天性免疫和適應(yīng)性免疫中發(fā)揮重要作用，目前報(bào)道的配體主要有CD155、CD112、CD113和nectin-4，其中對CD155的研究最為深入［17-18］。腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的CD155與TIGIT結(jié)合后，會抑制免疫細(xì)胞對腫瘤的殺傷作用［19］。TIGIT與共刺激受體CD226均可競爭性結(jié)合CD155，但其對CD155的親和力高于CD226［20］。研究［21-22］顯示：選擇性阻斷TIGIT/CD155信號軸正成為一種有前景的腫瘤免疫治療策略，利用單克隆抗體阻斷TIGIT可逆轉(zhuǎn)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL）誘導(dǎo)的免疫細(xì)胞衰竭并抑制腫瘤生長。迄今 為 止， 已 有Ociperlimab、Tiragolumab、Domvanalimab、Vibostolimab、EOS-448和BMS-986207等多種TIGIT抗體進(jìn)入臨床Ⅱ/Ⅲ期實(shí)驗(yàn)，其中由基因泰克公司開發(fā)的Tiragolumab于2021年1月獲得美國FDA授予的突破性療法認(rèn)定［23］。為深入研究TIGIT蛋白參與腫瘤免疫逃逸機(jī)理及以其為靶點(diǎn)的免疫治療藥物研發(fā)，本研究通過構(gòu)建TIGIT-綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）慢病毒表達(dá)載體及建立穩(wěn)定表達(dá)TIGITGFP的細(xì)胞系，為后續(xù)研究以TIGIT為靶點(diǎn)的免疫治療奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器人胚胎腎HEK293T細(xì)胞為北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院醫(yī)藥生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室凍存。胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料公司，培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，pLenti-CmGFP質(zhì)粒和pCMV6-TIGIT質(zhì)粒購自美國Origene公司，EcoRⅠ和NotⅠ限制性內(nèi)切酶購自日本TaKaRa公司，T4 DNA連接酶購自美國NEB公司，質(zhì)粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒購自美國Axyprep公司，Lipofectamine 3 000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司，TIGIT抗體購自英國Abcam公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）和顯色底物購自武漢愛博泰克生物科技有限公司。核酸電泳系統(tǒng)、蛋白電泳和轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)及凝膠成像系統(tǒng)均購自美國Bio-Rad公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購自美國Denovix公司，可視熒光倒置顯微鏡購自美國Thermo Fisher公司，全自動多功能酶標(biāo)儀購自瑞士TECAN公司。

1.2 TIGIT慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建取測序正確的pCMV6-TIGIT質(zhì)粒和表達(dá)載體pLenti-C-mGFP各2 μL加入至含限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ的酶切體系中，37℃酶切4 h，采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳對相關(guān)片段進(jìn)行分離并回收，洗脫出目的片段，加入T4 DNA連接酶25℃水浴連接1 h獲得重組質(zhì)粒pLenti-TIGIT-GFP，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，接種至含氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜。挑取單個菌落于LB管中，170 r·min－1搖床過夜，通過質(zhì)粒提取和雙酶切鑒定，將雙酶切成功的質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

1.3 篩選和建立TIGIT穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系將重組質(zhì)粒pLenti-TIGIT-GFP轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞，經(jīng)有限稀釋法篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)TIGIT-GFP的HEK293T細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染前1 d，將生長狀態(tài)良好的HEK293T細(xì)胞鋪于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞約1.0×106個。第2天細(xì)胞匯合度至70%～90%時更換基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并加入含Lipofectamine 3 000及TIGIT質(zhì)粒的Opti-MEM混合溶液，5 h后置于熒光顯微鏡下觀察，可見部分細(xì)胞有GFP表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，觀察TIGIT-GFP表達(dá)及細(xì)胞膜定位情況。為獲取穩(wěn)定表達(dá)TIGIT-GFP的HEK293T細(xì)胞系，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中加入嘌呤霉素（8 mg·L－1）篩選，采用有限稀釋法獲取均一表達(dá)的單克隆細(xì)胞。將初步篩選的細(xì)胞消化并通過細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)后制備密度為1×105mL－1的細(xì)胞懸液，8倍稀釋后接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。培養(yǎng)7～10 d后，選取陽性克隆孔再次克隆，重復(fù)2～3次，獲得穩(wěn)定表達(dá)TIGIT的單克隆穩(wěn)定細(xì)胞系。

