核酸試紙條快速檢測(cè)蠟樣芽胞桿菌entFM毒素基因方法的建立

賈慧建,李昊宇,王 丹,姜菲菲,趙瀟穎,董婧瑤,孫麗媛

（1.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院分子生物教研室，吉林 吉林 132013；2.山東省聊城市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東 聊城 252000；3.中國(guó)鐵路沈陽局集團(tuán)有限公司吉林疾病預(yù)防控制所，吉林 吉林 132001）

蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）是一種能形成芽胞的革蘭陽性需氧菌或兼性厭氧菌，其菌體細(xì)長(zhǎng)直或稍彎曲，末端呈方形，大小為（1.0～1.3）μm×（3.0～5.0）μm，可形成鏈狀。在甘露醇卵黃多黏菌素瓊脂培養(yǎng)基（mannitol egg yolk polymyxine agar，MYP）瓊脂平板上典型菌落為不發(fā)酵甘露醇的微粉紅色菌落，可產(chǎn)生卵磷脂酶，菌落周圍有白色至淡粉紅色沉淀環(huán)［1］。蠟樣芽胞桿菌是常見的食源性致病菌，根據(jù)其引起食物中毒的癥狀可分為致嘔吐型腸毒素和致腹瀉型腸毒素［2］。其中編碼相關(guān)毒素的毒力基因主要為腸毒素基因（entFM）、細(xì)胞毒素基因（cytK）、溶血性基因（hbl）、非溶血性基因（nhe）和嘔吐毒素基因（ces）［3］。

entFM現(xiàn)已被鑒定為一種細(xì)胞壁肽酶，并被重新命名為CwpFM［4］。盡管CwpFM對(duì)上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞均無直接細(xì)胞毒性，但其誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞空泡化，誘導(dǎo)蠟樣芽胞桿菌的毒力產(chǎn)生［5］。研究［6-8］顯示：entFM毒素基因攜帶率較高，在嬰幼兒奶粉和米粉中均有檢出，是導(dǎo)致嬰幼兒和抵抗力差人群感染的潛在致病因素。目前，蠟樣芽胞桿菌毒素的檢測(cè)方法主要包括質(zhì)譜法、免疫學(xué)法和分子生物學(xué)法［9］。針對(duì)entFM的檢測(cè)方法主要為分子生物學(xué)法，其他檢測(cè)方法鮮有報(bào)道。FORGHANI等［10］開發(fā)了一種高靈敏度的多重反轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）高分辨率熔解曲線檢測(cè)方法，用于同時(shí)檢測(cè)4種主要的毒素基因（cytK、entFM、hblD和nheA）和嘔吐毒素基因ces，但該方法需采用費(fèi)力、耗時(shí)和低分辨率的凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。核酸試紙條擺脫了凝膠電泳可視化觀察結(jié)果，本研究采用核酸試紙條的方法檢測(cè)entFM毒素相關(guān)合成基因，方法簡(jiǎn)單，可快速診斷蠟樣芽胞桿菌感染患者，并可應(yīng)用于食品安全、基層診斷和流行性病學(xué)調(diào)查等方面。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌、主要試劑和儀器ATCC11778蠟樣芽胞桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（廣東環(huán)凱微生物有限公司），大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和沙門氏菌等其他菌株均為北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院分子生物教研室保存菌種。100 bp DNA Marker和2×Taq PCR Master Mix［天根生化科技（北京）有限公司］，生物素化牛血清白蛋白（北京博爾西科技有限公司），鏈霉親和素（北京環(huán)球興達(dá)生物科技有限公司），兔抗FITC多克隆抗體［生工生物工程（上海）股份有限公司］，膠體金（上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司），牛血清白蛋白（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），試紙條快速診斷整合方案（上海杰一生物技術(shù)有限公司），其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。多功能梯度PCR儀TC9600-G（美國(guó)Labnet公司），通用型電泳儀JY300E（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司），紫外凝膠成像分析儀UV WHITE-2020D（美國(guó)BioRad公司），微量核酸蛋白測(cè)定儀NanoDrop One（美國(guó)Thermo公司）。