1.4 Western blotting法檢測細(xì)胞中TIGIT-GFP蛋白表達(dá)通過有限稀釋法獲取4個單克隆細(xì)胞，分別鋪至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度達(dá)80%～90%時，將細(xì)胞置于冰上，PBS緩沖液洗滌2次，每孔加入200 μL RIPA裂解液裂解60 min，期間每隔10 min混勻1次，離心收集上清，BCA蛋白定量后，加入適量Loading Buffer 100℃水浴10 min。取20 μL蛋白上樣，經(jīng)12%SDS-PAGE凝膠分離，半干法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。采用封閉液（5 %脫脂奶粉）室 溫 封 閉2 h后，分 別 加 入β-actin一 抗（1∶2 000）和TIGIT一抗（1∶1 000），4℃搖床過夜。次日PVDF膜經(jīng)TBST洗脫3次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶2 000），室溫?fù)u床孵育2 h，再次洗脫3次，將顯影液覆蓋至PVDF膜上，采用凝膠成像系統(tǒng)顯影成像。由于TIGIT和GFP蛋白的相對分子質(zhì)量均為27 000，若在相對分子質(zhì)量54 000附近出現(xiàn)特異性條帶則提示TIGIT-GFP融合蛋白表達(dá)成功。

2 結(jié) 果

2.1 慢病毒表達(dá)載體pLenti-TIGIT-GFP構(gòu)建pCMV6-TIGIT質(zhì)粒雙酶切后可見長度約為726 bp的片段，pLenti-C-mGFP質(zhì)粒雙酶切后可見長度約為867 bp的片段（圖1）。將切膠回收的載體片段和目的片段連接形成重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑菌過夜，提取質(zhì)粒后采用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳可見2條清晰條帶，其中一條長度為7 800 bp與載體片段相符，另一條長度為726 bp與目的基因相符（圖2），表明可能構(gòu)建出重組質(zhì)粒pLenti-TIGIT-GFP。

圖1 慢病毒表達(dá)載體pLenti-C-mGFP和TIGIT質(zhì)粒pCMV6-TIGIT雙酶切結(jié)果Fig.1 Double digestion results of lentiviral expression vector pLenti-C-mGFP and TIGIT plasmid pCMV6-TIGIT

圖2 慢病毒表達(dá)載體pLenti-TIGIT-GFP雙酶切鑒定Fig.2 Double digestion identification of lentiviral expression vector pLenti-TIGIT-GFP

2.2 慢病毒表達(dá)載體pLenti-TIGIT-GFP測序鑒定重組質(zhì)粒pLenti-TIGIT-GFP的DNA測序分析結(jié)果顯示：TIGIT基因成功插入到表達(dá)載體pLenti-C-mGFP中EcoRⅠ位點(diǎn)（GAATTC），提示重組質(zhì)粒pLenti-TIGIT-GFP構(gòu)建成功。見圖3。

圖3 重組質(zhì)粒pLenti-TIGIT-GFP的DNA測序結(jié)果Fig.3 DNA sequencing results of recombinant plasmid pLenti-TIGIT-GFP

2.3 熒光顯微鏡觀察TIGIT-GFP蛋白細(xì)胞定位構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中，48 h后熒光顯微鏡下可觀察到細(xì)胞上有GFP表達(dá)，GFP主要分布在HEK293T細(xì)胞膜上（圖4），提示TIGIT-GFP在HEK293T細(xì)胞的細(xì)胞膜上成功表達(dá)。

圖4 熒光顯微鏡觀察穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pLenti-TIGIT-GFP質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞中TIGIT-GFP的表達(dá)（Bar=20 μm）Fig.4 Expression of TIGIT-GFP in HEK293T cells stably transfected with pLenti-TIGIT-GFP observed by fluorescence microscope(Bar=20 μm)

2.4 穩(wěn)定表達(dá)TIGIT-GFP細(xì)胞系建立由于外源基因整合到HEK293T細(xì)胞的效率不同，導(dǎo)致每個細(xì)胞TIGIT-GFP的表達(dá)量存在差異。篩選穩(wěn)定表達(dá)TIGIT-GFP的單克隆細(xì)胞后，觀察到單個孔中有細(xì)胞排列緊密、呈集落生長的單個克隆團(tuán)。經(jīng)過2次有限稀釋單克隆篩選后，共得到4個綠色熒光相對較亮的單克隆細(xì)胞。見圖5。

圖5 TIGIT-GFP單克隆細(xì)胞的綠色熒光成像（Bar=100 μm）Fig.5 Green fluorescence images of TIGIT-GFP monoclonal cells（Bar=100 μm）

2.5 HEK293T細(xì)胞中TIGIT-GFP蛋白表達(dá)情況Western blotting檢 測 結(jié) 果 顯 示：對 照 組HEK293T細(xì)胞中未見TIGIT-GFP蛋白表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組HEK293T細(xì)胞中TIGIT-GFP蛋白表達(dá)為陽性，表明經(jīng)轉(zhuǎn)染篩選后，TIGIT-GFP在HEK293T細(xì)胞中成功表達(dá)。見圖6。

圖6 Western blotting法檢測2組HEK293T細(xì)胞中TIGIT-GFP蛋白表達(dá)電泳圖Fig.6 Electrophoregram of expression of TIGITGFP protein in HEK293 cells in two groups detected by Western blotting method

3 討 論

近年來，基于免疫檢查點(diǎn)抑制劑的腫瘤免疫療法取得了較大成功。腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，腫瘤細(xì)胞通過表達(dá)檢查點(diǎn)的配體分子誘導(dǎo)免疫細(xì)胞沉默，逃避免疫系統(tǒng)的清除［24］。免疫檢查點(diǎn)抑制劑阻斷檢查點(diǎn)介導(dǎo)的抑制性信號通路，恢復(fù)衰竭T細(xì)胞功能，高效殺傷腫瘤細(xì)胞［25］。臨床數(shù)據(jù)［26］顯示：當(dāng)前免疫檢查點(diǎn)療法正面臨著諸多難題，有一部分患者并未從抗PD-1、程序性死亡受體-配體1（programmed cell death-ligand 1，PD-L1） 和CTLA4抗體中獲益，因此應(yīng)開發(fā)新的檢查點(diǎn)抑制劑用于改善癌癥患者免疫治療效果。

TIGIT作為一種新近發(fā)現(xiàn)的免疫檢查點(diǎn)分子，在多種腫瘤中異常表達(dá)，與腫瘤進(jìn)展和患者的預(yù)后密切相關(guān)［27-28］。TIGIT基因敲除小鼠實(shí)驗(yàn)［29］表明：體內(nèi)敲除TIGIT基因可引發(fā)比抗PD-1或抗CTLA4單克隆抗體更少的免疫相關(guān)不良事件（immune-related adverse events，irAEs）。鑒 于TIGIT單獨(dú)阻斷可觀的臨床效果，將其與多種免疫檢查點(diǎn)抑制劑［如PD-1、T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋 白3（T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3，TIM-3）和CTLA4等］聯(lián)合使用同時靶 向 腫 瘤 微 環(huán) 境 （tumor micro-environment，TME）中的多條免疫抑制通路，協(xié)同逆轉(zhuǎn)免疫沉默，實(shí)現(xiàn)腫瘤多靶點(diǎn)協(xié)同增效治療，從而達(dá)到改善癌癥免疫治療的目的［30-32］。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建TIGIT-GFP慢病毒表達(dá)載體并制備穩(wěn)定表達(dá)TIGIT-GFP的人胚胎腎HEK293T細(xì)胞系，為深入了解免疫檢查點(diǎn)TIGIT蛋白參與腫瘤免疫逃逸機(jī)理及以其為靶點(diǎn)的免疫治療研究奠定基礎(chǔ)。