1.2 蠟樣芽胞桿菌DNA提取采用煮沸法提取蠟樣芽胞桿菌DNA，將待測(cè)菌株由培養(yǎng)基挑取2～3個(gè)菌落，加入至500 μL生理鹽水中研磨，金屬浴100℃煮沸10 min。12 000 r·min－1離心10 min，取EP管中上清液，分裝備用。

1.3 蠟樣芽胞桿菌entFM毒素基因PCR引物設(shè)計(jì)和產(chǎn)物鑒定GenBank數(shù)據(jù)庫中查找蠟樣芽胞桿菌entFM毒素的基因序列，利用NCBI-BLAST設(shè)計(jì)引 物：上 游 引 物5′-GTGGCAAAACAGGAACGACT-3′，下 游 引 物5′-CTCCACCGATTACAGCGTTG-3′。分別于5′端標(biāo)記異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）和生物素（Biotin），并由寶生物工程（大連）有限公司合成。

PCR反 應(yīng) 體 系：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，雙蒸水8 μL。

PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物檢測(cè)：6 μL PCR產(chǎn) 物1.5%瓊 脂 糖 凝 膠，85 V電泳85 min。紫外凝膠成像儀觀察檢測(cè)結(jié)果，entFM毒素基因于363 bp處出現(xiàn)目的條帶即為陽性結(jié)果。

entFM363毒素特異性基因片段克隆，克隆后的基因序列結(jié)果經(jīng)NCBI-Nucleotide BLAST分析，與GenBank數(shù)據(jù)庫中已登記的序列進(jìn)行比對(duì)驗(yàn)證，分析PCR產(chǎn)物。采用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物并測(cè)量回收DNA的濃度，pGM-T連接試劑盒將pGM-T載體和產(chǎn)物DNA連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，根據(jù)藍(lán)白斑篩選陽性菌克隆。LB液體培養(yǎng)基增菌后，質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒DNA，檢測(cè)質(zhì)粒DNA濃度，以質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，紫外凝膠成像儀觀察。分裝提取后的質(zhì)粒DNA，由生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序分析比對(duì)。采用微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)基因DNA濃度和吸光度（A）值，計(jì)算A（260）/A（280），每個(gè)樣品檢測(cè)3次，取平均值，以A（260）/A（280）比值代表DNA純度。

1.4 核酸試紙條設(shè)計(jì)原理［11］及鑒定采用核酸試紙條檢測(cè)樣品時(shí)，需將PCR產(chǎn)物和待測(cè)樣品分別添加至樣品墊，由于液體毛細(xì)作用向前流動(dòng)，當(dāng)有擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物一端標(biāo)記的生物素會(huì)先與膠體金修飾的鏈霉親和素結(jié)合，到達(dá)檢測(cè)線后擴(kuò)增產(chǎn)物另一端修飾的FITC與檢測(cè)線上標(biāo)記的兔抗FITC抗體結(jié)合，形成類似于酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）中的雙抗體夾心，從而使檢測(cè)線顯色。剩余的膠體金修飾鏈霉親和素與質(zhì)控線上的生物素化牛血清白蛋白結(jié)合，使質(zhì)控線顯色。當(dāng)無擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，檢測(cè)線膠體金修飾的鏈霉親和素?zé)o法與檢測(cè)線兔抗FITC抗體結(jié)合則不顯色，但可與質(zhì)控線生物素化牛血清白蛋白結(jié)合從而顯色。見圖1。

圖1 核酸試紙條原理Fig.1 Principle of nucleic acid test strip

分別將已標(biāo)記的PCR引物和未標(biāo)記的PCR引物混合反應(yīng)，驗(yàn)證核酸試紙條原理。實(shí)驗(yàn)分為以全標(biāo)記的引物組（全標(biāo)記組）、以上游引物5′端標(biāo)記的FITC和下游未標(biāo)記的引物組（FITC標(biāo)記組）、以上游未標(biāo)記的引物和5′端標(biāo)記生物素的下游引物組（生物素標(biāo)記組）和全部未標(biāo)記的引物組（未標(biāo)記組）。預(yù)期僅全標(biāo)記組顯色。

1.5 鏈霉親和素最佳標(biāo)記量和抗體工作濃度確定采用0.1 mmol·L－1碳酸鉀調(diào)整膠合金pH值為最適pH值7.0，并分別取100 μL膠體金置于EP管中。分別加入1 g·L－1待標(biāo)記的鏈霉親和素0、1、2、3、4、5和6 μL，搖晃混勻，室溫混合20 min后，各組分別加入10%生理鹽水，靜置2 h，觀察膠體金顏色變化，按照參考文獻(xiàn)［12］方法，采用膠體金標(biāo)記鏈霉親和素。

兔抗FITC抗體和生物素化牛血清白蛋白稀釋后分別劃于硝酸纖維素上，形成質(zhì)控線與檢測(cè)線，37℃烘干，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定2種抗體的工作濃度。

1.6 核酸試紙條檢測(cè)將裁剪后的PVC底板、標(biāo)記C和T線的硝酸纖維素膜、膠體金墊、吸水墊和樣品墊組裝。檢測(cè)樣品時(shí)將PCR產(chǎn)物6 μL和樣品展開液90 μL依次加入樣品墊后，10 min后觀察檢測(cè)結(jié)果。C、T線同時(shí)出現(xiàn)紅色條帶為陽性結(jié)果；C線出現(xiàn)紅色條帶，T線未出現(xiàn)紅色條帶為陰性結(jié)果；其他結(jié)果為無效結(jié)果。

1.7 核酸試紙條靈敏度試驗(yàn)將蠟樣芽胞桿菌DNA模板雙蒸水稀釋，制備10～10－5mg·L－1梯度混懸液。各組PCR體系含DNA模板（10～10－5mg·L－1）0.5 μL、PCR引物1 μL、2×Taq PCR Master Mix 10 μL和雙蒸水8 μL。進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳結(jié)果比對(duì)分析核酸試紙條靈敏度。

1.8 核酸試紙條特異性試驗(yàn)根據(jù)蠟樣芽胞桿菌的DNA提取方法分別提取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌和沙門氏菌DNA，并分別稀釋至10 mg·L－1。制備DNA混合液（含各菌種DNA各1 μL），徹底混勻后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析核酸試紙條特異性。

1.9 核酸試紙條穩(wěn)定性試驗(yàn)完成試紙條組裝后，配制檢測(cè)試劑并保存。分別于組裝后第6、9和12個(gè)月檢測(cè)核酸試紙條穩(wěn)定性，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳結(jié)果分析核酸試紙條穩(wěn)定性。

2 結(jié) 果

2.1 蠟樣芽胞桿菌entFM毒素基因PCR產(chǎn)物鑒定檢測(cè)提取的蠟樣芽胞桿菌DNA濃度為300 mg·L－1，DNA純度約為1.60。見表1。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示：電泳圖中1～2號(hào)泳道依次出現(xiàn)蠟樣芽胞桿菌大小目的條帶，且質(zhì)粒殼完好，條帶明顯，證明PCR產(chǎn)物DNA成功轉(zhuǎn)入質(zhì)粒，并成功提取質(zhì)粒DNA。見圖2?；驕y(cè)序結(jié)果顯示：蠟樣芽胞桿菌DNA序列分別與GenBank數(shù)據(jù)庫中已登記的蠟樣芽胞桿菌entFM毒素基因相似性為100%，表明克隆DNA片段即為目的基因片段，可作為陽性質(zhì)粒。見圖3。

圖3 entFM363目的基因序列分析結(jié)果Fig.3 Analysis results of sequence of target gene of entFM363

表1 蠟樣芽胞桿菌DNA濃度和純度Tab.1 Concentrations and purities of Bacillus cereus DNA(n=3，±s）

表1 蠟樣芽胞桿菌DNA濃度和純度Tab.1 Concentrations and purities of Bacillus cereus DNA(n=3，±s）

Sample 1 2 3 Concentration[ρB/（mg·L－1）]337.79±0.14 345.64±1.54 362.43±0.45 Purity 1.62±0.12 1.64±0.13 1.66±0.16

圖2 蠟樣芽胞桿菌entFM基因表達(dá)電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expression of entFM gene of Bacillus cereus

2.2 鏈霉親和素最佳標(biāo)記量和抗體工作濃度膠體金與鏈霉親和素的結(jié)合實(shí)質(zhì)上是靜電結(jié)合，高濃度鹽會(huì)使不穩(wěn)定的膠體金聚合沉淀變色。N管添加了高濃度的鹽作為對(duì)比，檢測(cè)結(jié)果顯示：1 g·L－1鏈霉親和素的最佳標(biāo)記量為3 μg，為介于紫色和粉紅色的過渡色。但實(shí)際標(biāo)記量要增加10%，即3.3 μg。

兔抗FITC抗體濃度為1.8 g·L－1和生物素化牛血清白蛋白濃度為1 g·L－1時(shí)，硝酸纖維素膜上檢測(cè)線和質(zhì)控線均可產(chǎn)生較為清晰的條帶。

2.3 核酸試紙條檢測(cè)核酸試紙條檢測(cè)時(shí)僅PCR產(chǎn)物兩端形成FITC-生物素結(jié)合物時(shí)才會(huì)發(fā)生顯色反應(yīng)。各組引物PCR產(chǎn)物核酸試紙條結(jié)果顯示：僅有全標(biāo)記組核酸試紙條顯色，表明核酸試紙條設(shè)計(jì)原理驗(yàn)證成功。見圖4。

圖4 核酸試紙條設(shè)計(jì)原理檢測(cè)Fig.4 Detection design principle of nucleic acid test strips

2.4 核酸試紙條靈敏度電泳結(jié)果顯示：DNA模板濃度同時(shí)稀釋至10－1mg·L－1時(shí)，仍可觀察到目的條 帶，最 低 檢 測(cè) 濃 度 為10－1mg·L－1。稀 釋 至10－3mg·L－1可見檢測(cè)線和質(zhì)控線同時(shí)出現(xiàn)2條清晰可見的紅色條帶，為陽性結(jié)果，核酸試紙條的最低檢測(cè)濃度為10－3mg·L－1，表明本研究核酸試紙條結(jié)果較普通PCR靈敏性高100倍。見圖5和6。

圖5 核酸試紙條靈敏度檢測(cè)電泳圖Fig.5 Electrophoregram of sensitivities of nucleic acid test strips

2.5 核酸試紙條特異性PCR電泳結(jié)果顯示：僅蠟樣芽胞桿菌出現(xiàn)了目的條帶，金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、沙門氏菌和空白對(duì)照無目的條帶出現(xiàn)，為陰性結(jié)果。核酸試紙條的特異性檢測(cè)結(jié)果顯示：僅蠟樣芽胞桿菌的檢測(cè)線和質(zhì)控線均出現(xiàn)紅色條帶，為陽性結(jié)果。金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、沙門氏菌和空白對(duì)照的核酸試紙條中，僅在質(zhì)控線（C線）出現(xiàn)紅色條帶，在檢測(cè)線（T線）無紅色條帶，為陰性結(jié)果。PCR電泳結(jié)果與核酸試紙條結(jié)果一致。見圖7和8。

圖7 核酸試紙條特異性檢測(cè)電泳圖Fig.7 Electrophoregram of specificities of nucleic acid test strips

圖6 核酸試紙條靈敏度Fig.6 Sensitivities of nucleic acid test strips

2.6 核酸試紙條穩(wěn)定性組裝后核酸試紙條穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果顯示：在第6、9和12個(gè)月進(jìn)行核酸試紙條穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果一致，僅蠟樣芽胞桿菌的菌株出現(xiàn)陽性結(jié)果，即質(zhì)控線（C線）和檢測(cè)線（T線）2條紅色條帶；空白對(duì)照為陰性結(jié)果，即只出現(xiàn)質(zhì)控線（C線）1條紅色條帶。見圖9。

圖9 核酸試紙條穩(wěn)定性Fig.9 Stabilities of nucleic acid test strips

3 討 論

目前蠟樣芽胞桿菌的檢測(cè)方法主要為培養(yǎng)法，其可靠性較高，且相對(duì)簡(jiǎn)單、設(shè)備要求低，是多種微生物檢驗(yàn)的金標(biāo)準(zhǔn)。盡管細(xì)菌培養(yǎng)分離鑒定法應(yīng)用十分廣泛，但也存在檢測(cè)過程繁瑣和耗時(shí)較長(zhǎng)等不足，同時(shí)無法檢測(cè)毒素的存在。戚衍博等［13］利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)腹腔注射檢測(cè)產(chǎn)嘔吐毒素較為直觀，但具有半定性且不夠準(zhǔn)確，費(fèi)用較高；TSILIA等［14］采用質(zhì)譜方法直接檢測(cè)毒素蛋白，并使用特征m/z光譜位置來鑒定不同蠟樣芽胞桿菌培養(yǎng)上清液中CytK1和NHe蛋白，但該方法需要依靠尖端設(shè)備、較高的投資和維護(hù)［15-17］。

圖8 核酸試紙條特異性Fig.8 Specificities of nucleic acid test strips

核酸試紙條因其特異性強(qiáng)、靈敏度高、可視化和更適合檢測(cè)人員現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的特點(diǎn)得到廣泛應(yīng)用。張力支等［18］基于納米金核酸探針的新型核酸試紙條對(duì)燦爛弧菌快速檢測(cè)，該試紙條與5種常見水產(chǎn)病原菌不發(fā)生陽性反應(yīng)，特異性強(qiáng)；王之瑩等［19］利用側(cè)流核酸試紙條快速檢測(cè)非洲豬瘟病毒，應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)，靈敏度可達(dá)103copies·μL－1，靈敏度高；QIN等［20］基于側(cè)流條帶平臺(tái)可在2 h內(nèi)快速、方便地對(duì)鴨肉摻假牛肉進(jìn)行可視化鑒別，適合資源有限的環(huán)境和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中的應(yīng)用。核酸檢測(cè)試紙條應(yīng)用到蠟樣芽胞桿菌毒素基因檢測(cè)，能夠?yàn)闄z查人員的現(xiàn)場(chǎng)診斷提供更準(zhǔn)確便捷的檢測(cè)手段。

entFM是一種主要的蠟樣雙歧桿菌毒素，參與細(xì)菌分裂、真核細(xì)胞的黏附及促進(jìn)其毒力作用，在從不同食物基質(zhì)分離的蠟樣芽胞桿菌中廣泛分布，檢出率為68%～98%，與食源性疾病相關(guān)的菌株中均可檢測(cè)到［21-25］。本研究以蠟樣芽胞桿菌特異性毒素基因?yàn)檠芯繉?duì)象，以基因?yàn)榘袠?biāo)構(gòu)建核酸試紙條方法檢測(cè)蠟樣芽胞桿菌毒素基因，煮沸法提取其基因組DNA，通過克隆完成PCR產(chǎn)物的鑒定并可作為陽性對(duì)照。本研究結(jié)果顯示：組裝后的核酸試紙條與金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌和沙門氏菌均不發(fā)生反應(yīng)，特異性強(qiáng)，其最低檢測(cè)濃度為10－3mg·L－1，比普通PCR靈敏度高100倍，且于第6、9和12個(gè)月檢測(cè)穩(wěn)定性結(jié)果一致，穩(wěn)定性強(qiáng)。檢測(cè)時(shí)只需在核酸試紙條的樣品墊上滴加6 μL的PCR產(chǎn)物與90 μL樣品展開液，10 min觀察結(jié)果，即可實(shí)現(xiàn)entFM毒素基因核酸可視化和特異性檢測(cè)。隨著等溫?cái)U(kuò)增PCR技術(shù)的興起，將其與核酸試紙條相結(jié)合，為未來快速檢測(cè)蠟樣芽胞桿菌提供新的方向。